生物化学与分子生物学实验课讲义
(精)生物化学与分子生物学实验讲义
生物化学与分子生物学实验指导实验一维生素C的含量测定一、实验目的1.掌握碘量法测定维生素C的原理和方法；2.了解维生素C常用的含量测定方法。
二、实验原理维生素C又称抗坏血酸、系人体一种重要营养素。
为水溶性，主要存在于新鲜蔬菜、水果中(其中西红柿、鲜枣、山楂、辣椒、桔子中含量最多)。
其主要生理功能是：促进体内胶元蛋白及粘多糖合成;增加毛细血管壁致密性，减低其脆性与通透性;参加体内氧化还原反应;有解毒作用。
如缺乏维生素C可发生坏血病。
临床用于各种维生素C缺乏症、肝脏疾病、中毒等。
本试验是利用碘酸钾做氧化剂。
即在一定量的盐酸酸性试液中加碘化钾—淀粉指示剂，用已知浓度的碘酸钾滴定。
当碘酸钾滴入后即释放出游离的碘，此碘被维生素C还原，直至维生素C完全氧化后，再滴以碘酸钾液时，释放出的碘因无维生素C的作用，可使淀粉指示剂呈蓝色，即为中点，其反应如下：KIO3 + 5KI + 6HCl→6KCl + 3H2O + 3 I2三、实验材料柑橘或辣椒、研钵、天平、2%盐酸、0.5%KI、0.001N KIO3、1%淀粉溶液、蒸馏水、100mL容量瓶、纱布、50mL烧杯、移液管、滴定管四、实验方法（一）样品液的制备将柑橘或辣椒样品先纵切为4-8等分，除去不能食用部分，切碎，取20g作分析用。
将称取的样品放入研钵中，加2%的盐酸5-10mL，研磨至呈浆状，小心无损地移研钵中样品于100mL容量瓶中，研钵用2%盐酸液冲洗后，亦倒入量瓶中，并加2%盐酸至100mL，充分混合，用清洁干燥二层纱布过滤入干燥的烧杯中，滤液作测定用。
（二）样品液的分析在50mL的烧杯中，用移液管注入0.5%的KI溶液1mL，1%淀粉液1mL，以及上述制得的试液5mL；再加蒸馏水至总体积10mL。
用0.001N KIO3溶液滴定，要一滴一滴加入，并时时摇动烧杯，至微蓝色不褪为终点（一分钟不褪为止）。
记录所用KIO3溶液毫升数。
同上法再测定3次，取各次测定的平均值，按下式计算维生素C含量。
生物化学与分子生物学PPT课件讲义
中国的炼金术随丝绸之路传到了阿拉伯文化圈, 所以有了alchemy这个行业。
西腊文明在欧州历史上曾一度失传, 幸好阿拉伯人继承了其精华(7~14世纪), 11~13 世纪十字军的侵略将散落在阿拉伯文化中的希腊文化又带回了欧洲, 也顺便将中 国的炼金术带进入了西方文明。此后，西方的炼金术活动朝着独自的方向发展， 特别是对酸, 碱, 盐等物质的化学性质有了相当的知识积累。
复杂性 组成物质多；分子大；空间 结构复杂。
规律性 元素→构件小分子→聚合物 （生物大分子）； 结构与功能相适应。
（二）物质和能量代谢
复杂性
• 多步化学反应构成代谢途 径；
• 多条代谢途径相互交织成 网；
• 物质代谢和能量代谢相互 交织；
• 调节控制有条不紊。
规律性
• 反应类型不多；
• 反应机理符合有机化学理 论；
Waston-Click提出DNA 双螺旋模型 1958年 Perutz等解明肌红蛋白的立体结构 1970年 发现了DNA限制性内切酶 1972年 DNA重组技术的建立 1978年 DNA双脱氧测序法的成功
… 1990年 人类基因组计划的实施,2003年完成,进入
后基因组时代
生物化学中的关键技术
《生物化学与分子生物学实验》实验教学大纲
《生物化学与分子生物学实验》实验教学大纲课程名称：生物化学与分子生物学实验课程类别：必修课适用专业：生态学所属实验室：生物化学实验学时、学分：32学时1学分―、实验教学目的《生物化学与分子生物学实验》是和《生物化学与分子生物学》课程同时开设的实验课程，是理论教学的深化和补充，具有较强的实践性，是一门重要的技术基础课，可作为生物技术、生物科学、生态学专业学生的必修课。
通过实验教学，观察某些生化与分子生物学反应现象，使学生巩固和加深对生物化学与分子生物学基本知识和基本理论内容的理解，掌握生化与分子生物学实验的基本操作、实验原理及相关仪器的使用。
通过实践进一步培养学生的科学实验技能与严谨的科学态度，学生通过准确记录、科学分析并作出实事求是的实验报告能够加强提高自身观察问题、分析问题和解决问题的能力及设计和创新能力的培养。
二、实验教学要求本实验课程是生命科学本科实验教学的一个重要组成部分，在实验过程中要求学生自己动手，独立观察并完成实验报告，注重培养学生创新思维与能力。
