第十一章 经典液相色谱法2013
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《液相色谱分析法》课件
液相色谱分析法
,
汇报人：
目录
01 添 加 目 录 项 标 题 03 液 相 色 谱 分 析 法 的
技术原理
05 液 相 色 谱 分 析 法 的 优缺点
02 液 相 色 谱 分 析 法 的 概述
04 液 相 色 谱 分 析 法 的 应用实例
06
液相色谱分析法的 发展趋势和未来展
望
Part One
单击添加章节标题
数据处理：对检测到的信号 进行处理，得到样品的色谱 图和定量结果
结果分析：根据色谱图和定 量结果，对样品进行分析和 鉴定
Part Four
液相色谱分析法的 应用实例
在药物分析中的应用
药物稳定性研究：研究药物 在储存过程中的稳定性
药物成分分析：分析药物中 的有效成分、杂质等
药物质量控制：控制药物的 质量，确保药物的安全性和
液相色谱分析法的研究热点和前沿技术
超高效液相色谱技术：提高分离效率，降 低检测限
生物样品分析：应用于生物医药、食品安 全等领域
质谱联用技术：提高检测灵敏度和准确性
环境样品分析：应用于环境监测、污染治 理等领域
微流控芯片技术：实现样品的微型化和快 速分析
智能化、自动化技术：提高分析效率，降 低人工操作误差
添加标题
核磁共振检测器：利用核磁共振原理，检测样品中的核磁共振信号，用于结构分析和定量分析
液相色谱分析法的操作流程
样品制备：将样品进行适当 的处理，如稀释、过滤等
样品注入：将样品注入到色 谱柱中
色谱分离：样品在色谱柱 中分离，根据不同组分的 性质和亲和力进行分离
检测器检测：样品经过检 测器时，检测器对样品进 行检测，得到相应的信号பைடு நூலகம்
,
汇报人：
目录
01 添 加 目 录 项 标 题 03 液 相 色 谱 分 析 法 的
技术原理
05 液 相 色 谱 分 析 法 的 优缺点
02 液 相 色 谱 分 析 法 的 概述
04 液 相 色 谱 分 析 法 的 应用实例
06
液相色谱分析法的 发展趋势和未来展
望
Part One
单击添加章节标题
数据处理：对检测到的信号 进行处理，得到样品的色谱 图和定量结果
结果分析：根据色谱图和定 量结果，对样品进行分析和 鉴定
Part Four
液相色谱分析法的 应用实例
在药物分析中的应用
药物稳定性研究：研究药物 在储存过程中的稳定性
药物成分分析：分析药物中 的有效成分、杂质等
药物质量控制：控制药物的 质量，确保药物的安全性和
液相色谱分析法的研究热点和前沿技术
超高效液相色谱技术：提高分离效率，降 低检测限
生物样品分析：应用于生物医药、食品安 全等领域
质谱联用技术：提高检测灵敏度和准确性
环境样品分析：应用于环境监测、污染治 理等领域
微流控芯片技术：实现样品的微型化和快 速分析
智能化、自动化技术：提高分析效率，降 低人工操作误差
添加标题
核磁共振检测器：利用核磁共振原理，检测样品中的核磁共振信号，用于结构分析和定量分析
液相色谱分析法的操作流程
样品制备：将样品进行适当 的处理，如稀释、过滤等
样品注入：将样品注入到色 谱柱中
色谱分离：样品在色谱柱 中分离，根据不同组分的 性质和亲和力进行分离
检测器检测：样品经过检 测器时，检测器对样品进 行检测，得到相应的信号பைடு நூலகம்
经典液相色谱法
4.洗脱顺序
色谱柱一定，Ka大，即极性越强的组分吸附力越强→→→
柱色谱：tR越长→洗脱慢；反之Ka小，极性越弱组分先被洗脱。 平面色谱：Rf越小→展开慢；反之Ka小，极性越弱组分展开快。
❖ 附：常见化合物极性
❖ ①见登山图1
❖
②双键↑，吸附力↑
羧酸 酚
❖
③分子内氢键，吸附力↓
醇 酰胺
胺类
酮 酯 二甲胺
1. 被测组分性质（极性大小）： 烃＜ - - - - - - - - ＜羧酸
2. 吸附剂的活性： 吸附剂的活性↑大，对组分的吸附能力↑强，K ↑大 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂
3. 流动相的极性： 流动相极性↑大，对组分的展开能力↑大 , K ↑小 “相似相溶”原则 ：根据组分性质、吸附剂的活性， 选择适当极性的流动相
✓ 分离对象：大分子量（＞2000）的化合物 有机聚合物（如 聚烯烃、聚苯乙烯和聚酰胺等） 生物大分子（如蛋白质、核酸、低聚糖、肽类等）
局限： ✓ 不能分离大小相近的化合物 ✓ 为得到良好的分离，组分的分子量应相差10%以上。
应用
✓ Kp∝尺寸∝相对分子质量——
可应用于高分子分子量的测定
➢ 结论：
分 类：
平面色谱
薄层色谱 (TLC) 纸色谱 （PC）
吸附薄层色谱 分配薄层色谱 分子排阻薄层色谱
薄层电泳法
一、平面色谱参数
（一）定性参数
1、比移值（Rf）
Rf 原点 原到 点组 到分 溶斑 剂点 前 心质 沿 的量 的 距中 距 离 LL0离
Rf=0: 组分在原点，完全被固定相保留
L
0
Rf=1: 组分在前沿，完全不被固定相保留
适用：分析酸性或中性物质 ，如有机酸、氨基酸、甾体等 选择性保留碱性物质,如胺类
色谱柱一定，Ka大，即极性越强的组分吸附力越强→→→
柱色谱：tR越长→洗脱慢；反之Ka小，极性越弱组分先被洗脱。 平面色谱：Rf越小→展开慢；反之Ka小，极性越弱组分展开快。
❖ 附：常见化合物极性
❖ ①见登山图1
❖
②双键↑，吸附力↑
羧酸 酚
❖
③分子内氢键，吸附力↓
醇 酰胺
胺类
酮 酯 二甲胺
1. 被测组分性质（极性大小）： 烃＜ - - - - - - - - ＜羧酸
2. 吸附剂的活性： 吸附剂的活性↑大，对组分的吸附能力↑强，K ↑大 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂
3. 流动相的极性： 流动相极性↑大，对组分的展开能力↑大 , K ↑小 “相似相溶”原则 ：根据组分性质、吸附剂的活性， 选择适当极性的流动相
