第十一章 经典液相色谱法2013

3) 洗脱顺序：极性相似相溶


正相分配色谱:极性弱的组分先被洗脱 反相分配色谱:极性强的组分先被洗脱
正相液—液分配色谱 固定相 强极性溶剂: 水、醇类等
反相液—液分配色谱 弱极性溶剂: 辛烷、氯仿等
流动相
弱极性溶剂: 苯、甲苯、环己烷等 强极性化合物
极性小的组分，K小→ tR短，先出柱
强极性溶剂: 缓冲溶液、醇类等 弱极性至非极性物质
酮
酯 二甲胺
硝基化合物 醚
烯烃 烷烃
水

附：常见溶剂极性
丙醇 正丁醇 醋酸乙酯 氯仿 乙醚 甲苯 苯 四氯化碳 环已烷 石油醚
乙腈
乙醇、甲醇
登山图2 流动相极性
（二）固定相-吸附剂
常用吸附剂 1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚酰胺
1.硅胶（SiO2· 2O）----极性吸附剂,弱酸性 xH
O
结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构 表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心
极性大的组分，K小→ tR短，先出柱
分离对象
洗脱顺序

化学键合相：
将固定液的官能团键合在载体的表面，而构成键 合相。 以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相 色谱法。 化学键合相既有 分配作用又有吸附作用
正相键合相色谱法 如氰基与氨基化学键合相 流动相用烷烃，加适量极性调整剂而构成



※
※ 反相化学键合相 如十八烷基键合相 流动相常用甲醇—水或乙腈—水
图示
4. 显色
显色方法
1、有色化合物——直接定位 斑点有荧光 紫外吸收 紫外灯检出 荧光板上有暗斑 显色剂定位
2）粘合薄层板（硬板、湿板）的铺制 ⑴ 粘合剂 煅石膏：吸附剂的9-15%左右—硅胶-G板 羧甲基纤维素钠CMC-Na：0.5-1%水溶液—硅 胶-CMC板
3）铺板方法 （1） 倾注法铺板 （2）平铺法铺板 （3）机械涂铺法铺板
4）活化 凉干-活化-放冷-干燥器中 注意：活化温度及时间（105℃，1h） 活化的目的（除去水分）

除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶 孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流 动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响
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第三节
分 类：
平面色谱法
吸附薄层色谱
薄层色谱 (TLC)
分配薄层色谱 分子排阻薄层色谱
平面色谱
纸色谱 （PC）
薄层电泳法
一、平面色谱参数
（一）定性参数
1、比移值（Rf）
保留时间tR
K越小→tR 越短 洗脱越快
二、薄层色谱法
定义：将固定相均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、
塑料或 金属上形成薄层，在此薄层上进行色谱分
离的方法 薄层板：铺好固定相层的板 特点：1、分离能力强，斑点集中； 2、灵敏度高；
3、展开时间短；
5、上样量大；
4、试样预处理简单；
6、仪器简单操作方便

空间排阻色谱法的分类：
1、凝胶渗透色谱法GPC： 分离亲脂性物质 固定相: 亲脂性凝胶如甲基交联葡聚糖凝胶 流动相: 有机溶剂
2、凝胶过滤色谱法GFC： 分离水溶性物质 固定相: 亲水性凝胶如葡聚糖凝胶 流动相: 水

分离对象：大分子量（＞2000）的化合物 有机聚合物（如 聚烯烃、聚苯乙烯和聚酰胺等） 生物大分子（如蛋白质、核酸、低聚糖、肽类等）
Si Si
硅醚
1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键 物质极性↑，吸附能力↑→不易展开，K大，Rf越小 吸附活性次序：束缚型＜游离型 硅醚无活性 2）含水量越大，活性越低，吸附能力越低
加热失水—活化: 105～110OC (30分钟)----(可逆失水) 200OC ------ (不可逆失水)→活性丧失 适用：分析酸性或中性物质 ，如有机酸、氨基酸、甾体等 选择性保留碱性物质,如胺类
4. 三者关系图示： 组分 极性 非(弱)极性
吸附剂 活性小 活性大
流动相 极性 非极性或弱极性
5. 展开顺序: 固定相、展开剂一定
极性越小者 Rf越大, 展开快 极性越大者Rf越小, 展开慢 6. 吸附剂活性越大，Rf 展开剂极性越大，Rf
例. 硅胶板分离生物碱，展开剂为：
环己烷:丙酮:乙二胺:水=10：5：2：5
色谱柱一定，Ka大，即极性越强的组分吸附力越强→→→ 柱色谱：tR越长→洗脱慢；反之Ka小，极性越弱组分先被洗脱。
平面色谱：Rf越小→展开慢；反之Ka小，极性越弱组分展开快。


