SRY基因在性别鉴定中的应用
SRY基因在性别决定中的作用及例题分析
SRY基因在性别决定中的作用及例题分析决定人性别的并非性染色体。
其实，是由染色体上的基因这个发现来自所谓的“性别反转人”：有些人的性染色体明明是XY，却是女性，而一些xX型的人却是男性。
研究发现，一个XY型女性的Y染色体上有些地方缺失，其中缺失的区域含有一个基因，如果这个基因发生了突变，XY型的人也会变成女性。
而如果含有这个基因的Y染色体片段被转移到了X 染色体上，XX型的人就会成为男性。
这些现象说明，这个基因就是决定受精卵是否发育为男性的基因。
Y染色体上含有这个基因的区域叫做Y染色体性别决定区(简称SRY)，这个基因也就叫做SRY基因。
近一步的研究发现，许多哺乳动物(包括有胎盘哺乳动物和有袋类哺乳动物)都有SRY基因，所以SRY 基因是许多哺乳动物的雄性决定基因。
SRY基因不是直接导致雄性特征的发育的，而是通过由多个基因组成的性别控制链起作用。
SRY基因的产物先活化SOx9基因，SOx9基因的产物又活化FGF9基因，然后再活化DMRT1基因。
这个性别控制链上的基因会抑制卵巢发育所需要的基因的活性，使得受精卵向雄性方向发展。
如果没有SRY基因（即没有Y染色体），受精卵中其他的一些基因就会活跃起来，其产物促进卵巢的生成。
所以男女性别的分化是两组基因相互斗争的结果。
例题：人类的性别主要由Y染色体上的SRY基因决定，通过男性生殖器官和第二性征表现出来。
（1）男性体细胞中性染色体的同源配对区与特异区示意图如图1所示。
①SRY基因可能位于图1中的特异区。
②请在绘图处的方框内，绘制出X、Y染色体减数第一次分裂联会时的图像。
（2）在某家庭中发现一名性染色体组成为XX的男性，研究人员同时检测了此家庭成员的性染色体组成和红细胞表面Xg抗原（由X染色体上的基因A/a控制）的存在情况，具体如图2.由图2分析，红细胞表面Xg抗原是由性基因控制的，Ⅲ-2父母的基因型是，图中Ⅲ-2的Xg抗原表现型与预期（填“相符”或“不相符”）。
SRY基因研究进展及其在动物性别鉴定中的应用_孙伟丽
专论 综述
Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｖｏｌ．１６ Ｎｏ．３ ２００８
Ｓ ＲＹ 基因研究进展及其在动物
性别鉴定中的应用
孙伟丽， 李光玉， 钟 伟， 常忠娟
（ 中国农业科学院特产研究所， 吉林 吉林 １３２１０９）
全称是 Ｙ 染色体性别决定区， 是哺乳动物雄性的性别 决定基因， 是 Ｙ 染色体上决定生物雄性性别的基因片 段。ＳＲＹ 基因是睾丸决定因子（ ｔｅｓｔｉｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ） 的最佳候选基因， 已经得到很多试验的证实。ＳＲＹ 基因 普遍存在于哺乳动物 Ｙ 染色体中， 但位置、大小、结构 等不尽相同。ＳＲＹ 基因的检测可以做到特异而快速地 判 定 性 别 结 果 。 ＳＲＹ 基 因 最 早 于 １９９０ 年 首 先 由 Ｓｉｎｃｌａｉｒ 等 从 人 类 Ｙ 染 色 体 上 分 离 出 来 ， 并 且 经 过 Ｋｏｏｐｍａｎ 等通过转基因小鼠证实。Ｋｏｏｐｍａｎ 等将含有 ＳＲＹ 基因的 ＤＮＡ 片段（１４ ｋｂ）移植给 ＸＸ 鼠体内， 小鼠 发育为雄性， 这一实验结果揭示了动物性别控制的根 本途径。当该基因有突变、缺失和易位等均可导致性反 转或生殖器发育异常。从发现 ＳＲＹ 基因至今不到 ２０ 年的时间里， 生物学研究学者关于该基因开展了多方 面的研究， 取得了很大的进展。 ２ ＳＲＹ 基因克隆研究现状
原理是从早期胚胎取下少量细胞， 将其 ＤＮＡ 与 Ｙ 染色体特异性标记的 ＤＮＡ 序列杂交， 阳性为雄性胚 胎， 阴性为雌性胚胎。用于检测的 ＤＮＡ 探针方法有两 种：荧光原位杂交法（ＦＩＳＨ）和 ＤＮＡ 探针提取物结合法， ＦＩＳＨ 可以直接利用荧光标记的 Ｙ 染色体特异性 ＤＮＡ 序列与待测细胞杂交， 在荧光显微镜下观察， 阳性为雄 性， 阴性为雌性。ＦＩＳＨ 包括荧光素探针制备、探针与靶 ＤＮＡ 的变性及杂交、观察鉴定 ３ 个步骤。ＤＮＡ 探针法 准确率达 ９５％ 以上， 与 其 他 方 法 相 比 ， 具 有 高 效 快 速 和错误率低的优势， 在实践中也取得了较好的效果。 Ｌｅｏｎａｒｄ 等首次鉴定牛囊胚获得成功， 准确率为 ９５％ ， Ｔａｔｓｕｏｋａｗａｒａｓａｋｉ 等报道， 用双探针标记 ＦＩＳＨ 准确鉴 定精子染色体。 ３．２ ＰＣＲ 反应法
怎样用基因进行性别鉴定
怎样用基因进行性别鉴定人的性别可以在不同层次中划分出6种性别根据视角不同，性别可以在6个不同层次中进行划分，它们分别是：基因性别、染色体性别、性腺性别、生殖器性别、心理性别和社会性别：1.基因性别基因层面上，一般把SRY基因作为性别确定基因，即具有SRY基因，则发育成男孩，不具有SRY基因，则发育成女孩。
研究发现，其实SRY只是影响性别发育的诸多基因之一，目前已经发现十余种与性别发育相关的基因，它们分别从不同的发育阶段对胎儿的性征发育进行调控。
任何阶段出现问题，均会引起性发育异常，使孩子出生后表现为性征模糊现象。
2.染色体性别在染色体层面上，人类具有23对46条染色体，其中22对44条染色体被称为常染色体，主要调控身体的发育，而与性别发育相关的被称为性染色体，通常用“X”和“Y”来表达。
正常男性的性染色体的核型表现为：46，XY；正常女性的性染色体的核型表现为：46，XX。
一般认为，在人类胚胎的染色体中如果存在Y染色体，就发育成男孩；如果缺乏Y染色体，则发育成女孩。
但有些人由于性染色体数目或结构的变化，表现为性发育异常，如性染色体的核型为45，XO ，就表现出女性发育不良；再如染色体的核型为48，XXXY ，就表现为男性发育不良等。
当然，常染色体对性别发育也有一定的影响，只是它们对全身发育的影响较大，鉴定性别一般不太考虑。
3.性腺性别性腺性别主要是指宝贝的性腺组织的构成。
性腺是宝贝性激素合成的主要位置，而性激素则是调控性征发育的主要信使。
因此，性腺出现异常就会影响到宝贝的性征。
男孩的性腺为睾丸组织，女孩的性腺为卵巢组织，性腺组织异常必然会导致性征的异常。
在医学临床上，人们实际上主要依据性腺组织的特点对宝贝的性别进行划分。
性腺为睾丸时，不论外阴的外形如何，均划分为男孩，如果外阴形态接近女孩，则称为男性假两性畸形；性腺为卵巢时，则划分为女孩，如果外阴像男孩，称为女性假两性畸形。
只有性腺中同时包含卵巢和睾丸组织时，才称为真两性畸形。
SRY基因及其性别决定
动物学报 47(专刊):241～246,2001A cta Zoologica S i nica SR Y 基因及其性别决定郭亚平① 贺艳萍① 张红梅② 马恩波①3(①山西大学生命科学系,太原030006)(②清华大学结构生物学实验室,北京100084)摘 要 对近十年来关于脊椎动物尤其是哺乳动物的SR Y 基因及其性别决定机制的研究进展作了简要的综述。
扼要阐述了哺乳动物的SR Y 基因的结构、转录、表达及其在性别决定中的作用模式及相关的基因家族。