✓ 分离对象：大分子量（＞2000）的化合物 有机聚合物（如 聚烯烃、聚苯乙烯和聚酰胺等） 生物大分子（如蛋白质、核酸、低聚糖、肽类等）
局限： ✓ 不能分离大小相近的化合物 ✓ 为得到良好的分离，组分的分子量应相差10%以上。
应用
✓ Kp∝尺寸∝相对分子质量——
可应用于高分子分子量的测定
➢ 结论：
分 类：
平面色谱
薄层色谱 (TLC) 纸色谱 （PC）
吸附薄层色谱 分配薄层色谱 分子排阻薄层色谱
薄层电泳法
一、平面色谱参数
（一）定性参数
1、比移值（Rf）
Rf 原点 原到 点组 到分 溶斑 剂点 前 心质 沿 的量 的 距中 距 离 LL0离
Rf=0: 组分在原点，完全被固定相保留
L
0
Rf=1: 组分在前沿，完全不被固定相保留
适用：分析酸性或中性物质 ，如有机酸、氨基酸、甾体等 选择性保留碱性物质,如胺类
第10章经典液相色谱法
的种类、数目与位置的不同，形成氢键的能力不同，而
实现分离。
对位间位取代基均能形成氢键的,吸附力增大。邻位
基团间能形成分子内氢键的,吸附力减小。芳香核具有较
多共轭键时,吸附力增大。
2021/8/14
12
（4）大孔吸附树脂 大孔吸附树脂是一种不含交换
基团，具有大孔网状结构的高分子吸附剂。粒度多
为20-60目。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶
夺吸附剂表面活性中心的过程
，即为竞争吸附过程 （图10-1
）。
图10-1 吸附色谱示意图
吸
附
m.流动相
a.吸附剂 Xm.流
+
+
X
n
Y
X
n
Y
m
a
a
m
解
吸
附动相中溶质分子 Ym.流动相分
子 Xa.被吸附的溶质分子
2021/8/14
4
n
[Xa][Ym]
吸附平衡常数: Ka =
[Xm][Ya] n
由于流动相分子是大量的,所以[Ym]/ [Ya ]可视为常数。
Cs与其在流动相中的浓度Cm 成正比(Cs=KCm)，直线的
斜率为K。
线型吸附等温线是理想的等温线，同一种溶质的平衡常
数K与溶液的浓度无关，即K为一常数。组分流出速度不受
浓度的影响，故在洗脱或展开时，同一溶质分子在柱内具
有相同的迁移速率，能得到左右对称的流出曲线。如图102A所示。
2021/8/14
∴
R
X
/S
X
C
a
a
a
K
s
X
X
/V
m
实现分离。
对位间位取代基均能形成氢键的,吸附力增大。邻位
基团间能形成分子内氢键的,吸附力减小。芳香核具有较
多共轭键时,吸附力增大。
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（4）大孔吸附树脂 大孔吸附树脂是一种不含交换
基团，具有大孔网状结构的高分子吸附剂。粒度多
为20-60目。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶
夺吸附剂表面活性中心的过程
，即为竞争吸附过程 （图10-1
）。
图10-1 吸附色谱示意图
吸
附
m.流动相
a.吸附剂 Xm.流
+
+
X
n
Y
X
n
Y
m
a
a
m
解
吸
附动相中溶质分子 Ym.流动相分
子 Xa.被吸附的溶质分子
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4
n
[Xa][Ym]
吸附平衡常数: Ka =
[Xm][Ya] n
由于流动相分子是大量的,所以[Ym]/ [Ya ]可视为常数。
Cs与其在流动相中的浓度Cm 成正比(Cs=KCm)，直线的
斜率为K。
线型吸附等温线是理想的等温线，同一种溶质的平衡常
数K与溶液的浓度无关，即K为一常数。组分流出速度不受
浓度的影响，故在洗脱或展开时，同一溶质分子在柱内具
有相同的迁移速率，能得到左右对称的流出曲线。如图102A所示。
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∴
R
X
/S
X
C
a
a
a
K
s
X
X
/V
m
经典液相色谱(本科)
第一节 概述一、定义 液相色谱：以液体为流动相的色谱法经典液相色谱法经典液相色谱法是以重力或毛细作用输送流动相的色谱方 法。
包括： 柱色谱法 薄层色谱法 平面色谱法 纸色谱法1 2二、经典液相色谱的主要用途 经典液相柱色谱法：分离混合物 平面色谱法：定性分析 定量分析 为柱色谱的条件选择提供依据三、经典液相色谱和现代液相色谱的比较： 经典液相色谱： 固定相颗粒较大且不均匀 常压下输送流动相 柱效较低 分析周期长 现代液相色谱： 固定相颗粒小且均匀 高压下输送流动相 柱效较高 分析周期短34第二节 柱色谱法 吸附柱色谱法 柱 色 谱 法分离机制一、液-固吸附柱色谱法(一)分离原理 利用被测组分对固定相表面吸附中心的吸附能力差别实现分离 1 吸附与解吸附 物理吸附：范德华力，无选择性 吸附作用 化学吸附：可形成氢键，选择性分配柱色谱法 离子交换柱色谱法 空间排阻柱色谱法解吸附 溶质从吸附剂表面溶解到流动相中的现象562、吸附平衡：（二）固定相 1、对固定相的要求： (1)较大的吸附表面（多孔）K = Cs/Cm （K又称为吸附系数）讨论： (1)、K 值越大，越容易被吸附， 保留时间越长。
(2)、K 值取决于比表面积：每克吸附剂的总表面积 Al2O3: 100-300 m2/g; 硅胶：300-1000 m2/g吸附色谱 三要素粒度：以目数或颗粒直径表示 100目-0.147mm 200目-0.074mm72、固定相种类 (2)一定的吸附能力； (3)颗粒均匀； (4)化学惰性，不与样品或流动相发生反应； (5)有一定的机械强度。