实验通过学习滴定，比色，层析，电泳、PCR等生化与分子生物学相关基础实验技术，以及实验方法，操作技术，仪器的使用，来分析生物体中糖，蛋白质，核酸，酶等生化物质及代谢过程，培养学生具有初步的科学使用能力及严格的科学作风，掌握基本的生化与分子研究技能为深入各学科研究打下良好基础。
三、对学生的指导和要求（一）实验内容的安排实验课程内容涵盖了验证性实验、综合性实验，设计性创新性实验，在加强学生基本实验技能训练的同时通过设计创新性实验锻炼学生自己查找资料并结合所学基本知识进行实验设计，增加学生自身科研主动性，实验设置能够很好的培养学生的科研素养及动手能力。
(二)学生任务经过多层次的训练后，学生应达到下列要求：1•进一步巩固和加深对生物化学基本知识的理解，掌握生物化学实验的基本知识和基本操作技能。
如生物化学分离、制备、分析和鉴定技术。
2•提高观察问题、分析问题和解决问题的能力。
生物化学与分子生物学实验课讲义
实验一SDS碱裂解法小量制备质粒一、实验目的1．掌握SDS碱裂解法小量制备质粒的原理和方法。
2．掌握高速离心机、微量移液器等常规仪器的正确使用。
二、实验原理对培养的含有大量质粒的菌液，离心收集菌体，用含一定浓度葡萄糖的缓冲液悬浮菌体，采用碱性SDS裂解细菌的细胞壁，使质粒缓和释放出来。
同时整个溶液的pH为12-12.5，使断裂成线性细菌染色体DNA变成单链、相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上，当液体的pH 调至中性并有高浓度存在下，大部分蛋白质和细菌染色体形成沉淀，而共价闭环质粒DNA 仍为可溶状态，离心获得含有大量质粒上清液，用RNA酶A处理除去RNA，用苯酚氯仿除去残留蛋白质，再利用核酸不溶于有机溶剂的性质，从而使其在适当浓度的亲水性有机溶剂中（乙醇、异丙醇、PEG8000）沉淀析出。
三、材料、试剂和仪器1．试剂GT116（含psiRNA质粒）菌种LB液体培养基溶液I、溶液II、溶液III、无水乙醇、氯仿、异戊醇、Tris饱和酚、RNA酶A、TE、STE、卡那霉素（配方见附录）2．仪器和材料超净台、高速离心机、微量移液器、灭菌eppendorf管和tips、37℃摇床、旋涡混匀器四、实验操作步骤1．在超净台内从平板上挑取单菌落或用以其它方式保存的菌种接种于3ml LB培养基，在37℃培养15-18个小时。
2．向1 个2ml的离心管里加约1.5ml的菌液。
不要把菌液溅出造成污染。
3．10000 rpm离心2分钟。
注意离心机上放置的管重力要平衡，保护离心机。
4．弃上清液于废液瓶中。
5．重复离心一次，尽量弃去上清。
6．加入100ul冰冷的溶液I，然后剧烈振荡混匀，置冰上。
7．加入200ul溶液II，轻柔混匀，置冰上4分钟。
8．加入150ul冰冷的溶液III，轻柔混匀，置冰上5分钟。
9．12000 rpm离心5分钟。
把上清液转移到另一1.5ml离心管中（约450ul）。
10．加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混合液，剧烈振荡，12000 rpm离心2分钟，小心的收取上层溶液（约450ul）于另一1.5ml离心管中。
生物化学和分子生物学课程教学大纲全文
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《生物化学》和《分子生物学》课程实验教学大纲
课程名称：生物化学与分子生物学实验技术
英文名称：Experiment Technology of Biochemistry and Molecular Biology
课程编号：实验课性质：必修
课程负责人：崔行开放实验项目数：3
一、学时、学分
课程总学时：70 课程总学分：
二、适用专业及年级
本大纲适用于医疗、公共卫生、口腔、护理、预防医学七年制学生。
三、实验教学目的与基本要求
掌握人体生命的物质基础，生物大分子的结构和功能。
掌握各种生物物质能
量的正常代谢过程，代谢调节，代谢障碍和临床疾病的关系。
通过实验掌握基本
的生物化学实验技术及验证部分课堂理论知识。
在实验教学中，要求学生掌握电泳技术、层析技术、分光光度法、离心技术、
蛋白质及分子生物学等技术。
掌握蛋白质、核酸、酶类的提取、测定，学习血液
成分生化测定，以及部分生物化学理论知识的验证。
掌握紫外—可见分光光度计、
高速离心机、PCR仪、层析系统、电泳仪系统、电热恒温水浴箱、凝胶扫描仪、