关键词 SR Y 基因 性染色体 性别决定 SOX 基因3通讯作者 E 2mail :maenbo @ 第一作者简介 郭亚平,男,45岁,讲师。
研究方向:分子进化生物学。
性别决定是胚胎发育时期一个尚未分化的胚胎性腺确定发育为睾丸或卵巢的过程。
早在40年代,通过对兔子胚胎(生殖腺刚开始分化)去势实验的研究(Jost et al .,1973),确定了哺乳动物的性别决定和性别分化的概念。
他观察到所有的胚胎(无论是XX 或XY 核型)都有雌性内生殖脊而没有沃尔夫氏管的发育,所以得出结论:睾丸通过产生某种物质诱导沃尔夫氏管的发育,同时抑制穆勒氏管的发生。
这些早期研究表明卵巢对于穆勒氏管的分化并非必须。
因为去除未分化的哺乳动物胚胎的性腺导致雌性内生殖管道和外生殖器的发育,所以,性别决定等同于睾丸决定。
人类的睾丸产生所有表现雄性外部特征所必须的激素,谢尔托立氏细胞分泌抗穆勒氏管因子,抑制穆勒氏管的发生:来迪希氏细胞分泌睾酮,诱导沃尔夫氏管的发育及雄性生殖器管的形成。
哺乳动物的睾丸决定依赖于Y 染色体的存在,XO 型的小鼠和XO 型的人并不发育出睾丸组织,而XXY 型的人和小鼠也并不因为X 染色体数目多而发育为雌性,相反,它们有睾丸的发生。
这意味着Y 染色体的存在决定了睾丸的发生,从而也决定了其性别的分化。
分子水平的研究表明:在Y 染色体上某一位点基因的表达,直接诱发未分化的胚胎性腺发育为睾丸,胚胎发育为雄性。
利用SRY基因和微卫星标记鉴定反刍动物性别
摘 !要! 以反刍动物为研究对象 $ 应用多重 N O 技术扩增绵羊基因组中 P* Q 染色体上的 D 个微卫星标记和 ( # /基 因 $根据基因型进行性别鉴定 $ 试图通 过 一 次 R / S 扩 增 同 时 提 供 性 别 鉴 定 和 基 因 分 型 的 信 息(结 果 表 明 所 设 计 是性别鉴定的 主 要 依 据 $ 而 Q染色体上的 0 ( # / 基因的引物具有高度特异性 $ 1 0# ( "* 0 ’ 2 D (两标记由于特异性 不好 $ 因此不适用于性别鉴定 $ 对于 P 染色体上所选的两标记 0 % 3 T E A & %和 ’ " ! ( 只能进一步验证所鉴定的雄性个 能同时扩增 出 ( 且 P染 体 ( 得出结论在被检个体中 $ # / 基 因* 0 1 0# ( "* 0 ’ 2 D ($ P染色体上 0 % 3 T E A & %和 ’ " ! ($ 色体上的 0 被检个体中只有 Q染色体上 0 % 3 T E A & %* ’ " ! ( 基因型为纯合 子 的 个 体 为 正 常 的 雄 性 ) 1 0# ( "* 0 ’ 2 D ( 和 P 染色体上 0 而没有 ( 则 被 检 个 体 为 雌 性$ 且0 % 3 T E A & %* ’ " ! ( 的 扩 增 产 物$ # / 基 因 的 扩 增 产 物$ % 3 T E A & %*
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SRY基因研究进展及其在动物性别鉴定中的应用
Ｓ Ｙ基 因研 究进 展 及 其在光玉 ， 李 钟 伟 ， 忠娟 常
吉林 １２ ０ ） ３ １ ９ （ 中国农业科学院特产研究 所 ， 吉林
摘
要 ：Ｒ Ｓ Ｙ基 因是 哺乳动 物雄 性 的性别 决 定基 因。研 究发现 Ｓ Ｙ基 因的启 动 能够促 进雄 性发 育 ， Ｒ 从
即性 染色 体决 定性 腺 发育 ， 和次级 域 ，杨其 沅 等对 牦牛 Ｓ Ｙ和 Ｔ Ｏ基 因部 分序 列 进 行 包括 初级 性 别决 定 ， Ｒ Ｒ
克隆 与测 序分析 。赵雪 等研 究 了牛 Ｓ Ｙ基 因的克 隆与 性别 决定 ， 随 ｌ腺 分化 ， Ｒ 即 生 由其产 生 的激 素诱 导体 细胞 测序 ， 隆 出长度 为 ２７ ３ ｐ的 牛 Ｓ Ｙ基 因 。裴杰 等 分化 ， 终发育 成雄 性或 雌 Ｉ 克 １ ｂ Ｒ 最 生。 发表论 文 “ 国荷斯 坦 牛 Ｓ Ｙ基 因编 码 区的克 隆 与原 中 Ｒ 家 畜早 期胚 胎 的性别 鉴 定是 家 畜胚 胎移 植 的重要 对 核 表达 ” ，结 果表 明 Ｓ Ｙ基 因编码 区长 ６ ７ｂ ，编码 内容 ， 实 现动物 性别 的人 为控制 具有 重要 意义 。近年 Ｒ ８ ｐ ２９个氨 基酸 。付强 等对 水牛 Ｓ Ｙ基 因进 行 了克 隆及 来 随着 性别 鉴定 技 术 的不断 发展 ，出现 了许 多 鉴定 方 ２ Ｒ 应用 于 哺乳动 物早期 胚 胎性别 鉴定 。 主要 有细胞 遗 序 列分 析 ， 并且 用 Ｂ Ａ Ｔ与 牛属 动 物 Ｓ Ｙ基 因 比对 ， 法 ， ＬＳ Ｒ 免 结果 显示 同源性 为 ９ ％ 。帅丽 芳等 发表 论文 “３１ ６ １／７罗 传 学方 法 、 疫学 方法 和分 子生物 学方 法 。随着 分 子生 物学 的发 展 ，特 别 是 ２ 纪 ９ ０世 ０年 代 Ｓ Ｙ基 因 的发 Ｒ 收稿 日期 ：０ ８ ０ — ５ ２０ — ２ ２
sry基因序列
sry基因序列Sry基因序列是位于人体Y染色体上的一段基因序列，它在性别决定中起着重要的作用。
本文将介绍Sry基因序列的功能、结构以及与性别决定相关的研究进展。
一、Sry基因的功能Sry基因全称为Sex-determining Region Y gene，是决定胚胎性别的关键基因。
Sry基因的主要功能是在胚胎发育过程中促使胚胎发育为雄性。
它通过编码SRY蛋白来实现这一功能。
SRY蛋白是一种转录因子，可以影响其他基因的表达，从而调控性别分化的过程。
二、Sry基因的结构Sry基因位于Y染色体的短臂上，包含一个编码区和调控区。
编码区是指编码SRY蛋白的部分，调控区是指负责调控Sry基因的表达的部分。
编码区包括多个外显子和内含子，其中外显子1和外显子2是编码SRY蛋白所必需的部分。
调控区包括启动子、增强子和转录因子结合位点等。
三、Sry基因与性别决定的关系Sry基因在性别决定过程中起着核心作用。
在人类和许多其他哺乳动物中，只有XY型的个体才会表达Sry基因。
当Sry基因表达时，它会激活一系列与雄性发育相关的基因，从而导致胚胎发育为雄性。
相反，如果没有Sry基因的表达，胚胎会发育为雌性。
因此，Sry 基因的存在与否决定了胚胎的性别。
四、Sry基因的研究进展对Sry基因的研究有助于我们更好地理解性别决定的机制。
科学家通过对不同物种中Sry基因的比较研究，发现Sry基因在进化过程中高度保守。
此外，研究人员还发现Sry基因突变可能导致性别发育异常，如46,XY性别逆转综合征。
近年来，随着基因测序技术的不断发展，人们对Sry基因进行了更深入的研究。
研究人员发现Sry基因在性别决定过程中并不是唯一的关键基因，还有其他基因与之相互作用，共同调控性别分化。
这些研究为我们进一步了解性别决定提供了新的线索。
总结：Sry基因序列在人类和其他哺乳动物的性别决定中起着至关重要的作用。
它通过编码SRY蛋白来调控雄性发育的过程。
Sry基因的结构复杂，包含编码区和调控区。
Sry基因和Y染色体重复序列在牛早期胚胎性别鉴定中应用效果的比较
