条件性基因敲除的原理和设计原则
基因敲除的原理
基因敲除的原理基因敲除是一种重要的遗传工程技术，它可以帮助科学家们研究基因的功能和作用，也可以为疾病治疗和基因改良提供重要的理论和技术支持。
基因敲除的原理主要是通过人为地改变生物体内某个基因的DNA序列，使其失去功能或产生异常，从而观察和分析基因缺失对生物体的影响，进而揭示基因的功能和作用。
基因敲除的实现通常通过两种方法，一种是利用CRISPR/Cas9技术，另一种是利用RNA干扰技术。
CRISPR/Cas9技术是一种基因组编辑技术，它可以精确地切割DNA分子，将特定的DNA序列插入或删除到基因组中。
通过设计特定的引物和Cas9酶，科学家们可以实现对目标基因的精准敲除。
而RNA干扰技术则是通过引入特定的siRNA或miRNA分子，干扰基因的转录和翻译过程，从而抑制基因的表达和功能。
基因敲除的原理可以简单概括为三个步骤，选择目标基因、设计干扰分子、观察效果。
首先，科学家们需要选择一个具有特定功能或作用的基因作为研究对象，然后设计合适的干扰分子，如引物或RNA分子，以精确地干扰目标基因的表达和功能。
最后，他们观察和分析基因敲除后生物体的表型和生理变化，从而揭示基因的功能和作用。
基因敲除的原理在科学研究和生物技术领域有着广泛的应用。
在科学研究方面，基因敲除可以帮助科学家们揭示基因的功能和作用，探索基因调控网络和信号通路，从而深入理解生命的奥秘。
在生物技术领域，基因敲除可以为疾病治疗和基因改良提供重要的理论和技术支持。
例如，科学家们可以利用基因敲除技术研究疾病相关基因的功能，为疾病的早期诊断和治疗提供新的思路和方法；他们还可以利用基因敲除技术改良农作物和畜禽，提高其产量和品质，为粮食安全和农业发展做出贡献。
总之，基因敲除是一种重要的遗传工程技术，它可以帮助科学家们揭示基因的功能和作用，为疾病治疗和基因改良提供重要的理论和技术支持。
基因敲除的原理主要是通过人为地改变生物体内某个基因的DNA序列，使其失去功能或产生异常，从而观察和分析基因缺失对生物体的影响，进而揭示基因的功能和作用。
分子生物学综述论文(基因敲除技术)
现代分子生物学课程论文题目基因敲除技术班别生物技术10-2学号 *********** 姓名陈嘉杰成绩基因敲除技术的研究进展要摘基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
此后经历了近20年的推广和应用，直到2007年10月8日，美国科学家马里奥•卡佩奇（Mario Capecchi）和奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）、英国科学家马丁•埃文斯（Martin Evans）因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
基因敲除技术从此得到关注和肯定，并对医学生物学研究做出了重大贡献。
本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。
关键词基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组前言基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改制，具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。
该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠，再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。
基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。
上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱导Cre的表达。
简述基因敲除技术
简述基因敲除技术基因敲除技术是一种常用的遗传学研究方法，旨在通过人为干预的方式，使特定基因在生物体内失去功能。
这一技术的发展为我们深入了解基因功能和生物体发育提供了重要工具。
本文将从基因敲除技术的原理、应用和局限性三个方面进行阐述。
基因敲除技术的原理是通过利用DNA重组技术，将目标基因的编码序列取代或删除，使其无法正常表达。
其基本步骤包括目标基因的筛选、构建敲除载体、载体的导入和基因敲除细胞系的筛选等。
首先，确定目标基因，并设计引物进行筛选，以确保选择的是目标基因的编码区域。
然后，将目标基因的编码区域与质粒进行连接，构建敲除载体。
接着，通过适当的方法将敲除载体导入到细胞中，并利用筛选标记（如抗生素抗性基因）进行筛选，获得敲除目标基因的细胞系。
基因敲除技术在生物学研究中具有广泛应用。
首先，通过敲除特定基因，可以揭示该基因在生物体发育和功能中的作用。
例如，通过敲除小鼠体内的特定基因，可以观察到其对小鼠胚胎发育的影响，从而了解该基因在胚胎发育过程中的功能。
其次，基因敲除技术还可以用于研究疾病的发生机制。
通过敲除与某种疾病相关的基因，可以模拟该疾病的发生过程，为研究疾病的发病机制和寻找治疗方法提供重要线索。