极 性：硅胶、氧化铝 无机吸附剂 非极性：活性炭有机吸附剂：聚酰胺、大孔树脂、淀粉、纤维素、蔗糖等 常用的固定相：硅胶、氧化铝、聚酰胺、大孔吸附树脂9103、硅胶O H S i OH O H O S i O HH O H H O S i O O O S i O O H H O S i O S i O O H O S i HH H O O S i（3） 影响活性的因素 含水量：吸附能力随含水量增加而降低，大量吸水后失活 105-110℃，30min烘干活化（可逆失水） >500 ℃烘干，失活（不可逆失水）OH OH Si O Si O O SiH O S iO H（1）结构： 内部：Si-O-Si交联结构—多孔结构 表面：Si-OH 可与极性化合物形成氢键，为活性基团 （2）可分离的物质： Si-OH易电离，弱酸性,pH=5，适于酸性和中性物质的分离Si比表面积：11124、氧化铝(1)吸附活性：吸附能力强于硅胶 (2)制备方法： 氧化铝由明矾和氢氧化钠（碳酸钠）制成 碱性氧化铝（pH9.5±0.5） 通常残留碱性物质而成为碱性 中性氧化铝（pH7±0.5） 将碱性氧化铝用0.5mol/L盐酸浸泡，时时搅动，静置24小时，用水洗至 中性（无氯离子），干燥。
《仪器分析》复习题
2016级成人高等教育中医学院本科班《仪器分析》作业班级: 姓名: 学号:第一章绪论1.仪器分析的特点。
2.仪器分析方法的类型。
3.学习仪器分析的方法。
第二章光谱分析法概论一、名词解释电磁辐射电磁波谱原子吸收光谱光谱法二、简答题1.简述光学分析法的三个过程。
2.光的波粒二相性基本参数3.光谱区中紫外、可见、红外对应的波长范围？4.光谱法的仪器由哪几部分组成？它们的作用是什么？三、计算题1.计算(1) 2500cm-1波数的波长（nm)(2) Na 588-995nm相应的能量（eV)(3) 670. 7nm Li线的频率（Hz)2.计算下列各种跃迁所需的能量范围（eV)及相应的波长范围(1)原子内层电子跃迁(2)原子外层电子跃迁(3)分子的电子跃迁(4)分子振动能级跃迁(5)分子转动能级跃迁3.阐述为什么原子光谱为线光谱，分子光谱为带光谱。
如果说原子光谱谱线强度分布也是峰状的，对吗？为什么？第三章紫外-可见分光光度法1.名词解释透光率吸光系数（摩尔吸光系数、百分吸光系数）发色团和助色团吸收曲线标准曲线末端吸收试剂空白2.物质对光的吸收程度可用哪几种符号表示，各代表什么含义？3.什么是朗伯-比尔定律？其物理意义是什么？4.简述导致偏离朗伯-比尔定律的原因。
5.什么是吸收曲线？制作吸收曲线的目的是什么？6.在分光光度法中，为什么要控制溶液的透光率读数范围在20%〜65%之间？若T超出上述范围，应采取何种措施？7.简述紫外-可见分光光度计的主要部件及基本功能。
8.每100mL中含有0.701mg溶质的溶液，在1cm吸收池中测得的透光率为40.0%，试计算：(1)此溶液的吸光度。
(2)如果此溶液的浓度为0.420mg/100mL,其吸光度和百分透光率各是多少？第四章红外分光光度法1.分子吸收红外光发生能级跃迁，必须满足的条件是什么？2.何为红外非活性振动？3.下列化合物能否用红外吸收光谱区别，为什么？—ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３—ＣＯＯＣ2Ｈ54.由茵陈篙分离出来的精油，其分子式为C12H10，UV EtO Hλ239nm(ε537)，max253nm(ε340)，红外光谱见课本P81，是解析其结构。
第十一章色谱分析法概论
4．显色
(1) 紫外灯照射法
(2) 碘蒸气法：
(3) 碳化法：
(4) 专属显色剂显色法：
5．Rf值的计算
仪器和试剂
载玻片，烘箱，烧杯，点样毛细管，层析缸，铅笔 硅胶G，1%偶氮苯对照品溶液，0.01%对-二甲氨基偶 氮苯对照品溶液，偶氮苯和对-二甲氨基偶氮苯样品溶 液 展开剂（四氯化碳：氯仿=7：3）
（二）分配色谱法
利用被分离的各个组分在互不相溶 的固定相与流动相中的溶解度不同 而使试样组分在两相间不断产生分 配平衡。
分配系数
Cs X s Vs K Cm X m Vm
Vs为固定相的体积 Vm为流动相的体积
C s为溶质分子在固定相中 的浓度 Cm为溶质分子在流动相中 的浓度
注：K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质 以及柱温有关
（一）基本原理
将固定相（吸附剂）均匀地涂抹在光洁表面上， 将待测试样点在一端的起始线上，再把点样后 的薄层板放进密闭容器中，使薄层板的底端浸 入适当的溶剂进行展开。 借助薄层板上吸附剂的毛细管作用，溶剂会载 带分离组分向前移动展开，因各组分吸附能力 不同，所以组分移动速率不同，一定时间后各 组分彼此分离，在板上形成不同距离的斑点
• 与固定相作用差异 • 随流动相移动的速度不等 • • 差速迁移 色谱分离
色谱过程
实现色谱操作的基本条件是必须具备相
对运动的两相，固定相(stationary phase)
和流动相(mobile phase)。
色谱过程是组分的分子在流动相和固定
相间多次“分配”的过程。
第一节
色谱法发展与分类
一、什么是色谱法 色谱分析法简称色谱法 (chromatography) ，是一种物理 或物理化学分离分析方法。 1906年，植物色素分离，色带
经典液相色谱法
依据规律：
（1）基本母核相同—基能力越强
共轭双键越多，吸附能力也越强 （3）基团的空间排列—能形成分子内氢键吸附能力较弱
16
液相色谱的固定相和流动相
2. 吸附剂的选择 分离极性小的物质，选用吸附能力强的吸附剂 分离极性大的物质，选用吸附能力弱的吸附剂
常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱方法
经典柱色谱法 平面色谱法
现代液相色谱法
高压输液泵输送流动相
高效液相色谱法（HPLC）
4
液相色谱的固定相和流动相 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 空间排阻色谱
5
液相色谱的固定相和流动相 吸附色谱
溶质基于吸附现象而获得分离的液-固色谱分析方法 分离分析极性至弱极性的化合物
固定相——吸附剂 流动相——有机溶剂
6
液相色谱的固定相和流动相