ｐ ｒｎａｅｅｃｕｉｎＪ． ｉ Ｇ ｎ ｔ ９ ７２ ：９ — ０ ． ａｅ ｔｇ ｘｌｓｏ ［ Ａｎｍ． ｅ ｅ． ９ ，８３７ ４ ０ ］ ，１
ｓｃｅｓｉ ａｅｎｔ ｓｉｎ ｎ［］Ｍｏ． ｏ．２０ ． ６１ ９ ０ ｕ ｃｓ ｎｐｔｒｉ ａｓ ｍｅｔ ｙ ｇ Ｊ １Ｅｃ１ ０ ７ １ ：０ ９ １ ６ ． １
３甘肃 农 业大 学动 物科 学技 术 学院 ， ． 兰州 ７ ０ ７ ； ． ３ ０ ０ ４甘肃 农业 大 学动 物 医学院 ， 兰州 ７ ０ ７ ） ３ ０ ０
中图分类 号 ：８ ３３ 文 献标 识码 ： 文 章编 号 ：０ ４ ４ ６ （０ １ １ — ０ ５ ０ ￥２－ Ａ １ ０ — ２ ４ ２ １ ）６ ０ ０ — ３
２Ｂ ｉ ｇＤ ｉ ａ ｌ Ｃ ｎｅ， ｅ ｉｇ １０ ９ ； ．ａａＣ ｎｅ ｆ ｈｎ ａｒ Ａ ｓｃａ ｏ ． ｅ ｉｇ １０ ９ ） ．ｅ ｉ ａ ｙＣ ｔｅ ｅｔ Ｂ ｉｎ ０ １ ２ ３ ｔ ｅｔｒ ｉａＤ ｉ ｓｏｉ ｉｎ Ｂ ｉｎ ０ １２ ｊ ｎ ｒ ｔ ｒ ｊ Ｄ ｏＣ ｙ ｔ ｊ
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ｃ ｍｐｕ ｅ ｐ ｏ ｒ ｍ ＣＥＲＶＵＳ ａ ｅ ｌ ｄ ｔ ｓ ｇ ｎｏ ｙ ｉ ｅｒｏ ｉ ｒ ａ ｅ ｏ ｔｒ ｒ ｇ ａ ｅ ｏｎ ｍｏ ａ ｅ ｅ ｔ ｐ ｎｇ ｒ ｒ ｎｃ ｅ ｓ ｓ
ｌ ｋｇ ａ ｎｍａ ｓｎ ｅｔｉｔ ｎ￣ａｍｅ ｔｌｎｔ ｏｙ ｒｈｓ Ｊ ｍ． ｉ ａ ｅｍ ｐ ｉ ｎ ｕｉｇｒｓ ｃｉ ｎ ｒ ｏ ｇ ｎ ｅ ｇｈ ｐｌｍｏｐ ｉｍｌＩ Ａ
SRY基因在性别鉴定中的应用
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理想的遗传学材料应具备以下几个特征
• 所选物种最好是二倍体，染色体基数少。 所选物种最好是二倍体，染色体基数少。 • 具有较多可观察、测定的变异性状，相对性状 具有较多可观察、测定的变异性状， 之间差异明显。 之间差异明显。 • 交配可以控制，按实验目的自由选择亲本进行 交配可以控制， 交配。 对研究遗传规律有利。 交配。——对研究遗传规律有利。 对研究遗传规律有利 • 世代周期短。——获得实验结果的周期也短。 世代周期短。 获得实验结果的周期也短。 获得实验结果的周期也短 • 一次交配产生的子代个体多。——突变性状产 一次交配产生的子代个体多。 突变性状产 生的频率通常较低， 生的频率通常较低，子代群体大则增加了获得 这些突变性状的机会。 这些突变性状的机会。从一个大群体中获得的 结果更准确、可靠。 结果更准确、可靠。 • 6.易于管理。 6.易于管理 易于管理。
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SRY基因（sexY） SRY基因（sex-related Y） 基因
• SRY基因（sex-related Y）是人类性别决定基因，定位于 SRY基因（sexY）是人类性别决定基因， 基因 只含有一个外显子，没有内含子， Yp11.3. 只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约 1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。 204氨基酸的蛋白质 1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。 • 该蛋白的功能是与DNA结合激活抗中肾旁管物质（MIS苗氏 该蛋白的功能是与DNA结合激活抗中肾旁管物质（MIS苗氏 DNA结合激活抗中肾旁管物质 管抑制物质）调节途径，导致MIS表达， MIS表达 管抑制物质）调节途径，导致MIS表达，使前身苗氏管退 女性生殖系统不能生成，生成睾酮， 化，女性生殖系统不能生成，生成睾酮，通过双氢睾酮作 使胚胎体內的男性的前身沃氏管（ ducts） 用，使胚胎体內的男性的前身沃氏管（Wolffian ducts） 发育，生成男性生殖系统。 发育，生成男性生殖系统。
SRY基因在性别鉴定中的应用演示教学
基因组DNA的提取
磁珠法提取DNA 碱裂解法提取DNA
1.裂解液/蛋白酶K迅速裂解细 胞并灭活细胞内核酸酶 2.基因组DNA选择性吸附于磁 珠 3.通过一系列快速的漂洗-分离 的步骤，去除细胞代谢物、蛋 白等杂质 4.用双蒸水即可将纯净基因组 DNA从磁珠上洗脱
1.用NaOH作用20分钟 2.加HCI中和，离心后取上清， 含少量DNA。
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磁 珠 法 提 取 D N A
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基因组DNA的提取
碱裂解法提取DNA
1.用NaOH作用20分钟 2.加HCI中和，离心后取上清， 含少量DNA。
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• 1、毛发样品DNA的制备
• （1）男生毛发10根，女生毛发10根作为对照。 也可取一些口 腔上皮细胞。
• （2）在一个200ul PCR管中加20μl的0.2mol/L NaOH溶液。 剪下带毛囊的发根部分，放入管中并盖上管盖，放入有热盖的 PCR仪中， 75℃温育30min，以避免水分蒸发。
SRY基因在性别鉴定中的应用
二、实验目的
了解SRY基因检测及在性别鉴定中的应用
2
二、实验原理
性别的发育起始于胚胎第6周， 胚胎的初期是属于中 性的。 所有的早期胚胎內都存在着两种性腺，外胚胎内存在 两套导管，
发育成女性的前身苗氏管（Müllerian ducts） 发育成男性的前身沃氏管（Wolffian ducts）
Southern-blot和各种酶切反应。
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• 新鲜植物、动物组织，高温干燥过 DNA破 坏比较严重的植物、动物组织，海洋生物， 法医鉴定，新鲜哺乳动物血液或干血点， 转基因食品
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1.样品处理
• a.3根含毛囊的毛发 • 向1.5ml离心管加入380µl Buffer MGL和
SRY基因在性别鉴定中的应用
• 磁珠法提取DNA试剂盒
• 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这 种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸 发生吸附反应。
• 快速简捷，一般可在36分钟内完成。 • ·不用多次漂洗磁珠也可确保高纯度，提取出的基
因组DNA OD260/OD280典型的比值达1.7-1.9， • 长度可达2 0 k b - 5 0 k b，可直接用于P C R、
S及在性别鉴定中的应用