此外，基因敲除技术还可以用于筛选药物靶点。
通过敲除特定基因并观察其对细胞生存的影响，可以发现新的药物靶点，为药物研发提供新的思路。
然而，基因敲除技术也存在一些局限性。
首先，敲除基因可能会对生物体的正常生理过程产生不可预测的影响。
虽然敲除技术可以帮助我们了解基因的功能，但敲除某些基因可能会导致生物体的死亡或严重异常。
其次，敲除技术往往需要复杂的实验操作和长时间的培养，且成功率不高。
这对于一些研究人员来说是一个挑战。
此外，基因敲除技术只能研究单个基因的功能，无法模拟多基因相互作用和调控的复杂生物过程。
基因敲除技术是一种重要的遗传学研究方法，通过人为干预的方式使特定基因在生物体内失去功能。
它在生物学研究中具有广泛的应用，可以揭示基因的功能和生物体发育的机制，为疾病研究和药物开发提供线索。
条件性敲除小鼠（CKO）原理、构建与应用
条件性敲除小鼠（CKO）原理、构建与应用基因敲除小鼠作为研究基因功能重要工具，应用十分广泛，然而实际操作中大家常常遇到这样问题：①靶基因敲除造成小鼠胚胎致死无法生育；②研究靶基因在某一阶段或者某一个组织的表达情况，那么全敲小鼠并不能满足我们的研究要求。
条件性基因敲除小鼠（CKO）就应运而生了，完美地解决了上面2个棘手问题。
今天，我们就为大家介绍一下条件性基因敲除小鼠的原理、构建、鉴定与应用。
一、条件性敲除小鼠（Conditional knockout mice, CKO）原理条件性基因敲除小鼠：使靶基因缺失仅发生于小鼠生命周期的某一阶段或某一特定的组织，而在其它组织或细胞表达正常，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。
如下为全敲和条件性敲除的对比：1. 技术原理通过染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP或Flp-FRT来实现的。
在待敲除目的基因一个或多个重要外显子两端各放置一个LoxP （或FRT）序列，得到flox（Flankedby LoxP)小鼠。
将flox小鼠与带有组织特异性表达的Cre(或Flp)的小鼠交配繁殖，以获得在特定组织里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。
鉴于这2种技术基本原理一致，Cre-LoxP系统更多用于动物体内编辑，下面就以Cre-LoxP具体介绍。
2. Cre/LoxP系统组成Cre-LoxP系统源于 P1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分：LoxP位点：一段长34bp的DNA序列，为重组酶识别的位点：含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
Cre重组酶：为一种酶，由343个氨基酸组成的单体蛋白；具有位点特异性，可使LoxP片段间的基因序列被删除或重组。
根据LoxP位点方向分以下三类重组方式：⑴两个LoxP位点方向相同：如果两个LoxP位点位于一条DNA 链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；如图下①所示。
初二生物基因敲除技术原理
初二生物基因敲除技术原理基因是生物体内控制遗传信息的基本单位，也是决定生物性状的重要因素。
基因敲除技术是一种通过删除或关闭特定基因来研究其功能的方法。
本文将介绍初二生物基因敲除技术的原理及其应用。
一、基因敲除技术的原理基因敲除技术是通过使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑实现的。
CRISPR-Cas9系统是一种先进的基因编辑工具，能够精确地剪切和修改DNA序列。
其原理包括以下几个步骤：1.设计sgRNA：sgRNA是单导RNA，能够指导Cas9蛋白靶向到特定的DNA序列。
在基因敲除实验中，sgRNA的设计目标是靶向到欲敲除的基因区域。
2.合成sgRNA和Cas9蛋白：sgRNA和Cas9蛋白质被合成并结合在一起，形成CRISPR-Cas9复合物。
3.靶向到基因组中的特定区域：CRISPR-Cas9复合物通过与靶向序列DNA相互作用，靶向到基因组中的特定区域。
4.切割DNA：一旦CRISPR-Cas9复合物与靶向序列结合，Cas9酶具有剪切双链DNA的能力，导致靶向序列的断裂。
5.修复和编辑：当DNA双链断裂时，细胞会尝试修复这些断裂。
通常情况下，细胞采用非同源末端连接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）的方式来修复断裂，这会导致插入或缺失的突变。
而在实验中，可以利用同源重组（Homologous Recombination, HR）技术来实现特定基因的敲除。
二、基因敲除技术的应用1.功能研究：基因敲除技术可以帮助科学家们研究基因功能。
通过敲除特定基因，可以观察到敲除基因带来的生物学变化，进而推测该基因在生物体内的功能。
2.疾病模型：基因敲除技术可以用于构建疾病模型。
例如，在敲除小鼠的特定基因后，可以观察到小鼠是否会出现与人类疾病相关的表型，从而研究和治疗相关疾病提供新的思路。
