高分辨熔解曲线(HRM)
高分辨率熔解曲线分析(HRM)及其在植物种质资源鉴定中的应用
摘要 ： 饱和 荧光染料 、 未标记探 针 与 实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ结合产 生 的
关键词 ： 高分辨率 熔解 曲线分析 ； 种 质鉴定 ； Ｓ Ｓ Ｒ；Ｓ Ｎ Ｐ
中图分类号 ： Ｓ３ ３ ０ 文献标志码 ： Ａ
文章编号 ： １ ０ ０ １ — ４ ７ ０ ５ （ ２ ０ １ ３ ） １ ０ － ０ ０ ５ ７ － ０ ４
高分 辨 率 熔 解 曲线 分 析 （ Ｈｉ ｇ ｈ Ｒ ｅ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｍｅ ｌ ｔ ｉ ｎ ｇ Ｃ ｕ ｒ ｖ ｅ Ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ， Ｈ Ｒ Ｍ） 是在实时荧光定量 Ｐ Ｃ Ｒ基 础 上 发展起 来 的一 项新 技术 。 目前 ， Ｈ Ｒ Ｍ 分 析 的应 用 领域
因型 。
多态 ） 分析 、 突变扫 描 、 甲基 化 分析 、 基 因分 型 、 序列 匹
配等研究 ， 近年来 已成 为生命科 学研究 中的热点技 术 … 。在植 物种 质 资源 研 究 中 ， 高 分 辨 率熔 解 曲 线分
析 的应 用 已经 逐步 开展 ， 主要 用 于植 物遗 传 图谱 构建 、 基 因定 位 与标 记辅 助 选 择 、 突 变 检 测 及 种 质 鉴 定 等研
究 Ｊ 。本文对高分辨率熔解 曲线 分析的原理 、 特点及 其在植物种质资源鉴定 中的应用进行综述 ， 并 对该技 术在种质资源鉴定 中的应用前景进行展望。
高分辨率熔解 曲线分析 （ Ｈ Ｒ Ｍ） 技术 的成 功主要 取决 于 ２个方 面 的 因素 ： 饱 和 荧 光染 料 和 高 分 辨率 的 检测 仪器 ２ ’ 。荧 光染 料包 括 非 饱 和荧 光 染 料 和饱 和
HRM
方法一; Small Amplicon法进行已知SNP位点基因分型
图二：针对已知SNP位点设计小片段（一般片段大小50～100bp），PCR前掺入LC Green荧光染料，对PCR产物进行HRM检测，采用Small Amplicon分析，可以给出该SNP位点的3种基因型。
近几年来，人们发现/发明了一类新型的染料，称为饱和染料，如LC Green，LC Green Plus，SYTO 9和Eva Green。这类染料有着更强的DNA结合能力和很低的抑制作用，在DNA解链过程中不会发生重排，这使得用这些染料的熔解曲线有了更高的分辨率。在仪器精密度提高的基础上，配合这类饱和染料就出现了我们现在所说的高分辨率熔解曲线，即HRM。这样人们便可以利用熔解曲线分析这种极其简单的实验手段来对SNP和突变进行研究了。
Sybr Green I这类染料属于非饱和性染料，由于染料对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远低于将DNA双螺旋结构中的小沟饱和的浓度，由于使用浓度未达到饱和，加之染料本身的特性，在DNA双链解链的过程中，Sybr Green I分子发生重排，那些从已经解链的DNA片段上脱离下来的染料分子又与尚未解链的双链DNA结合，造成结果失真，无法真实反映DNA熔解的情况，影响了检测的分辨率。
HRM与常规熔பைடு நூலகம்曲线的区别
HRM的概念早在上世纪70年代就已经提出并应用于相关的研究中。限于当时有限的实验条件，人们通过紫外吸收来绘制熔解曲线，当然这种方法在检测精度上相比现在的研究手段要大打折扣。随着仪器的改良和定量PCR技术的出现，人们开始用Sybr Green I荧光染料在在定量PCR仪上监测熔解曲线的变化，这也是现今使用最多的熔解曲线研究工具。然而限于分辨率的关系，Sybr Green I熔解曲线一般用于区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，例如用于检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其它非特异性的扩增。如果要用Sybr Green I熔解曲线来区分SNP，目前看来是无法实现的，这与该类染料的特性相关。
HRM技术
最新SNP检测方法！无与伦比！！SNP, 无与伦比, 检测高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法——HRM技术应用HRM介绍高分辨熔解曲线分析（high-resolution melting analysis，HR）技术是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
基于高效稳健的PCR 技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。