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二、实验原理
性别的发育起始于胚胎第6周， 胚胎的初期是属于中 性的。 所有的早期胚胎內都存在着两种性腺，外胚胎内存在 两套导管，
发育成女性的前身苗氏管（Müllerian ducts） 发育成男性的前身沃氏管（Wolffian ducts）
• 6.重复步骤5，室温开盖干燥15min至管内 无残液。
• 7.加入15-25µl TE Buffer, 65 ℃水浴20min， 间或混匀,离心2min，
• 8.将离心管置于磁力架上1min，待 Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸 取上清至新的离心管，即获得jiyinzuDNA.
• 如使用牙签刮取口腔上皮细胞，应注意沾过NaOH溶液的牙签 不能再放回口腔，以免烧伤。
• （3）加入50μl的0.04 mol/L HCl中和。 • （4）12000 r/min 离心5min去除未溶解的沉淀物，上清转入1
个新管，DNA就在水溶液中。
• 2、PCR反应 • （1）扩增人的SRY基因，所用引物为： • SRY1: 5’-TGG GAC TGG TGA CAA
TTG TC-3'
• SRY2：5’-GAG TAC AGG TGT GCA GCT CT-3'
• （2）每个样品反应体系为25μl。
应用PCR技术扩增SRY基因检测性别
应用PCR技术扩增SRY基因检测性别作者：吴晓东张博文王博楠等来源：《赤峰学院学报·自然科学版》 2013年第14期吴晓东，张博文，王博楠，李争芳，史莉莉，史铁伟，白春英（赤峰学院医学院，内蒙古赤峰 024000）摘要：本文介绍了一种从基因水平快速、简捷地鉴定性别的方法及该方法的实际应用价值.PCR（polymerase chain reaction）技术是目前最常用的体外扩增DNA片段的技术，SRY （sex determining region of the Y）基因是男性特有的基因，位于Y染色体上.在SRY基因区域设计特异的引物，利用PCR技术,以管家基因GAPDH为内参照，若能扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性.该法可对一滴血、一根毛发、多年的尸块、胎儿、有争议的性别进行性别鉴定.广泛应用于法医鉴定、无创孕期胎儿性别鉴定以预防X连锁隐性遗传病患儿的出生以及对有性别争议的运动员体检等.目前赤峰市的各大医院还未开展此技术，值得推广.关键词：PCR技术；SRY基因；性别鉴定中图分类号：R-33 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2013）07-0138-041 引言性别鉴定一直是医学领域的一个很有意义的话题，随着技术的不断革新，性别鉴定的方法也由过去传统单一的方法，逐渐向分子生物学多手段结合的方法过渡.传统方法，如通过性染色质鉴定性别，存在着准确率低的缺点[1].羊膜腔穿刺结合染色体核型分析方法，虽然准确率高，但检测所需时间较长（约23天左右），且容易损伤胚胎，对于单胞胎来说，胎儿死亡率为0.6%，还有引发孕妇并发症的可能性.B超鉴定性别要求孕妇妊娠5个月以上，虽然安全性较高，但是受操作者的业务熟练程度等因素影响较大.相对传统方法来说，分子生物学方法最具优势[2].我们采用的是分子生物学的PCR扩增法，以男女都有的管家基因GAPDH为内参照，扩增男性特有的SRY基因，若能扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性.性别决定基因（sex determinationg region of the Y，SRY）指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段，是启动睾丸形成的主要基因.人的SRY基因位于Y染色体短臂Yp11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质.SRY基因在男性的减数分裂过程中，按父系遗传，涉及性别决定至少1亿3千万年了[3,4].聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外扩增DNA的技术[5].本研究中利用PCR技术扩增SRY基因和内参照基因（GAPDH），可以在短时间内（3个小时左右）获得大量的目的基因，然后通过电泳检测结果，根据是否可以扩增出SRY基因来进行性别的鉴定.从采样到出结果只需5到7个小时，该方法的优点是简单、快速、高效、敏感度高，样品可以取自带毛囊的毛发，血液，多年的尸块等.所以，利用PCR技术鉴定性别对于遗传性疾病的产前基因诊断，法医学中由于肢解或者肉眼无法辨识的性别鉴定，考古学中性别的鉴定以及对有性别争议的运动员体检等领域具有重要的现实意义.2 材料和方法2.1 材料2.1.1 材料及来源外周血和毛发（含毛囊）均来自发育健康的志愿者，分别包括男性2名，女性2名.2.1.2 试剂和药品引物合成由北京赛百盛基因技术有限公司完成；毛发基因组DNA提取试剂盒和血液提取基因组DNA试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司；红细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖是西班牙原装进口；其它试剂和药品均为国内生产，由赤峰学院分子医学研究中心提供.2.1.3 仪器设备真空浓缩仪（VC-15SP）；PCR仪（ABI2720）；超微量分光光度计（NanoDrop 2000）；全自动凝胶成像仪(Tocan240)，电泳设备(北京六一仪器厂)；低速离心机，高速离心机，涡旋混合仪，高压灭菌锅，eppendorf移液器等设备均由赤峰学院医学院分子医学研究中心提供.2.2 方法2.2.1 引物和样本 SRY基因和GAPDH基因引物的设计见表1，样本选择了外周血和带毛囊的毛发，之前的实验证明利用外周血基因组DNA扩增SRY基因判断性别是完全没有问题的，而用一根带毛囊的毛发是否能够扩增出SRY基因在本实验室还未曾做过，因此，设计实验时以男性的基因组DNA作为阳性对照，以女性的基因组DNA作为阴性对照.2.2.2 样本的采集与处理2.2.2.1 外周血的采集与基因组DNA的提取（1）采血用带有抗凝剂(EDTA)的采血管采志愿者的外周血3mL，上下翻转5~6次，否则血液会出现凝集.（2）收集白细胞血细胞中的红细胞没有细胞核，基因组DNA要从白细胞中提取.具体步骤见参考文献[6]，白细胞于-20度保存或直接提取基因组DNA. （3）从白细胞中提取基因组DNA 具体步骤如下：将上次实验获得的白细胞解冻，加入300μl红细胞裂解液，震荡混匀室温放置10min后12,000rpm离心1min，弃上清.其余步骤按试剂盒的方法进行，最后开盖放入预热的超小型离心浓缩仪，干燥5-10min，加入100μL DNA溶解液，充分混匀，-20℃保存.