3.农业应用：基因敲除技术可以用于改良农作物。
通过敲除农作物中的不利基因，可以提高抗病性、耐逆性和产量等重要农艺性状，从而改善农作物品质和增加产量。
条件性基因敲除与敲入ppt课件
①发生Ⅰ型缺失，3个loxP之间的所有基因(靶基因 和选择标志基因)全部被切除，只保留1个loxP位点。
②发生Ⅱ型缺失，只有选择标志基因被切除，两个 loxP位点及其之间的靶基因被保留。发生了Ⅰ或Ⅱ 型缺失的胚胎干细胞在更昔洛韦选择培养下均能生 长，再用PCR和DNA印迹等方法来对缺失突变的结 果进行鉴定。
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在科学研究中，为了明确某一组织或器官的功能， 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研 究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后 观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基 因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。
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受精卵雄性原核显微注射法构建Cre 转基因动物
Cre转基因动物即时空特异性表达重组酶Cre的转基 因动物。构建此动物的目的在于为loxP转基因动物 提供重组酶Cre。由于在该转基因动物中Cre的表达 被置于特异性启动子的调控之下，因此它会以组织
细胞特异性和发育阶段特异性的方式向loxP转基因 动物提供Cre重组酶，以便在特定的发育阶段、特定 的组织细胞中使两个loxP之间的区域缺失。当然， 实现此目标的最后方法就是让这两种转基因动物进
③Ⅲ型缺失，靶基因被切除而选择标志基因被保留， 发生此型突变的细胞在更昔洛韦存在时无法生存。
基因敲除技术
．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞<ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1>：a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等>的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3] ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射>导入同源的胚胎干细胞(ES cell>中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
基因敲除小鼠技术
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
基因敲除的原理及应用
基因敲除的原理及应用前言基因敲除是一种重要的分子生物学技术，它通过特定的操作使得目标基因在细胞或生物体中失去功能。
基因敲除对于研究基因功能和疾病发生机制具有重要的意义，也在农业、医药等领域具有广泛的应用前景。
原理基因敲除的原理是通过干扰目标基因表达来实现。
具体说，通过介导特定的DNA修复机制，使得目标基因的DNA序列在细胞中发生改变，导致基因失去功能。
基因敲除可以分为两种主要的方法：CRISPR/Cas9系统和RNA干扰。
CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统是一种新兴的基因编辑技术，它基于细菌天然的免疫系统。
通过设计合成一段目标基因特异性的RNA，并与Cas9蛋白结合，形成一个双链RNA将导致Cas9蛋白在目标基因上发生剪切，从而实现基因敲除。
RNA干扰RNA干扰是一种通过介导RNA分子进行基因敲除的技术。
该技术通过合成特异性的双链RNA，将其导入目标细胞，RNA分子会与目标基因的mRNA相结合，导致mRNA降解，从而抑制目标基因的表达。
应用基因敲除在医学、农业等领域有着广泛的应用。
研究基因功能基因敲除是研究基因功能的重要工具之一。
通过敲除特定基因，可以观察目标基因参与的信号通路、调控网络以及该基因对于细胞生物学过程的影响。
这有助于揭示基因与疾病发生相关机制，并为研发相关治疗手段提供理论基础。
研究疾病发生机制基因敲除在疾病研究中起到重要作用。
通过敲除与某种疾病相关的基因，可以研究该基因对疾病发生的具体作用。
例如，敲除某些恶性肿瘤相关基因后，可以观察到肿瘤细胞的增殖受到抑制，从而为肿瘤治疗提供策略。
农业应用基因敲除技术在农业领域有着广泛的应用前景。
通过敲除与农作物病虫害相关的基因，可以使作物具备更强的抗性。
此外，基因敲除还可以用于改良农作物的品质和产量等重要性状。
结论基因敲除技术是一种重要的分子生物学技术，通过干扰目标基因表达来实现。
它在研究基因功能、疾病发生机制以及农业领域都具有广泛的应用前景。
几种基因敲除鼠简介
目录
• 基因敲除鼠概述 • 条件性基因敲除鼠 • 全敲除鼠 • 诱导性基因敲除鼠
01 基因敲除鼠概述
基因敲除鼠的定义