吸附色谱的固定相 1.对吸附剂的要求 1）有较大表面积和足够的吸附能力，对不同物
质吸附能力不同 2）与洗脱剂、溶剂、样品不起化学反应，且不
溶于洗脱剂和溶剂 3）粒度细而均匀
7
液相色谱的固定相和流动相
2. 常用吸附剂 -有机类：
活性炭、淀粉、蔗糖等、聚酰胺、大孔树脂 -无机类：
亲水性凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
亲脂性凝胶 葡聚糖凝胶LH-20 聚苯乙烯凝胶
28
经典液相柱色谱法
硅胶吸附柱色谱 聚酰胺柱色谱法 离子交换柱色谱法 凝胶柱色谱法
平面色谱法
借用毛细作用的原理输送展开剂（流动相），色 谱过程在平面上进行的方法。 固定相成平面状态，试样溶液点于平面一端，在 相对密闭的容器中展开（分离）后，根据组分在 平面上移动的距离和浓度进行分析。 常用有薄层色谱法和纸色谱法
吸附色谱的条件选择 组分在色谱柱中的移动速度和分离效果取决于： 1. 吸附剂对样品各组分的吸附能力-吸附活性 2. 洗脱剂对各组分的解吸能力-极性大小 3. 待分离各组分本身极性差异-结构性质
（1）基本母核相同—基能力越强
共轭双键越多，吸附能力也越强 （3）基团的空间排列—能形成分子内氢键吸附能力较弱
16
液相色谱的固定相和流动相
2. 吸附剂的选择 分离极性小的物质，选用吸附能力强的吸附剂 分离极性大的物质，选用吸附能力弱的吸附剂
常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱方法
经典柱色谱法 平面色谱法
现代液相色谱法
高压输液泵输送流动相
高效液相色谱法（HPLC）
4
液相色谱的固定相和流动相 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 空间排阻色谱
5
液相色谱的固定相和流动相 吸附色谱
溶质基于吸附现象而获得分离的液-固色谱分析方法 分离分析极性至弱极性的化合物
固定相——吸附剂 流动相——有机溶剂
6
液相色谱的固定相和流动相
吸附色谱的固定相 1.对吸附剂的要求 1）有较大表面积和足够的吸附能力，对不同物
质吸附能力不同 2）与洗脱剂、溶剂、样品不起化学反应，且不
溶于洗脱剂和溶剂 3）粒度细而均匀
7
液相色谱的固定相和流动相
2. 常用吸附剂 -有机类：
活性炭、淀粉、蔗糖等、聚酰胺、大孔树脂 -无机类：
亲水性凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
亲脂性凝胶 葡聚糖凝胶LH-20 聚苯乙烯凝胶
28
经典液相柱色谱法
硅胶吸附柱色谱 聚酰胺柱色谱法 离子交换柱色谱法 凝胶柱色谱法
平面色谱法
借用毛细作用的原理输送展开剂（流动相），色 谱过程在平面上进行的方法。 固定相成平面状态，试样溶液点于平面一端，在 相对密闭的容器中展开（分离）后，根据组分在 平面上移动的距离和浓度进行分析。 常用有薄层色谱法和纸色谱法
吸附色谱的条件选择 组分在色谱柱中的移动速度和分离效果取决于： 1. 吸附剂对样品各组分的吸附能力-吸附活性 2. 洗脱剂对各组分的解吸能力-极性大小 3. 待分离各组分本身极性差异-结构性质
经典液相色谱法
O CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 C N H n
10
酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中 的羟基或羧基形成氢键；酰胺基中的氨基与醌 类、硝基类中的醌基、硝基形成氢键而产生吸 附作用。 （4）大孔吸附树脂 一种不含交换基团，具有大孔 网状结构的高分子吸附剂。理化 性质稳定，不溶于酸、碱及有机 溶剂。大孔树脂可分为非极性和 中等极性两类，在水溶液中吸附 力较强且有良好的吸附选择性， 而在有机溶剂中吸附能力较弱。
一、基本原理 1．分子筛效应
26
体积大的组分完全不能进入凝胶 颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶 颗粒之间的间隙随流动相最先流 出色谱柱；而体积小的组分，可 渗入凝胶颗粒内的孔隙中，因此 在流经凝胶颗粒之间的间隙和全 部凝胶颗粒的孔隙之后，最后流 出；介于大小分子中间的组分， 只能进入一部分颗粒内较大的孔 隙，在中间时间段流出。
n
n
因为流动相的量很大，Y m Y a 近似于常数，而 且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附平衡常 数可写成
n
4
K
X a X m
X X
a
/S
a
Cs Cm
m
/V m
[ X a ]为溶质分子在吸附剂表 面的浓度 [ X m ]为溶质分子在流动相中 的浓度
Sa 为吸附剂表面面积 Vm为流动相的体积
加热除水，活性提高，吸附力加强（活化） 吸水，活性下降，吸附力减弱。 三、色谱条件的选择 选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物 质、流动相(洗脱剂)三方面进行综合考虑。
13
1. 被分离物质的极性 被分离物质的极性越大,被吸附剂吸附得越牢! 常见的化合物极性大小顺序: 烷烃 < 烯烃 < 醚类 < 硝基化合物 < 二甲胺 < 脂 类 < 酮类< 醛类 < 硫醇 < 胺类 < 酰胺 < 醇类 < 酚类 < 羧酸类 被分离物质的极性与结构的关系 (1) 基本母核相同 , 基团极性愈大 , 分子极性愈大。 基本母核相同 , 极性基团数目愈多 , 分子极性愈大。 (2) 分子双键多, 吸附力 ↑。 (3) 空间排列 , 影响极性。
10
酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中 的羟基或羧基形成氢键；酰胺基中的氨基与醌 类、硝基类中的醌基、硝基形成氢键而产生吸 附作用。 （4）大孔吸附树脂 一种不含交换基团，具有大孔 网状结构的高分子吸附剂。理化 性质稳定，不溶于酸、碱及有机 溶剂。大孔树脂可分为非极性和 中等极性两类，在水溶液中吸附 力较强且有良好的吸附选择性， 而在有机溶剂中吸附能力较弱。