(4)检测核酸的浓度和纯度取1μL基因组DNA，用超微量核酸检测仪检测核酸的浓度和纯度，结果见图1和表2.2.2.2.2 毛发的采集与处理（1）采样取男性和女性带有毛囊的毛发各一根.（2）样本的处理将采集的毛发用70%乙醇洗涤1次，然后用蒸馏水冲洗毛发2次.在PCR 管中加入1根头发，毛囊置于管底，用洁净的剪刀剪去多余发毛发（高于PCR管的毛发部分）.PCR管中加入15μL裂解液，放入PCR仪中进行如下反应：65℃，30min;95℃,15min;4℃,10min.反应结束后，将PCR管短暂离心，此裂解液作为毛发基因PCR的模板备用.2.2.3 PCR体系和条件2.2.3.1 PCR反应体系（1）毛发样品的PCR反应体系，PCR管中依次加入下列试剂和样本：毛发裂解液4μL，2*PCR Mix 25μL，GAPDH和SRY基因的上下游引物（10μM）各加1μL，灭菌超纯水17，总体积50μL.（2）基因组DNA的PCR反应体系，PCR管中依次加入下列试剂和样本：2*PCR Mix 25μL，GAPDH和SRY基因的上下游引物（10μM）各加1μL，基因组DNA（150-200ng/μL）1μL，灭菌超纯水20μL，总体积50.2.2.3.2 PCR反应条件首先94℃ 5min，然后94℃70sec，55℃90sec，72℃90sec循环30次，再72℃ 7min，最后4℃保存.反应结束后，取样品5μL进行电泳检测，其余PCR产物于-20℃冰箱保存.2.2.4 电泳检测配制2%琼脂糖凝胶和1xTAE电泳缓冲液，电泳按照5-8V/cm进行，120v恒电压，运行0.5h.点样的顺序从左到右为：Marker I（条带为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp），男1号的基因组DNA，女1号的基因组DNA，男1号的毛发，女1号的毛发，男2号的基因组DNA，女2号的基因组DNA，男2号的毛发，女2号的毛发.将电泳后的凝胶放入EB浸泡液中浸泡30min，凝胶成像系统Tocan240中观察，结果见图2.3 实验结果3.1 基因组DNA的纯度与浓度的检测结果用NanoDrop2000超微量紫外分光光度计检测基因组DNA的纯度和浓度结果见图1和表2.结果显示所测样品的基因组DNA紫外吸收值OD260/280均在1.80-2.00之间，说明基因组DNA的纯度很高，可以用于试验操作.3.2 2%琼脂糖凝胶电泳检测结果应用PCR扩增SRY基因电泳检测结果见图2，结果显示：①2、4、6、8泳道扩增出SRY基因，说明样本为男性样本，3、5、7、9泳道扩增出了男女都有的GAPDH内参照基因，但未扩出SRY基因，说明样本为女性样本，该实验结果与实际情况完全相符，证明该方法鉴定性别的准确率极高.②用毛发检测SRY基因的结果与实际情况一致，说明用毛发鉴定性别可行，可以推广到实际应用中.4 讨论人或者哺乳动物的性别决定，首先依赖于生物体内染色体（主要是性染色体）的完整性，一般来说，男性有一条X染色体和一条Y染色体，而女性有两条X染色体.1966年人们发现睾丸决定因子（testis determination factor, TDF)决定了生物是否为雄性，直到1990年人们才在此区克隆得到了SRY基因[7].因此，SRY基因的发现是哺乳动物性别决定领域研究的一项重大突破，性别鉴定对于人类遗传病，法医鉴定，考古以及其它领域具有越来越重要的作用.特别是采用分子生物学手段比其他传统方法有着明显的优势.4.1 该技术在胎儿性别检测中的应用优势.胎儿性别检测的方法有羊膜腔穿刺法、B型超声波诊断法等，这两种方法检测性别各有特点.羊膜穿刺法对孕妇和胎儿都有侵入性伤害，其操作的创伤性，可导致宫内感染流产等多种妊娠不良；B超法要求胎儿发育到5个月以上才可以，而且用超声波仪器分辨胎儿生殖器官要结合胎儿的位置和医师的水平，所以准确率并不高，5个月后检测出性别再做流产时对孕妇的伤害很大.早在60年代末就有报道在孕妇血循环中存在胎儿细胞[8],并提示可以利用孕妇外周血中的胎儿细胞进行胎儿性别及X连锁遗传病、某些常染色体遗传性疾病的产前诊断[9,10].因此，采用PCR技术扩增SRY基因检测性别法，可以用孕妇的外周血中游离的少量胎儿细胞进行性别鉴定，属于无创伤性检测.而且用PCR技术扩增SRY基因检测性别法在怀孕早期（11周以后）即可进行鉴定[10].4.2 法医鉴定的方法目前常用的就是PCR技术扩增SRY基因检测性别法，该方法具有快速、简捷和准确等特点，对样本的要求低，用一根毛发、一滴血均可检测出性别.4.3 对于性分化异常的个体，如有些染色体检查为46,XX的个体却表现出部分男性的性状或46，XY的个体却表现出部分女性特征时用PCR技术扩增SRY基因，原本SRY基因是位于Y染色体上的，但在形成生殖细胞进行减数分裂时X染色体和Y染色体发生易位而导致Y染色体上的SRY基因易位到了X染色体上而出现性分化异常的现象.因此用PCR技术扩增SRY基因检测性别法可以进行准确鉴定.4.4 多年的尸块因大部分已降解无法判断性别时，用PCR技术扩增SRY基因检测性别法可不受降解的影响，因为该法检测的只是很少的一部分DNA.4.5 对于有争议的运动员，多指表型像女性但怀疑是男性的运动员，可以用PCR技术扩增SRY基因检测性别法进行最终鉴定.5 应用与推广前景用PCR技术扩增SRY基因片段检测性别具有广泛的实际应用价值.首先，材料来源广泛，只要有一滴血、一根毛发或多年的尸骨均可用来进行性别鉴定.其次，该方法具有简单、快速、高效、敏感度高等优点.利用PCR技术鉴定性别对于遗传性疾病的产前基因诊断，法医学中由于肢解或者肉眼无法辨识的性别鉴定，考古学中性别的鉴定以及对有性别争议的运动员体检等领域具有重要的现实意义.5.1 家族中有血友病或肌营养不良等X连锁隐性遗传病史的人有必要在怀孕后检测胎儿的性别.通过采孕妇的外周血来检测胎儿的性别，可预防甲型血友病、杜氏肌营养不良等X连锁隐性遗传病患儿的出生，随着从孕妇血浆中提取胎儿游离DNA的技术手段不断革新，该方法在遗传病的产前基因诊断中具有广泛而深远的实际应用价值[11-13].5.2 案发现场发现血迹和毛发，需要检测性别时.性别鉴定是法医学个人识别的重要内容之一，用PCR 技术扩增Y染色体上的同源基因大大提高了性别鉴定的灵敏度，且检验程序简便快速，部分降解的检材只要能提取到相应的靶DNA序列即可进行，目前在法医学中已广泛应用[14，15].5.3 由于多种原因无法确定性别时，如性反转综合征，用该法可为其临床诊断提供理论依据[16].5.4 多年的尸块大部分已降解需要鉴定性别时.考古研究中性别信息特别是重大考古和典型墓葬的考古发现对于墓主的性别等信息就显得非常重要以及对人类起源演化和迁移等研究也具有十分重要作用，考古过程中由于挖掘墓葬，婴儿骨骼发育不全等情况无法进行形态学性别鉴定，而通过分子手段就显得尤为重要，多年遗骸比如尸块的DNA常有降解，而PCR只分析DNA的一小部分，不易受降解的影响，以DNA为基础的人骨遗骸性别鉴定最早就是用于扩增Y染色体特异性序列进行的[17].因此，通过骨骼，牙齿，毛发（含毛囊）以及排泄物等提取出古代DNA，进行性别鉴定对于人类起源、演化和迁移等研究具有十分重要的作用.