附：常见化合物极性 ①见登山图1 ②双键↑，吸附力↑ ③分子内氢键，吸附力↓
酰胺 胺类 硫醇 醛
羧酸 酚
醇
登山图1 取代基极性
局限： 不能分离大小相近的化合物 为得到良好的分离，组分的分子量应相差10%以上。 应用 Kp∝尺寸∝相对分子质量—— 可应用于高分子分子量的测定
结论：

四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、 分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡
K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和 渗透系数


要求： 固定相→多孔性凝胶—凝胶色谱 流动相→水——凝胶过滤色谱(GFC) 流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱(GPC) 分离机制：根据被测组分分子大小的 不同分离—分子筛原理 渗透系数Kp
KP [X S ] [X m ]
Kp=0：尺寸太大全被排阻 Kp=1：尺寸太小全被保留 0＜Kp＜1
注：Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小， 与流动相的性质无关
三、离子交换色谱法
1.分离机制：依据被测组分与离子交 换剂交换能力（亲和力）不同

以阳离子交换树脂为例
RSO3-H+ + X+ → RSO3-X+ + H+
固定离子 可交换离子B 待测离子A
通式：R-B + A → R-A + B
选择性系数
K A/ B
[ RSO3 X ]S [ H ]m [ RSO3 H ]S [ X ]m KA KB
第十一章
经典液相色谱法
回顾
液相色谱法（LC）：以液体为流动相的色谱法
柱色谱法 液相色谱 平面色谱法 纸色谱法 薄层色谱法
第一节 基本原理与分类
一、吸附色谱法 （一）分离原理
1. 要求： 固定相→吸附剂（硅胶或Al2O3） 具表面活性吸附中心 2.分离机制：利用吸附剂对不同组分的 吸附能力差异而实现分离 吸附平衡 吸附系数 Xm + nYa→Xa + nYm
4. 吸附剂的活性

吸附剂含水量越高，吸附活性越低，吸附能力越弱，活性 级数越大，同一组分和流动相，其K越小 加热失水—活化 加水—减活或失活 分离极性小的组分—选吸附活性大的吸附剂 分离极性大的组分—选吸附活性小的吸附剂
硅胶含水量% 0 5 15 25 38 氧化铝含水量% 0 3 6 10 15 活性级别 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ 吸附活性(能力) 大(强) ↓ ↓ ↓ 小(弱)
2. 点样
1）样品溶液
避免用水作溶剂，斑点易扩散， 溶剂不易挥发 一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿 等挥发性溶剂 最好用与展开剂极性相似的溶剂
2）点样量
几到几十微克，点样直径 不超过2~3mm
端距 1~2c m
间距1.5~2cm
起始线 直径:3mm。几~几十 微克，少于10 μL
3. 展开
(1) 展开方式: 上行展开法、近水平展开 双向展开、同向多次展开 软板——近水平展开 硬板——上行法 (2) 展开中注意之点 a) 边缘效应：同一物质在同一薄板上展开时两 边的Rf值与中间部分的Rf值不同 b) 消除边缘效应的措施： 展开前充分饱和15~30min 展开槽内壁贴上滤纸条浸湿 选小体积展开槽
3. 影响保留行为的因素：

KA/B与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离子 交换树脂性质以及温度有关
1）离子价态越高→Ka越大→tR越长 2）价态相同，水合离子半径越小，Ka越大→tR越长 3）交换能力强的离子组成的流动相洗脱能力强→tR越短 4）离子强度大的流动相洗脱能力强→tR越短
四、分子（空间）排阻色谱法
2.固定相和流动相 1）要求：
固定相—固定液 机械涂渍在惰性载体上的液体（易流失） 化学反应键合在载体表面—化学键合相 流动相→必须与固定相不为互溶（LLC） 载体→惰性，性质稳定 不与固定相和流动相发生化学反应
2）液液分配色谱的类别：
正相分配色谱→固定相极性大于流动相 反相分配色谱→固定相极性小于流动相
续前
2.相对比移值Rst
Rst R f（i） R f（S） 原点到组分斑点质量中心的距离 原点到参考物斑点质量中心的距离 Li LS
•
• •
讨论 参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性； 参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 相对比移值Rst 与组分、参考物性质及色谱条件有关， 范围可以大于或小于1
Rf=0: 组分在原点，完全被固定相保留
L
0
Rf=1: 组分在前沿，完全不被固定相保留
LA
LB
最佳范围：0.3-0.5
可用范围：0.2-0.8
☆色谱条件一定，Rf只与组分性质有关—— 薄层色谱定性参数
Rf 值与组分性质、薄层板性质、展开剂性质、展开室内 展开剂蒸气饱和程度、温度等有关
☆