电动匀浆器等仪器的使用，了解其性能、适用范围及注意事项。
四、主要仪器设备
紫外—可见分光光度计、高速离心机、PCR仪、层析系统、电热恒温水浴箱、
凝胶扫描仪、电泳仪、电动匀浆器等。
生物化学与分子生物学技术实践课件
泡、漂洗 ② 压榨、过
① 粉碎、干燥 ②萃取、过滤 ③浓缩适用
命题设计
返回
滤、静置
③再次过滤
要点探究
基础回扣
考点二
适用 范围
从生物材料中提取某些特定成分
适用于提取玫瑰 油、薄荷油等挥 发性强的芳香油 适用于柑 适用范围广，要求原 橘、柠檬等 料的颗粒要尽可能细 易焦糊原料 小，能充分浸泡在有 的提取 生产成本 机溶剂中
解析
对于几种球蛋白来说直径相差不大，引起泳动速度的差异 主要来自于所带电荷多少，由图可知球蛋白由右向左泳 动，因右侧为负极，且 γ球蛋白距点样处最近，所以 γ球 蛋白所带负电荷最少。
答案 D
考点一
基础回扣
要点探究
命题设计
返回
考点一
蛋白质的分离与纯化技术
( C )
2.关于蛋白质提取的叙述中，不正确的是
优点
简单易行，便于 低，易保持 分离 原料原有的 结构和功能
出油率高，易分离
局限 性
考点二
水中蒸馏会导致 分离较为困 使用的有机溶剂处理 原料焦糊和有效 难，出油率 不当会影响芳香油的 成分水解等问题
基础回扣
相对较低
要点探究
质量
命题设计
返回
考点二
从生物材料中提取某些特定成分
易错警示
(1)植物芳香油的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、压榨法、萃取 法。水蒸气蒸馏是植物芳香油提取的常用方法，但会导致原料 焦糊或有效成分水解等，若植物有效成分易水解，则不宜采用 此法。玫瑰精油、橘皮精油、胡萝卜素的提取分别采用水蒸气 蒸馏法、压榨法、萃取法。 (2)水蒸气蒸馏可用明火加热，萃取过程应该避免明火加热，采
考点一
基础回扣
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实验一SDS碱裂解法小量制备质粒一、实验目的1．掌握SDS碱裂解法小量制备质粒的原理和方法。
2．掌握高速离心机、微量移液器等常规仪器的正确使用。
二、实验原理对培养的含有大量质粒的菌液，离心收集菌体，用含一定浓度葡萄糖的缓冲液悬浮菌体，采用碱性SDS裂解细菌的细胞壁，使质粒缓和释放出来。
同时整个溶液的pH为12-12.5，使断裂成线性细菌染色体DNA变成单链、相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上，当液体的pH 调至中性并有高浓度存在下，大部分蛋白质和细菌染色体形成沉淀，而共价闭环质粒DNA 仍为可溶状态，离心获得含有大量质粒上清液，用RNA酶A处理除去RNA，用苯酚氯仿除去残留蛋白质，再利用核酸不溶于有机溶剂的性质，从而使其在适当浓度的亲水性有机溶剂中（乙醇、异丙醇、PEG8000）沉淀析出。
三、材料、试剂和仪器1．试剂GT116（含psiRNA质粒）菌种LB液体培养基溶液 I、溶液 II、溶液 III、无水乙醇、氯仿、异戊醇、Tris饱和酚、RNA酶A、TE、STE、卡那霉素（配方见附录）2．仪器和材料超净台、高速离心机、微量移液器、灭菌eppendorf管和tips、37℃摇床、旋涡混匀器四、实验操作步骤1．在超净台内从平板上挑取单菌落或用以其它方式保存的菌种接种于3ml LB培养基，在37℃培养15-18个小时。
2．向1 个2ml的离心管里加约1.5ml的菌液。
不要把菌液溅出造成污染。
3．10000 rpm离心2分钟。
注意离心机上放置的管重力要平衡，保护离心机。
4．弃上清液于废液瓶中。
5．重复离心一次，尽量弃去上清。
6．加入100ul冰冷的溶液I，然后剧烈振荡混匀，置冰上。
7．加入200ul溶液II，轻柔混匀，置冰上4分钟。
8．加入150ul冰冷的溶液III，轻柔混匀，置冰上5分钟。
9．12000 rpm离心5分钟。
把上清液转移到另一1.5ml离心管中（约450ul）。
10．加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混合液，剧烈振荡，12000 rpm离心2分钟，小心的收取上层溶液（约450ul）于另一1.5ml离心管中。
11．加入等体积氯仿：异戊醇，剧烈振荡，12000 rpm离心2分钟，小心的收取上层溶液（约400ul）于另一1.5ml离心管中。