随着科学的进步，利用PCR技术扩增SRY基因对考古进行性别鉴定的手段将会愈发的重要.5.5 本方法还可用于需要快速、准确、同时需检测大量标本的运动员体检.参考文献：〔1〕傅忠扬.性别鉴定的几种方法[J].生物学通报,2010,45(4):18-20.〔2〕石鑫玮,刘海意,乔福元，等.荧光原位杂交技术及染色体核型分析在产前诊断中的应用价值[J].中国实用妇科与产科杂志,2011(2):125-127.〔3〕Ignacio Marin,Bruce S Baker.The Evolutionary Dynamics of Sex Determination [J].Scienc,1998,281(5385):1990-1994.〔4〕Shah V C,Smart V.Human chromosome Y and SRY[J].Cell Biol Int,1996,20(1):3-6.〔5〕J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔,等.分子克隆实验指南(第三版)[M].科学出版社,2012.611-617.〔6〕白春英,周静,瑞云,于晓明,萨初然贵,李秀君.经济、有效提取外周血基因组DNA的方法[J].检验医学与临床,2012(17):1795-1798.〔7〕Gubby J, Collignon J, Koopman P, et al. A gene mapping to the sex determining region of the mouse Y chromosome is a member of the novel famlily embryonically expressed genes[J].Nature, 1990, 346: 245-250.〔8〕Erenberg A,Lemons J,Sia C,et al.Newborn and infant hearing loss:Detection and intervention[J].Pediat rics,1999,103(2):527-530.〔9〕Rossiter J P,Balkemore K J,Kickler T S,et al.The use of polymerase chain reaction to determine fetal RhD status[J].Am J Obste Gynecol,1994,171(4):1047-1051.〔10〕马旭,张思仲.孕妇外周血中胎儿细胞的分离纯化及在产前基因诊断中的应用[J].中华医学遗传学杂志,1992,9(4):212-214.〔11〕Harper T C,Finning K M,Martin P,et e of maternal plasma for noninvasive determination of feal RhD status[J].Am J ObsteGynecol,2004,191(5):1730-1732.〔12〕Li Y, Holzgreve W, Page-Christiaens GC,et al.Improved prenatal detection of a fetal point mutation for achondroplasia by the use of size-fractionated circulatory DNA in maternal plasma-case report[J].Prenat Diagn,2004,24(11):896-898.〔13〕Aviles RJ,Askari AT,Lindahl B,et al.Troponin T levels in patients with acute coronary syndrome,with or without renal dysfunction[J].N Engl J Med,2002,346 (26):2047-2052.〔14〕Witt M,Erickson R P.A rapid Method for detection of y-chromosomal DNA from dried blood specimens by the polymerase chain reaction [J].HumGenet,1989,82:271-274.〔15〕吴梅筠,孙光云.体外DNA扩增技术鉴定血痕性别三例报告[J].中国法医学杂志,1991,6(2):68-69.〔16〕蒙县宗,梁季鸿,鲁国玉,李广裕.SRY基因阴性男性性反转综合征1例[J].中国现代医生，2010，48(16):106-107.〔17〕Chen E, Yuan Z A,Collier P M,et parison of upstream regions of X-and Y-chromosomal amelogenin genes[J].Gene,1998,17(216):131-137.。
SRY基因的分子机制及其在奶牛性别控制中的应用
SRY基因的分子机制及其在奶牛性别控制中的应用
郭东升
【期刊名称】《河南科技学院学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2007(035)002
【摘要】综述了性别决定的生物学机制和性别决定基因(SRY)的定位、结构、功能、表达特异性及其作用的分子机制,在此基础上阐述了SRY在奶牛精子性别控制与胚胎性别鉴定中的应用,着重介绍了用于胚胎鉴定的PCR扩增法和DNA探针法.
【总页数】4页(P21-24)
【作者】郭东升
【作者单位】河南科技学院动物科学学院,河南,新乡,453003
【正文语种】中文
【中图分类】S811.5
【相关文献】
1.论性别控制技术在呼伦贝尔地区奶牛业生产实践中的应用 [J], 王秀文;姜海英
2.应用奶牛性控胶囊进行奶牛性别控制的试验 [J], 黄文明;安福刚;王凤岭;刘希峰;
云鹏;王欢;王森
3.性控胶囊与精氨酸在奶牛性别控制中的应用试验 [J], 岳斌;于艺辉
4.应用奶牛性控胶囊进行奶牛性别控制试验 [J], 黄文明;安福刚;王凤岭;刘希峰;云鹏;王欢;王森
5.奶牛繁育过程中性别控制技术的应用 [J], 朱强
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SRY基因和其在临床诊断中的应用-精选文档
• SRY基因与精神分裂症
• SRY基因与上瘾症
• Sry基因也可能与多巴胺相关 的某些疾病，如精神分裂症 有关，这些疾病的发病率也 呈现明显的性别差异，男性 患者要比女性患者多。”
精神病是指在各种生物、心理、社会因素 作用下，大脑的正常活动功能发生了紊乱， 导致感知思维、情感、注意、记忆、行为、 意识和智能等方面不同程度的异常，出现 各种幻觉妄想及由于受这些幻觉、妄想支 配下，出现行为紊乱、兴奋躁动、自伤等 行为。
•
SRY基因是性别决定中最重要的基因， 在1990年首先由Sinclair等从人类Y染色 体上分离出来， 并经Koopman等转基因 小鼠实验证实。当其有突变、缺失、易 位时均可导致性反转及生殖器的发育不 良。
Thank
You !