一、基本原理 1．分子筛效应
26
体积大的组分完全不能进入凝胶 颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶 颗粒之间的间隙随流动相最先流 出色谱柱；而体积小的组分，可 渗入凝胶颗粒内的孔隙中，因此 在流经凝胶颗粒之间的间隙和全 部凝胶颗粒的孔隙之后，最后流 出；介于大小分子中间的组分， 只能进入一部分颗粒内较大的孔 隙，在中间时间段流出。
n
n
因为流动相的量很大，Y m Y a 近似于常数，而 且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附平衡常 数可写成
n
4
K
X a X m
X X
a
/S
a
Cs Cm
m
/V m
[ X a ]为溶质分子在吸附剂表 面的浓度 [ X m ]为溶质分子在流动相中 的浓度
Sa 为吸附剂表面面积 Vm为流动相的体积
加热除水，活性提高，吸附力加强（活化） 吸水，活性下降，吸附力减弱。 三、色谱条件的选择 选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物 质、流动相(洗脱剂)三方面进行综合考虑。
13
1. 被分离物质的极性 被分离物质的极性越大,被吸附剂吸附得越牢! 常见的化合物极性大小顺序: 烷烃 < 烯烃 < 醚类 < 硝基化合物 < 二甲胺 < 脂 类 < 酮类< 醛类 < 硫醇 < 胺类 < 酰胺 < 醇类 < 酚类 < 羧酸类 被分离物质的极性与结构的关系 (1) 基本母核相同 , 基团极性愈大 , 分子极性愈大。 基本母核相同 , 极性基团数目愈多 , 分子极性愈大。 (2) 分子双键多, 吸附力 ↑。 (3) 空间排列 , 影响极性。
第十一章高效液相色谱法教材
➢ 高速：采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快。 只需数分钟； 而经典方法靠重力加料，完成一次分析需数 小时；
➢ 高效：柱填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀，传质 阻力小，因而柱效高，数分钟完成数百物质的分离；
➢ 高灵敏度：紫外检测器最小检测量 10-9g，荧光检测器灵
敏度可达10-11g。
操作条件：室温、高压。
11.3 HPLC的分类与基本原理
14.3.1高效液相色谱法的分类
HPLC
按固定 相分类
按分离 机理分类
液液色谱法LLC 液固色谱法LSC
分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 分子排阻色谱法 化学键合色谱法 亲合色谱法 胶束色谱法
7
一、液液分配色谱法（LLC） 二、液固吸附色谱法（LSC） 三、化学键合相色谱法（CBC） 四、离子对色谱法 五、离子色谱法
内梯度: 2台高压泵, 每台泵输送一种溶剂，配比由设定的程序控制。多种 溶剂混合前分别由泵增压入梯度混合室，混合后进入柱系统。
34
35
3．进样系统
手动进样
36
自动进样器进样
自动进样的样品量可连续调节，进样重复性 高，适合做大量样品分析。
37
4. 分离系统——色谱柱
➢ 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。
激发波长(ex)和发射波长(em)的
选择；如菲、芘和苯并a芘的激发波长
：280、333 和365 nm；发射波长
350、390和410 nm
44
11.6 高效液相色谱的应用
➢ 在食品研究中的分析应用
食品中的天然成分
✓ 碳水化合物
✓ 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇
✓ 脂肪酸和有机酸
➢ 高效：柱填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀，传质 阻力小，因而柱效高，数分钟完成数百物质的分离；
➢ 高灵敏度：紫外检测器最小检测量 10-9g，荧光检测器灵
敏度可达10-11g。
操作条件：室温、高压。
11.3 HPLC的分类与基本原理
14.3.1高效液相色谱法的分类
HPLC
按固定 相分类
按分离 机理分类
液液色谱法LLC 液固色谱法LSC
分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 分子排阻色谱法 化学键合色谱法 亲合色谱法 胶束色谱法
7
一、液液分配色谱法（LLC） 二、液固吸附色谱法（LSC） 三、化学键合相色谱法（CBC） 四、离子对色谱法 五、离子色谱法
内梯度: 2台高压泵, 每台泵输送一种溶剂，配比由设定的程序控制。多种 溶剂混合前分别由泵增压入梯度混合室，混合后进入柱系统。
34
35
3．进样系统
手动进样
36
自动进样器进样
自动进样的样品量可连续调节，进样重复性 高，适合做大量样品分析。
37
4. 分离系统——色谱柱
➢ 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。
激发波长(ex)和发射波长(em)的
选择；如菲、芘和苯并a芘的激发波长
：280、333 和365 nm；发射波长
350、390和410 nm
44
11.6 高效液相色谱的应用
➢ 在食品研究中的分析应用
食品中的天然成分
✓ 碳水化合物
✓ 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇
✓ 脂肪酸和有机酸
经典液相色谱法
(2)固定相：吸附剂；粘合剂
(3)流动相
(4)显色剂
22
2）制板 薄层板的制备，就是将吸附剂均匀地涂铺在玻璃板
上，使成薄层称之为制板。
制板的步骤：