12．2倍体积（800ul）－20℃预冷的无水乙醇，置冰上10分钟，沉淀质粒DNA。
13．12000 rpm离心5分钟，弃上清14．用1ml 冰预冷的70％的乙醇洗沉淀，轻轻转动离心管，15．12000rpm离心1分钟，弃上清液。
16．室温干燥沉淀。
加入50ul TE（含20ug/ml RNA酶A）溶解质粒， -20℃保存。
五、质粒相关知识质粒是细胞染色外一种双链环状DNA分子，它随寄主细胞稳定遗传。
对于质粒的研究始于1946年，美国科学家Lederberg.J.首先研究了细菌的性因子（F因子），随后科学家们又相继发现了细菌的抗药性因子（R因子），大肠杆菌素因子（CoE）等，并对这些染色体外遗传单位的性质、功能及与宿主的关系进行了的深入的研究，为建立第一批重组DNA载体提供了科学的材料。
质粒DNA在细菌中的复制分为严紧型（stringent control）和松弛型（relaxed control）。
严紧型质粒的复制要在蛋白合成时和DNA聚合酶的III存在，只随染色体的复制而复制，其拷贝数少，每个细胞中只有1-10个；松弛型质粒的复制需要使用的是DNA聚合酶Ⅰ，它在细胞生长周期中随时可以复制，每个细胞中有10-200以上个拷贝。
为了便于基因克隆，作为载体的质粒特点如下：1．是一个复制子，能自我复制。
使它携带的目的基因得到大量扩增。
2．分子量小（相对分子质量一般在106-107），拷贝数要高，便于应用（如便于提取、基因克隆、酶切鉴定、细胞转化、原位杂交等）。
3．至少要有两个便于选择的遗传标记，其一用于检查外源DNA是否插入到质粒中，例如载体中引入的LacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个146个氨基酸的α-肽，可以被IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导合成，新合成的肽能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，该酶能够水解X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚，使含X-gal的培养基中生长的菌落为蓝色。
若有外源DNA插入LacZ中，因不能合成正确的α-肽，转化或转染的Lac缺陷菌株，用X-gal筛选，含阳性无隆载体的菌落为白色，含空载体的菌落为蓝色；其二用于选择已把载体转化到细菌中的菌落，如氨苄青霉素抗性基因（Amp r），只有已转化含有质粒的重组菌在Amp培养基中才能生长。
4．有多个单一的酶切位点，起点在某个遗传标记上，便于基因克隆，鉴定。
提取的质粒多数以超螺旋型存在，超螺旋的DNA中一个螺旋由10个碱基形成，若一个螺旋大于或小于19个碱基时，分子内就产生一种力量，外于不稳定状态，当分子上有一个缺刻时，分子会立即松驰，形成开环分子。
一般超螺旋型质粒应占到总量70％。
否则反思你的每步操作是否正确。
六、思考题1．分离纯化核酸（质粒DNA）应遵循那些原则（或注意那些事项）？2．溶液I、溶液II、溶液III、酚、氯仿、无水乙醇、等主要试剂各有何作用？实验二分光光度法测定DNA的浓度和纯度一实验目的1. 掌握分光光度法估算样品中DNA的浓度和纯度。
2. 熟悉紫外分光光度计的使用方法。
二实验原理DNA和RNA吸收光谱的最大值位于260nm，因此可以通过测定OD260来计算样品中DNA和RNA 的浓度，一个OD值相当于约50μg/ml的双链DNA、40μg/ml的单链DNA和RNA以及33μg/ml的单链寡核苷酸。
利用260nm和280nm两处读数的比值（OD260:OD280）可以估算核酸的纯度。
三材料、试剂和仪器1．仪器：美谱达UV-3100紫外分光光度计2．试剂：待测质粒DNA溶液四、实验步骤1．打开外部电源主机电源。
2．仪器自检当打开仪器电源时，仪器便进入自检程序，预热15分钟，自检各项都“OK”后，进入选择工作方式界面。
3. 选择菜单第五项“DNA/蛋白质测量”4. 按F2键选择测量方法。
“吸光度差1”模式或“吸光度差2”模式被选定后，再选择是否“测量背景”。
“吸光度差1”模式测量波长为260nm和280nm，背景波长320nm；“吸光度差2”模式的测量波长为260nm和230nm，背景波长为320nm。