师 鹏 王 鑫 张 琳
滕 飞
王 磊
• 研究人员证明基因SRY——直接指导性腺 发育成睾丸而不是卵巢的关键性别决定基 因，SRY通过Y染色体由父亲传递给儿子， 女性是没有这个基因的 。
• (1)外周血有Y染色体，不一定有SRY基因， 但性腺可有睾丸组织 • (2)外周血无Y染色体，可能有SRY基因， 性腺有睾丸组织； • (3)外周血SRY基因阳性，不一定有睾丸， 性腺可为卵巢或卵巢间质； • (4)外周血SRY基因阴性，也可能有睾丸。
SRY基因检测的意义
• • • • (1)SRY基因是睾丸决定因子的最佳候选基因 (2)SRY基因的唯一决定因素：不是睾丸形成 (3)外周血性染色体不代表性腺的性别； (4)性发育异常患者，应常规检测SRY，即使无Y 染色体，如SRY阳性，亦应探查性腺 • 所以在性发育异常的检查诊断过程中，除将外周 血染色体检查作为常规外，有条件的应将SRY检 查作为常规，可能时同时作性腺的核型和SRY检 测，以辅助诊断，明确病因，并协助选择适当的 治疗方案。
人类Y染色体SRY基因的鉴定
姓名班级同组人科目遗传实验题目人类性别决定基因SRY分析学号 201100140154一、背景介绍SRY基因又称为雄性的性别决定基因，指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段。
人的SRY基因位于Yp11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。
由于SRY蛋白含有一个典型的DNA结合结构域：高泳动类非组蛋白（high mobility group，HMG）盒基序，类似于已知的转录因子，所以推测SRY编码一个转录因子。
SRY 的HMG域以一种序列特异的方式与DNA相结合，在双螺旋结构中引入一个尖锐的转折。
有证据显示，性反转病人HMG域中的突变可分为两类：影响DNA结合和影响DNA弯曲的，提示这两种性质对于SRY蛋白行使转录调节功能来说都很重要。
已发现HMG域在体外能以高亲和力与钙调素（Calmodulin，CaM）相结合。
这一现象的功能意义不明，但提示SRY的活性可能受另一个层次的调控。
SRY在成年小鼠生殖细胞中表达为一环状转录物，在发育中的小鼠性腺里则转录为一个长4.8kb的RNA，所用的启动子也与成年鼠不同。
SRY于大约交配后10.5-11天（days postcoitum，dpc）的生殖嵴中专一开启，正好是两性间出现可观察的形态学差异之前；于12.5dpc左右关闭。
因此SRY的功能是启动睾丸分化而不是维持睾丸存在。
Lovell －Badge认为SRY起一种感受态因子的作用。
因为有些小鼠虽然有SRY的表达，但未能把细胞定型到雄性途径。
相反在完全没有SRY的情况下，有时卵巢组织也能逆转成睾丸。
目前，已经在所有哺乳动物包括有袋目动物中发现了SRY基因。
在不同的物种中，SRY蛋白的HMG域高度保守，但是即使是在有亲缘关系的物种之间，SRY蛋白的其余部分也并不同源。
还不肯定这是否意味着HMG域是SRY蛋白中唯一功能上重要的区域。
Y染色体上95%是男性特异区域，里面含和男性有关的基因，通共有156个转录单位，有78个编码蛋白质的基因,最后是27个完全不同的蛋白。
人类Y染色体SRY基因的鉴定
人类Y染色体SRY基因的鉴定————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：一、背景介绍SRY基因又称为雄性的性别决定基因，指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段。
人的SRY基因位于Yp11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。
由于SRY蛋白含有一个典型的DNA结合结构域：高泳动类非组蛋白（high mobility group，HMG）盒基序，类似于已知的转录因子，所以推测SRY编码一个转录因子。
SRY的HMG域以一种序列特异的方式与DNA相结合，在双螺旋结构中引入一个尖锐的转折。
有证据显示，性反转病人HMG域中的突变可分为两类：影响DNA结合和影响DNA弯曲的，提示这两种性质对于SRY蛋白行使转录调节功能来说都很重要。
已发现HMG域在体外能以高亲和力与钙调素（Calmodulin，CaM）相结合。
这一现象的功能意义不明，但提示SRY的活性可能受另一个层次的调控。
SRY在成年小鼠生殖细胞中表达为一环状转录物，在发育中的小鼠性腺里则转录为一个长 4.8kb的RNA，所用的启动子也与成年鼠不同。
SRY于大约交配后10.5-11天（days postcoitum，dpc）的生殖嵴中专一开启，正好是两性间出现可观察的形态学差异之前；于12.5dpc左右关闭。
因此SRY的功能是启动睾丸分化而不是维持睾丸存在。
Lovell－Badge认为SRY起一种感受态因子的作用。
因为有些小鼠虽然有SRY的表达，但未能把细胞定型到雄性途径。
相反在完全没有SRY的情况下，有时卵巢组织也能逆转成睾丸。
目前，已经在所有哺乳动物包括有袋目动物中发现了SRY基因。
在不同的物种中，SRY蛋白的HMG域高度保守，但是即使是在有亲缘关系的物种之间，SRY蛋白的其余部分也并不同源。
还不肯定这是否意味着HMG域是SRY蛋白中唯一功能上重要的区域。
SRY基因检测及在性别鉴定中的应用 山东大学
科目遗传学实验题目 SRY基因检测及在性别鉴定中的应用SRY基因检测及在性别鉴定中的应用摘要SRY基因是人类的性别决定因子，该基因决定雄性的性别。
为了验证SRY基因决定人类的性别表型，我们通过磁珠法分别提前男性和女性发根细胞中的基因组DNA，设计符合SRY基因扩增的引物，利用PCR扩增的方法获得大量SRY 基因扩增产物，再通过琼脂糖凝胶电泳的方法检测SRY基因。
1.引言SRY基因（sex-determining region of Y-chromosome，全称：Y染色体性别决定区）是决定人类雄性性别的基因，该基因是决定男性睾丸发育的主要基因。
人的SRY基因位于Yp11.3（Y染色体短臂末端），只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。
SRY基因是由Sinclair在1990年发现的。
该基因比较特别。
它的序列在不同男性体内惊人地相似。
研究证明，它的序列几乎没有任何突变，从大约20万年以前人类最后一个共同祖先到现在，它一直没有变化。
受精卵中的X染色体上有决定卵巢发育的基因，如果SRY基因没有及时启动的话，原始性腺就会自然而然地向卵巢方向发育。
当SRY基因启动后，其基因编码的蛋白质需要先进入细胞核，继而启动一系列基因的表达，促进胎儿的原始性腺向睾丸方向发育。
然后，这个最初的微小睾丸开始分泌睾酮。
睾酮的出现，是SRY基因作为“幕后推手”最重要的价值体现。
SRY基因是目前认为的唯一一个性别决定基因。
因此在血液，精液样本中可以通过寻找该基因片断，达到判断测试者的性别的目的。
通常采用的方法是，先使用PCR技术扩增该基因上某个片断，再利用凝胶电泳判断样本中是否含有该基因。
若测试者是男性，样本中存在该基因，测试为阳性。
女性测试者将会相应得到阴性结果。
磁珠法提取基因组DNA原理：磁珠法中的细胞裂解液是一种蛋白变性剂，可使动植物的细胞裂解并使与DNA结合的蛋白质变性、DNA游离释放，磁珠可以特异性地吸附DNA，通过洗涤去除DNA以外的RNA、蛋白质等杂质，再用洗脱液解离吸附在磁珠上的DNA，得到纯度和浓度均很高的DNA，可用于PCR 扩增、酶切、分子杂交等。