(1)吸附剂的涂布
(2)板的活化
23
(1) 吸附剂的涂布 常用薄板：加粘合剂的硬板和不加粘合剂的软板
一般氧化铝采用软板多，而硅胶常采用硬板。
硬板的涂铺方法：倾注法 、平铺法、涂铺器 、喷雾法
Chap. 5 经典液相色谱法
1
本章内容层次
掌握：吸附色谱法、分配色谱法的基本原理以及 应用，薄层色谱法的基本操作。
熟悉：离子交换色谱法的基本原理以及应用。
了解：尺寸排阻色谱法、聚酰胺色谱法的基本原 理以及应用。
2
§1 吸附色谱法
1. 基本原理
1.1 定义
一种溶质基于吸附现象而获得分离的液－固色 谱分析方法，按操作方式又可分为吸附柱色谱
48
1.1 阳离子交换树脂
根据可交换的离子的不同 等酸性基团
氢型树脂－－含有－SO3H,－COOH,－OH,－SH,－PO3H2 盐型树脂－－含有钠盐、钾盐
依据其酸性强度
强酸型阳离子交换剂
弱酸型阳离子交换剂 树脂的酸性强度一般按下列次序递减：
R－SO3H＞HO-R- SO3H＞R－PO3H2＞R－COOH＞R－OH
过程。
13
硅胶含水量(％) 0
活性 级别 Ⅰ
氧化铝含水 量(％) 0
5
15 25
Ⅱ
Ⅲ Ⅳ
3
6 10
38
Ⅴ
15
14
3. 色谱条件的选择
在吸附色谱中，除了正确选择吸附剂外，还可以通过 流动相的选择来改变K值，或改变一对化合物的K值比，
经典色谱法液相
1. 乌头碱对照品 2，3，4. 样品
53
2、洗脱测定法
盐酸吗啉双胍分析方法研究
准确吸取…直线状点样，…置于…层析缸 中，展至14cm，取出晾干，于紫外灯下， 用针将Rf值约为0.4的盐酸吗啉双胍谱带划
-SO3H、-COOH -N(CH3)3+、-NH2
阳离子交换树脂 阴离子交换树脂
钠型 氯型
2021/6/16
14
2、性能
①交联度：交联剂（如二乙烯苯）的用量 阳离子交换树脂交联度以8％， 阴离子交换树脂交联度以4％左右为宜。 ②交换容量
理论交换容量：每克干树脂含有可交换基团的数目 实际交换容量：每克干树脂真正参加交换的基团数目 用酸碱滴定法测定，单位以mmol/g表示。树脂的交换容量 一般为1～10mmol/g。
分离机制：主要是氢键吸附 适用对象：黄酮类、鞣质、醌
氢键能力↑强 组分越后出柱
粒度：20~100目
2021/6/16
8
（三）色谱条件的选择：
依据被测组分、吸附剂和流动相的性质
1. 被测组分性质（极性大小）： 烷烃＜烯烃＜醚<硝基化合物<二甲胺＜酯 ＜酮＜醛<胺＜酰胺＜醇＜酚＜羧酸
2021/6/16
2、性能
③再生
交换
RSO3-H+ + Na+ + Cl- 再生 RSO3-Na+ + H+ + Cl-
交换
RCH2N(CH3)3+OH- + Na+ +Cl- 再生
CH2N(CH3)3+Cl-+ NaOH
2021/6/16
16
3、分离机理：选择系数不同 离子价数越高，原子序数越大，水合离子 半径越小和离子交换树脂的亲和力越大， 即选择系数越大
第十一章 高效液相色谱法
SCN Cl HCOO CH 3COO OH F
用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快
4.应用
离子型化合物、可离解的化合物、带电 荷的物质等。如无机盐、生物大分子氨基酸 、核酸、蛋白质等
四、化学键合相色谱
分配色谱：
液液色谱+ 键合色谱
采用化学键合相 的液相色谱
3. 高效液相色谱法分析条件的选择
4. 反相键合相色谱法原理及特点
5. 梯度洗脱方法特点
6. 液相色谱定性和定量分析方法
作 业
p.219
3，4，5，6，8，9
固定相极性<流动相极性
组分极性越小， 保留时间越长
分离弱、非极性 物
反相分配色谱
☺
三、离子交换色谱法（IEC）
1.分离原理
阳离子交换
- + M++ RSO3 H
组分对交换 剂亲和力不 同
-
H+ + RSO3 M+
阳离子交换树脂
阴离子交换
Cl X RNR+ + 3
RNR3 X + Cl-
+
-
2.固定相
邻 硝 基 苯 胺 间 硝 基 苯 胺 对 硝 基 苯 胺
邻位<间位<对 位
二、分配色谱法（液-液分配色谱LLC
LLC分离原理 + 键合相色谱）
Vm cs k K Vs cm
K不仅与固定相的种类有关，也与流动相 的种类有关
固定相极性>流动相极性
组分极性越大， 保留时间越长
分离强极性物
正相分配色谱
经典液相柱 色谱装置
150-200 μm 3-10 μm 固定相粒径 流动相驱动方式 重力或低压泵 高压泵 快(1-10mL/min) 流动相流速 很慢
液相色谱(应化2013)
（3）GC, HPLC色谱柱的比较
柱型 GC填充柱 内径 柱长 2 ~4m 填料粒度
2~6 mm GC毛细管 0.1 ~0.5 mm 柱 HPLC色谱 2 ~ 6 mm 柱
柱内径的1/201/25(100µ m) 几十米~几百米 无填料
10 ~50cm
5 ~10µ m
4．检测器 （1）对检测器的要求：灵敏度高，重复性好、线 性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化 不敏感等 （2）检测器的类型：一类是溶质性检测器，它仅 对被分离组分的物理或物理化学特性有响应， 属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测 器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱 液总的物理和化学性质响应，属于此类检测器 有示差折光检测器等
二 HPLC的缺点
设备、柱填充剂和流动相比气相色谱贵，普 及应用受到限制；定性分析时需要与质谱、核磁 共振谱及红外光谱等技术联用
三 HPLC与经典LC比较
类型 LC 功能 柱内径 粒度 柱效 能否 周期 输液 在线 方式 >100μm 低 否 长 常压 <10μm 高 能 短 高压
分离 1－ 3cm HPLC 分离 2－ 分析 6mm
紫外光度检测器特点