• 基因敲除鼠：通过基因工程技术，将特定基因从 老鼠体内敲除，从而产生具有特定表型特征的转 基因动物。
基因敲除鼠的用途
疾病模型
药物筛选
基因敲除鼠可以模拟人类遗传性疾病 的发生和发展过程，用于研究疾病的 发病机制和治疗方法。
全敲除鼠通常是通过将经过基因 编辑的胚胎干细胞注入早期胚胎 中，然后移植到代孕母鼠体内发
育而成。
全敲除鼠的应用
01
02
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疾病研究
全敲除鼠可以模拟人类遗 传性疾病，用于研究疾病 的发病机制、病理生理变 化和药物筛选等。
药物研发
全敲除鼠可以用于评估新 药对特定基因缺陷的治疗 效果，加速药物的研发进 程。
部分基因敲除鼠
03
将特定基因部分敲除或敲低，产生具有部分缺失或降低该基因
表达的转基因动物。
02 条件性基因敲除鼠
条件性基因敲除鼠的原理
条件性基因敲除鼠是通过基因打靶技术，将特 定基因的启动子替换为可诱导的启动子，使得 基因的表达只在特定条件下被激活或沉默。
可诱导的启动子通常来源于激素响应元件或化 学诱导系统，如四环素响应系统、干扰素响应 系统等。
药物研发
利用条件性基因敲除鼠可以筛选出 对特定疾病有疗效的药物，缩短药 物研发周期并提高成功率。
条件性基因敲除鼠的优缺点
优点
条件性基因敲除鼠具有高度特异性，可以避免全身敲除基因带来的副作用；同 时，可以在特定时间和空间范围内研究基因的功能，提高实验的可控性和精确 度。
缺点
条件性基因敲除鼠的构建过程复杂，需要较高的技术要求和时间成本；同时， 诱导系统的效果可能受到多种因素的影响，如激素水平、给药方式等。
第九章 基因敲除与药学
三、筛选与鉴定
标记筛选法：正负筛选法(PNS法) 标记筛选法：正负筛选法 法
含正、负两种选择性标记基因，前者插入或取代 载体上同源序列的关键外显子，后者位于同源序列的 外侧。转染ES细胞后 （1）末整合入外源基因(大多数， neo－/HSV-tk－)： 在含G418培养基中（－） （2）随机插入 (neo＋/HSV-tk＋)：在含更昔洛韦的培 养基中（－） （3）同源重组 (neo＋/HSV-tk－)，在含有G418和更 昔洛韦的培养基中生长。
全部“敲 全部“ 除”
受精卵
没能提高 “同源重 组”的效 率
需要成千 上万个受 精卵
天无绝人之路 英国的马丁· 英国的马丁·埃文斯博士
模仿“囊胚”中的微环境， 模仿“囊胚”中的微环境， 让培养皿中的干细胞无限 繁殖下去， 繁殖下去，同时又完整地 保留干细胞的“全能” 保留干细胞的“全能”特 性
成为在实验室条件下成功地繁殖 胚胎干细胞的世界第一人， 胚胎干细胞的世界第一人，为 基因靶向” “基因靶向”技术提供了足够多 的靶细胞
一、条件性基因敲除
利用Cre／LoxP实现靶基因的切除原理
一、条件性基因敲除
条件性基因敲除的程序分为两步： 条件性基因敲除的程序分为两步： 产生目标序列被两个重组酶识别位 点锚定的“ 点锚定的“Loxp floxed”动物 动物 动物与cre转基因 “Loxp floxed”动物与 动物与 转基因 动物杂交， 动物杂交，产生条件性基因敲除动 物
3.磷酸钙法 磷酸钙法
二、基因敲除载体导入ES细胞 基因敲除载体导入 细胞
将待转染的 DNA溶解在磷 溶解在磷 酸缓冲液中， 酸缓冲液中， 加入CaCl2后， 加入 DNA片段与磷 片段与磷 酸钙共沉淀并 形成大的颗粒； 形成大的颗粒； 将此颗粒悬浮 液加入贴壁培 养的细胞中， 养的细胞中， 外源DNA就被 外源 就被 靶细胞所吸收， 靶细胞所吸收， 进而实现转基 因。
基因敲除技术
．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞<ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1>：a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等>的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3] ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射>导入同源的胚胎干细胞(ES cell>中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
基因敲除
基因敲除技术(组图)一．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二．实现基因敲除的多种原理和方法：1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：①．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3]③．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
基因敲除技术
基因敲除技术研究进展综述摘要：基因敲除在20世纪80年代发展起来后已经应用到许多领域, 如建立人类疾病的转基因动物模型(糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等)。