3．光度测量未知DNA、RNA浓度的测定：（1）选择“吸光度差1”模式（3）校零在样品池中放入参比溶液（1×TE），按【0Abs/100％T】键，仪器进行自动校零，校完后取出参比溶液。
（4）测量将取出的参比溶液倒掉，换上样品溶液，放入样品池内，按START 即可测量样品吸光度值。
若有多个样品要测试，只需再按TART 即可。
注意：仅在吸光度为0～1之间时，吸光度值和DNA浓度才有良好的线性关系。
小量制备的质粒DNA浓度一般约为几ug/ul，因此需要稀释约100倍进行测量。
如果浓度仍超过测量范围，需要继续稀释。
每次至少需向微量比色皿中注入400ul溶液才可准确测量。
4. 结果计算（1）依据下式计算DNA的浓度：A260×50×稀释倍数＝样品浓度（ug/ml）（2）计算比值：A260/A280=DNA的吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的吸收高峰为280nm。
纯DNA A260/A280为1.8，纯RNA A260/A280为2.0。
A260/A280小于1.8，则表明样品中混有较多的蛋白质。
若A260/A280接近2.0，则表明样品中含有较多RNA。
实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳分析一．实验目的1．学习掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理和方法及其运用。
二．实验原理由于DNA结构的重复性，核苷酸数相同的DNA几乎具有等量的净电荷，所以核酸携带的电荷的差异几乎不造成对核酸迁移率的差异，而真正决定DNA分子在某一特定电场下的电泳迁移率因素取决于DNA分子的大小、构象、构型。
采用适当浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使大小、构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，以达到分离的目的。
三．材料、试剂和仪器1．质粒DNA、细菌基因组DNA2．琼脂糖、6×Loading Buffer、DNA分子量marker、溴化乙啶（EB）3. 仪器：琼脂糖凝胶电泳系统、紫外透射仪、数码相机四．实验步骤1．凝胶的制备（1）配0.7%的胶：称取0.21g的琼脂糖，置于三角瓶中，加入1×TAE 30ml，盖上铝箔纸，放在微波炉中化胶，注意用中低火（约1～2分钟），避免沸腾和溢出。
（2）轻旋转三角瓶把胶混匀，使胶的温度冷却至50℃—60℃。
（3）正确安装制胶模及梳子。
（4）将琼脂糖溶液倒入胶模中，并防止梳子的齿下或齿间及凝胶中产生气泡。
（5）室温静置约30分钟，使胶能完全凝固。
轻轻拔出梳子，把胶放入调好水平、装有适量缓冲液的电泳槽内，待用。
2．电泳（6）在透明胶带纸上分滴6×的上样缓冲液1微升/滴，然后于5微升DNA液混匀，加入到上样孔上（用微量移液器的tip头插入1mm深处，轻轻推进样品，可以看见样品下沉）。
同时上标准DNA分子量Marker。
（7）盖上电泳槽并通电1～5V/cm，使DNA向阳极移动。
当指示剂泳动至胶的另一端就可停止电泳。
（8）切断电流，取出凝胶，将胶浸入0.5μg/ml的EB溶液中10分钟，取出后用水漂洗2分钟，在紫外透射仪下检查凝胶并摄影。
注意：EB是强烈的诱变剂，须小心处理。
五．思考题1. 哪些因素会影响核酸在琼脂糖凝胶中的泳动？实验四 CTAB法小量制备大肠杆菌基因组DNA一．实验目的1．掌握用CTAB法小量制备大肠杆菌基因组DNA2．了解基因组DNA的其它提取方法二．实验原理CTAB是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液里，CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA。
本实验用SDS破碎细胞，利用蛋白酶K消化蛋白，CTAB沉淀多糖，再经加热使蛋白变性与DNA分离，经酚氯仿抽提后，乙醇沉淀核酸，得到总DNA。
三．材料、试剂和仪器1．大肠杆菌G1162． TE（pH8.0）、CTAB、蛋白酶K、NaCl、氯仿6．无水乙醇8．仪器: 高速离心机、微量移液器、灭菌eppendorf管和tips、37℃摇床、四．实验步骤1．取1.5ml菌液于2ml离心管，10000rpm离心2min，倒去上请，重复该步骤一次。