灵敏度高；应用范围广；流通池可做的很 小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的 流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱；溶剂必须能让所选择的光透 过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长
紫外光电二极管阵列检测器原理
采用光电二极管阵列作检测元件，阵列由200～ 1000个光电二极管组成，每一个二极管测量一段 波长的光谱。具有组分特征吸收的全部波长经光 栅分光后同时被检测 由于采用电子学方法和计算机技术可以对二极管 阵列快速扫描采集数据，扫描速率非常快，低于 -2 10 s，远大于色谱峰流出速率，因此勿需停流扫 描即可获得动态光谱吸收图
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空间排阻色谱法的分类：
1、凝胶渗透色谱法GPC： 分离亲脂性物质 固定相: 亲脂性凝胶如甲基交联葡聚糖凝胶 流动相: 有机溶剂
2、凝胶过滤色谱法GFC： 分离水溶性物质 固定相: 亲水性凝胶如葡聚糖凝胶 流动相: 水
分离对象：大分子量（＞2000）的化合物 有机聚合物（如 聚烯烃、聚苯乙烯和聚酰胺等） 生物大分子（如蛋白质、核酸、低聚糖、肽类等）
（二）分离度
定义式：R=2d/（W1+W2）=2(L2-L1) / （W1+W2） W1, W2：各斑点直径 完全分离：R≥1.5 基本分离：R＝1.0 最佳分离：R=2.0
W1 W2
薄层扫描图
d
L0
柱色谱 属性 流动相名称 定性参数 展开顺序 定距洗脱 洗脱剂
平面色谱
定时展开
展开剂 比移值Rf(展开距离) K越小→ Rf越大 展开越快
色谱柱一定，Ka大，即极性越强的组分吸附力越强→→→ 柱色谱：tR越长→洗脱慢；反之Ka小，极性越弱组分先被洗脱。
平面色谱：Rf越小→展开慢；反之Ka小，极性越弱组分展开快。
附：常见化合物极性 ①见登山图1 ②双键↑，吸附力↑ ③分子内氢键，吸附力↓
酰胺 胺类 硫醇 醛
羧酸 酚
醇
登山图1 取代基极性
续前
2.相对比移值Rst
Rst R f（i） R f（S） 原点到组分斑点质量中心的距离 原点到参考物斑点质量中心的距离 Li LS
•
• •
讨论 参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性； 参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 相对比移值Rst 与组分、参考物性质及色谱条件有关， 范围可以大于或小于1
局限： 不能分离大小相近的化合物 为得到良好的分离，组分的分子量应相差10%以上。 应用 Kp∝尺寸∝相对分子质量—— 可应用于高分子分子量的测定
结论：
四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、 分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡
K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和 渗透系数
2. 点样
1）样品溶液
避免用水作溶剂，斑点易扩散， 溶剂不易挥发 一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿 等挥发性溶剂 最好用与展开剂极性相似的溶剂
2）点样量
几到几十微克，点样直径 不超过2~3mm
端距 1~2c m
间距1.5~2cm
起始线 直径:3mm。几~几十 微克，少于10 μL
3. 展开
(1) 展开方式: 上行展开法、近水平展开 双向展开、同向多次展开 软板——近水平展开 硬板——上行法 (2) 展开中注意之点 a) 边缘效应：同一物质在同一薄板上展开时两 边的Rf值与中间部分的Rf值不同 b) 消除边缘效应的措施： 展开前充分饱和15~30min 展开槽内壁贴上滤纸条浸湿 选小体积展开槽
[ R A]S [ B ]m [ R B ]S [ A]m
[ R A]S [ A] [ R B ] S [ B ]m
注：KA/B越大，A离子交换能力越大，越易保留，tR越长
2. 固定相→离子交换剂 经典离子交换色谱：离子交换树脂 HPLC：化学键合离子交换剂 流动相→水为溶剂的缓冲溶液
4. 吸附剂的活性
吸附剂含水量越高，吸附活性越低，吸附能力越弱，活性 级数越大，同一组分和流动相，其K越小 加热失水—活化 加水—减活或失活 分离极性小的组分—选吸附活性大的吸附剂 分离极性大的组分—选吸附活性小的吸附剂
硅胶含水量% 0 5 15 25 38 氧化铝含水量% 0 3 6 10 15 活性级别 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ 吸附活性(能力) 大(强) ↓ ↓ ↓ 小(弱)
除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶 孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流 动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响
P236
第三节
分 类：
平面色谱法
吸附薄层色谱
薄层色谱 (TLC)
分配薄层色谱 分子排阻薄层色谱
平面色谱
纸色谱 （PC）
薄层电泳法
一、平面色谱参数
（一）定性参数
1、比移值（Rf）
二、薄层色谱法
（一）吸附薄层色谱法的吸附剂和展开剂
常用吸附剂 1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚酰胺
（二）展开剂的选择（同液固吸附色谱流动相选择） 根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性