讨论 1）Rf 与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄 层板和展开剂的性质有关 2）K↑大，Rf↓小 3）薄层板一定，对于极性组分 展开剂极性↑大，Rf↑大（容易展开） 展开剂极性↓小，Rf↓小（不容易展开）
二Baidu Nhomakorabea薄层色谱法
（一）吸附薄层色谱法的吸附剂和展开剂

常用吸附剂 1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚酰胺
（二）展开剂的选择（同液固吸附色谱流动相选择） 根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性
•吸附剂和流动相的选择：
依据被测组分、吸附剂和流动相的性质 1. 被测组分性质（极性大小）： 烃＜ - - - - - - - - ＜羧酸 2. 吸附剂的活性： 吸附剂的活性↑大，对组分的吸附能力↑强，K ↑大 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂 3. 流动相的极性： 流动相极性↑大，对组分的展开能力↑大 , K ↑小 “相似相溶”原则 ：根据组分性质、吸附剂的活性， 选择适当极性的流动相
2. 氧化铝—强极性吸附剂 (一般得拖尾峰) 碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH≈7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质 活化温度: 200~400℃ (0.5h) 应用：分离生物碱、挥发油、萜类、甾体、甙、 酯、内酯等 3. 聚酰胺 氢键作用 氢键能力↑强，组分展开越慢 应用：分离酚、酸、硝基、醌类 如：黄酮类化合物
1）环己烷：弱极性，减弱洗脱能力，增大K，减小Rf
2）水：强极性，增强洗脱能力，减小K，增大Rf 3）丙酮：中等极性，增加极性与弱极性溶剂间的互溶性 4）乙二胺：调节pH值，抑制组分离解，减少斑点拖尾。
（二）薄层色谱操作方法
1. 薄层板的制备
1）薄层板的类型 （1）硬板：加粘合剂—湿法铺板
（2）软板：无粘合剂—干法铺板





[ R A]S [ B ]m [ R B ]S [ A]m
[ R A]S [ A] [ R B ] S [ B ]m
注：KA/B越大，A离子交换能力越大，越易保留，tR越长
2. 固定相→离子交换剂 经典离子交换色谱：离子交换树脂 HPLC：化学键合离子交换剂 流动相→水为溶剂的缓冲溶液
Ka [ X a ][Ym ] [ X m ][Ya ]
n n

X a Sa X m Vm
注：Ka与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质及温度有关
一、吸附色谱法
3.流动相的洗脱能力: 与溶剂极性有关
溶剂极性越强，洗脱能力越强→组分ka越小 →
柱色谱：tR越短→组分越快流出 平面色谱： Rf越大→展开越快（展距越长） 4.洗脱顺序

二、分配色谱法
1. 分离机制 利用组分在流动相和固定相间 溶解度差别实现分离
狭义分配系数
K Cs Cm
Cs为溶质分子在固定相中的浓度 Cm为溶质分子在流动相中的浓度

X s Vs X m Vm
Vs为固定相的体积 Vm为流动相的体积
液液分配色谱（LLC）：K与流动相的性质（极性 及种类）有关 气液分配色谱（GLC）：K与固定相极性和柱温有关
（二）分离度
定义式：R=2d/（W1+W2）=2(L2-L1) / （W1+W2） W1, W2：各斑点直径 完全分离：R≥1.5 基本分离：R＝1.0 最佳分离：R=2.0
W1 W2
薄层扫描图
d
L0
柱色谱 属性 流动相名称 定性参数 展开顺序 定距洗脱 洗脱剂
平面色谱
定时展开
展开剂 比移值Rf(展开距离) K越小→ Rf越大 展开越快