这些疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究: 研究发育过程中各个基因的功能, 研究治疗人类遗传性疾病的途径。
关键字：基因敲除；Cre/LoxP系统；基因载体；生物模型1．概述：基因敲除又称为基因打靶, 是指从分子水平上将一个基因去除或替代, 然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法，是功能基因组学研究的重要研究工具。
是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿, 并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响, 成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和实践意义。
基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人马里奥•卡佩奇（Mario Capecchi）、82岁的美国人奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁•埃文斯（Martin Evans）分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
2.基因敲出技术发展历史80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
基因敲除方法和原理
基因敲除方法和原理标题：基因敲除方法和原理引言：基因敲除是分子生物学中常用的一种实验方法，通过破坏或删除目标基因，来研究该基因对生物体的功能和表型的影响。
本文将介绍基因敲除的方法和原理，以及其在基因功能研究和疾病治疗中的应用。
一、基因敲除的方法基因敲除的方法主要有两种：第一种是通过体细胞敲除，第二种是通过胚胎干细胞敲除。
1. 体细胞敲除体细胞敲除是在体细胞中敲除目标基因的方法。
其步骤主要包括：选择目标基因，构建敲除载体，将敲除载体导入体细胞，筛选敲除细胞，验证敲除效果。
（1）选择目标基因：根据研究的需要，选择一个具有重要功能或表型的基因作为目标基因。
（2）构建敲除载体：利用重组DNA技术构建含有目标基因敲除所需序列的敲除载体。
敲除载体通常包括两个关键元素：敲除片段和选择标记。
（3）将敲除载体导入体细胞：采用适当的方法，如转染或电穿孔等，将敲除载体导入体细胞中。
（4）筛选敲除细胞：利用选择标记，如抗生素抗性基因，筛选出成功发生基因敲除的细胞。
（5）验证敲除效果：通过PCR、Southern blot等方法验证基因敲除的效果。
2. 胚胎干细胞敲除胚胎干细胞敲除是在胚胎干细胞中敲除目标基因的方法。
其步骤主要包括：选择胚胎干细胞，构建敲除载体，将敲除载体导入胚胎干细胞，筛选敲除细胞，验证敲除效果。
（1）选择胚胎干细胞：选择具有胚胎干细胞特性的细胞作为研究对象。
（2）构建敲除载体：同样利用重组DNA技术构建含有目标基因敲除所需序列的敲除载体。
（3）将敲除载体导入胚胎干细胞：采用适当的方法，如电穿孔或病毒导入等，将敲除载体导入胚胎干细胞中。
（4）筛选敲除细胞：利用选择标记，如抗生素抗性基因，筛选出成功发生基因敲除的胚胎干细胞。
（5）验证敲除效果：通过PCR、Southern blot等方法验证基因敲除的效果。
二、基因敲除的原理基因敲除的原理是通过破坏或删除目标基因，使其无法正常表达或产生功能缺陷，从而观察其对生物体的影响。
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
基因敲除的原理
《基因敲除的原理》基因敲除可以说是基因组学、细胞分离培养以及转基因技术的组合。
那么基因敲除的原理是什么呢？基因敲除的方法有哪些呢？在此，做个小结，以供大家学习。
一.概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二.实现基因敲除的多种原理和方法：1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，**证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson**建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中*普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：①. 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②.ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，*常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
③.同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。