•吸附剂和流动相的选择：
依据被测组分、吸附剂和流动相的性质 1. 被测组分性质（极性大小）： 烃＜ - - - - - - - - ＜羧酸 2. 吸附剂的活性： 吸附剂的活性↑大，对组分的吸附能力↑强，K ↑大 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂 3. 流动相的极性： 流动相极性↑大，对组分的展开能力↑大 , K ↑小 “相似相溶”原则 ：根据组分性质、吸附剂的活性， 选择适当极性的流动相
3) 洗脱顺序：极性相似相溶
正相分配色谱:极性弱的组分先被洗脱 反相分配色谱:极性强的组分先被洗脱
正相液—液分配色谱 固定相 强极性溶剂: 水、醇类等
反相液—液分配色谱 弱极性溶剂: 辛烷、氯仿等
流动相
弱极性溶剂: 苯、甲苯、环己烷等 强极性化合物
极性小的组分，K小→ tR短，先出柱
强极性溶剂: 缓冲溶液、醇类等 弱极性至非极性物质
1）环己烷：弱极性，减弱洗脱能力，增大K，减小Rf
2）水：强极性，增强洗脱能力，减小K，增大Rf 3）丙酮：中等极性，增加极性与弱极性溶剂间的互溶性 4）乙二胺：调节pH值，抑制组分离解，减少斑点拖尾。
（二）薄层色谱操作方法
1. 薄层板的制备
1）薄层板的类型 （1）硬板：加粘合剂—湿法铺板
（2）软板：无粘合剂—干法铺板
Si Si
硅醚
1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键 物质极性↑，吸附能力↑→不易展开，K大，Rf越小 吸附活性次序：束缚型＜游离型 硅醚无活性 2）含水量越大，活性越低，吸附能力越低
加热失水—活化: 105～110OC (30分钟)----(可逆失水) 200OC ------ (不可逆失水)→活性丧失 适用：分析酸性或中性物质 ，如有机酸、氨基酸、甾体等 选择性保留碱性物质,如胺类
保留时间tR
K越小→tR 越短 洗脱越快
二、薄层色谱法
定义：将固定相均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、
塑料或 金属上形成薄层，在此薄层上进行色谱分
离的方法 薄层板：铺好固定相层的板 特点：1、分离能力强，斑点集中； 2、灵敏度高；
3、展开时间短；
5、上样量大；
4、试样预处理简单；
6、仪器简单操作方便
4. 三者关系图示： 组分 极性 非(弱)极性
吸附剂 活性小 活性大
流动相 极性 非极性或弱极性
5. 展开顺序: 固定相、展开剂一定
极性越小者 Rf越大, 展开快 极性越大者Rf越小, 展开慢 6. 吸附剂活性越大，Rf 展开剂极性越大，Rf
例. 硅胶板分离生物碱，展开剂为：
环己烷:丙酮:乙二胺:水=10：5：2：5
第十一章
经典液相色谱法
回顾
液相色谱法（LC）：以液体为流动相的色谱法
柱色谱法 液相色谱 平面色谱法 纸色谱法 薄层色谱法
第一节 基本原理与分类
一、吸附色谱法 （一）分离原理
1. 要求： 固定相→吸附剂（硅胶或Al2O3） 具表面活性吸附中心 2.分离机制：利用吸附剂对不同组分的 吸附能力差异而实现分离 吸附平衡 吸附系数 Xm + nYa→Xa + nYm
2.固定相和流动相 1）要求：
固定相—固定液 机械涂渍在惰性载体上的液体（易流失） 化学反应键合在载体表面—化学键合相 流动相→必须与固定相不为互溶（LLC） 载体→惰性，性质稳定 不与固定相和流动相发生化学反应
2）液液分配色谱的类别：
正相分配色谱→固定相极性大于流动相 反相分配色谱→固定相极性小于流动相
极性大的组分，K小→ tR短，先出柱
分离对象
洗脱顺序
化学键合相：
将固定液的官能团键合在载体的表面，而构成键 合相。 以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相 色谱法。 化学键合相既有 分配作用又有吸附作用
正相键合相色谱法 如氰基与氨基化学键合相 流动相用烷烃，加适量极性调整剂而构成
※
※ 反相化学键合相 如十八烷基键合相 流动相常用甲醇—水或乙腈—水
Rf=0: 组分在原点，完全被固定相保留
L
0
Rf=1: 组分在前沿，完全不被固定相保留
LA
LB
最佳范围：0.3-0.5
可用范围：0.2-0.8
☆色谱条件一定，Rf只与组分性质有关—— 薄层色谱定性参数
Rf 值与组分性质、薄层板性质、展开剂性质、展开室内 展开剂蒸气饱和程度、温度等有关
☆
讨论 1）Rf 与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄 层板和展开剂的性质有关 2）K↑大，Rf↓小 3）薄层板一定，对于极性组分 展开剂极性↑大，Rf↑大（容易展开） 展开剂极性↓小，Rf↓小（不容易展开）
要求： 固定相→多孔性凝胶—凝胶色谱 流动相→水——凝胶过滤色谱(GFC) 流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱(GPC) 分离机制：根据被测组分分子大小的 不同分离—分子筛原理 渗透系数Kp
KP [X S ] [X m ]
Kp=0：尺寸太大全被排阻 Kp=1：尺寸太小全被保留 0＜Kp＜1
注：Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小， 与流动相的性质无关
2. 氧化铝—强极性吸附剂 (一般得拖尾峰) 碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH≈7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质 活化温度: 200~400℃ (0.5h) 应用：分离生物碱、挥发油、萜类、甾体、甙、 酯、内酯等 3. 聚酰胺 氢键作用 氢键能力↑强，组分展开越慢 应用：分离酚、酸、硝基、醌类 如：黄酮类化合物