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• 2.将上述离心管振荡混匀，65 ℃水浴20min， 间或混匀，使样品充分裂解。 • 3.向充分裂解的样品加入400µl Buffer MA 和10µl Magicmag beads,振荡混匀10s. • (吸取Magicmag beads之前，先混匀。务必 将Magicmag beads加至液面以下） • 4.将离心管置于磁力架上，待Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从 磁力架取出离心管。 • (吸弃上清时，不要吸入Magicmag beads）
• 2、PCR反应 • （1）扩增人的SRY基因，所用引物为： • SRY1: 5’-TGG GAC TGG TGA CAA TTG TC-3' • SRY2：5’-GAG TAC AGG TGT GCA GCT CT-3'
•• • • • • • • • • • • •
（2）每个样品反应体系为25μl。 首先将下列成分预混： 10×PCR缓冲液 5μl 25mM MgCl2 4 μl 2.5mmol/L dNTP 4μl 10 umol/L SRY引物 1 2μ l 10 umol/L SRY引物2 2μl 1 U/μl Taq酶溶液 1μl ddH2O 26μl 共44ul。 将上述成分混合均匀； 分装到2只0.2 ml离心管中（22μl/管）； 一管加入3μl男生DNA，另一管加入3μl女生DNA。
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• 5.加入700µl70 %乙醇，振荡混匀10s.将离 心管置于磁力架上1min，待Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从 磁力架取出离心管。 • 6.重复步骤5，室温开盖干燥15min至管内 无残液。 • 7.加入15-25µl TE Buffer, 65 ℃水浴20min， 间或混匀,离心2min， • 8.将离心管置于磁力架上1min，待 Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸 取上清至新的离心管，即获得jiyinzuDNA.
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SRY基因（sex-related Y）
• SRY基因（sex-related Y）是人类性别决定基因，定位于 Yp11.3. 只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约 1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。
• 该蛋白的功能是与DNA结合激活抗中肾旁管物质（MIS苗氏 管抑制物质）调节途径，导致MIS表达，使前身苗氏管退 化，女性生殖系统不能生成，生成睾酮，通过双氢睾酮作 用，使胚胎体內的男性的前身沃氏管（Wolffian ducts） 发育，生成男性生殖系统。
PCR仪中， 75℃温育30min，以避免水分蒸发。
• 如使用牙签刮取口腔上皮细胞，应注意沾过NaOH溶液的牙签 不能再放回口腔，以免烧伤。
• （3）加入50μl的0.04 mol/L HCl中和。
• （4）12000 r/min 离心5min去除未溶解的沉淀物，上清转入1 个新管，DNA就在水溶液中。
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磁 珠 法 提 取 D N A
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基因组DNA的提取
碱裂解法提取DNA
1.用NaOH作用20分钟 2.加HCI中和，离心后取上清， 含少量DNA。
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• 1、毛发样品DNA的制备
• （1）男生毛发10根，女生毛发10根作为对照。 也可取一些口 腔上皮细胞。 • （2）在一个200ul PCR管中加20μl的0.2mol/L NaOH溶液。 剪下带毛囊的发根部分，放入管中并盖上管盖，放入有热盖的
• • • • • • • •
（3）PCR反应条件为： 94℃ 3min 94℃ 30s 50℃ 30s 循环35次 72℃ 30s 72℃ 5min 10℃ ∞
• 3、电泳检测 • 制备2%的琼脂糖凝胶，取8μl PCR产物， 加2ul上样缓冲液，混匀，点样，同时点 DNA分子量标记，在5V/cm的电压下电泳， 电泳结束后用EB染色20min，紫外检测观 察并照相。
磁珠法提取DNA
碱裂解法提取DNA
1.用NaOH作用20分钟 2.加HCI中和，离心后取上清， 含少量DNA。
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• 磁珠法提取DNA试剂盒
• 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这 种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸 发生吸附反应。 • 快速简捷，一般可在36分钟内完成。 • · 不用多次漂洗磁珠也可确保高纯度，提取出的基 因组DNA OD260/OD280典型的比值达1.7-1.9， • 长度可达2 0 k b - 5 0 k b，可直接用于P C R、 Southern-blot和各种酶切反应。
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• 新鲜植物、动物组织，高温干燥过 DNA破 坏比较严重的植物、动物组织，海洋生物， 法医鉴定，新鲜哺乳动物血液或干血点， 转基因食品
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1.样品处理
• a.3根含毛囊的毛发 • 向1.5ml离心管加入380µl Buffer MGL和 20µl Proteinase K，从毛发根部取1cm长的 含毛囊的毛发加入上述离心管中。 • b.口腔脱落的细胞 • 2ml唾液或10ml漱口水，2000rpm离心 5min,将上清用移液器小心移去，向沉淀加 入380µl Buffer MGL和20µl Proteinase K。
遗传学实验
SRY基因检测及在性别鉴定中的应用
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二、实验目的
了解SRY基因检测及在性别鉴定中的应用
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二、实验原理
性别的发育起始于胚胎第6周， 胚胎的初期是属于 中性的。 所有的早期胚胎內都存在着两种性腺，外胚胎内存 在两套导管，
发育成女性的前身苗氏管（Müllerian ducts）
发育成男性的前身沃氏管（Wolffian ducts）
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PCR技术原理
• PCR技术是一种体外核酸扩增系统，根据 SRY的序列，合成特异引物，经PCR扩增仪 的变性、退火和延伸三个步骤的多次循环， 形成与模板链互补的新DNA链，产物长度 300bp左右。
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Yp11.3
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基因组DNA的提取
1.裂解液/蛋白酶K迅速裂解细 胞并灭活细胞内核酸酶 2.基因组DNA选择性吸附于磁 珠 3.通过一系列快速的漂洗-分离 的步骤，去除细胞代谢物、蛋 白等杂质 4.用双蒸水即可将纯净基因组 DNA从磁珠上洗脱