HRM原理HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。
随着高精度PCR仪（LightCycler® 480和Rotor-Gene 6000）和饱和染料（LC Green、Eva Green等）的出现，HRM技术的普及使用成为可能。
HRM应用1.SNP（单核苷酸多态性）的筛查。
2.基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。
3.新突变的筛查。
4.甲基化的筛查。
5.遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
6.HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。
7.法医学鉴定、亲子鉴定。
8.动植物品质相关多态性位点的研究等。
植物抗逆性，突变与性状关联性研究。
HRM特点高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。
高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。
检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。
HRM高分辨率熔解曲线分析技术--百替生物
由于HRM的操作与后期数据分析简单、 易懂,在多个医学研究领域收到了广泛关注并 发展起来,高分辨率熔解曲线已经成为医学上 DNA诊断的最为理想的解决方法。
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在非小细胞性肺癌（NSCLC）患者中发现第19号外显子中 存在有(L747-P753insS)突变，为以后针对性的分子诊断以 及设计药物有潜在意义。(Smith et al., 2008) Clinical Pathology
HRM在序列配对中的应用举例
Human Leucocyte Antigen(HLA)人类白细胞抗原：
LC GREEN
高分辨率：
DNA的熔解曲线取决于DNA碱基序列。理论上 任何一个碱基的改变，都会造成TM值的差异，但是 单个碱基改变造成的差异是极小的，通常只有零点 几度。因此要精确检测TM值的差异，就至少需要保 证每0.1℃获取一次荧光信号。 LightScanner
HRM原理示意图
HRM的技术优势：
TM值：当前温度下50%的双链解链为单链
HRM
RealTime PCR
HRM与RealTime PCR的异同点：
需要加入荧光染料
检测获取荧光信号
•采用的染料类型不同（Sybr和LC）
•荧光信号检测时机不同
•分辨率不同
•数据处理方式不同
饱和染料有效避免了检测荧光信号中的假阳性
新的饱和染料降低了传统染料对PCR反应的抑制作用
1.整体操作方法简单，检测灵敏度高，可检测出单个碱基的改 变，检测效率高，5-10分钟即可完成对96/384孔板的检测。
2.从PCR到检测荧光信号，整个过程在同一个管中进行，最大
程度的避免了污染。 3.无需事先知道突变位点，无需设计探针，大大简化实验设计 时间和研究成本。
hrm高分辨率溶解曲线实验流程
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高分辨率熔解HRM简介
高分辨率熔解HRM简介早在上世纪六十年代，双链DNA的熔解靠吸光度监测，数微克的DNA样品以每分钟0.1-1.0℃的速度缓缓加热，待直至数小时后完成熔解。
随后出现的利用荧光检测互补双链DNA是一个更灵敏的方法，这种方法需要先进行PCR富集DNA产物，它的流行得益于1997年问世的实时定量PCR仪Light- Cycler®。
毛细管进样和小样品体积保证了良好的温控效果，使得熔解速率大大加速到每秒钟0.1-1.0℃。
高分辨率熔解分析High Resolution Melting (HRM)于2003年发明，是一项近年来备受关注的创新的技术，实现了通过研究PCR产物依赖于序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。
可用于检测样品中存在的双链DNA的单核苷酸多态性（SNPs）基因变异（Mutation）、多态性（Polymorphisms）和表观遗传学（Epigenetic）差异。
HRM分析技术的神奇之处在于它是基于对核酸双链高温熔解行为的实时监测，仅仅是在普通荧光PCR之后加一步闭管的熔解步骤，操作简便，样品可随着其本身的序列、长度、GC 含量及双链互补程度不同而被区分开。
因此，甚至是单个碱基如SNPs也可轻易被鉴定出。
原则上来说，HRM分析技术的发展得益于三项技术上的进步：1. 1. 发现了新一代的对DNA无抑制作用的饱和染料（如LC Green Plus，Resolight等）；2. 2. 高度精密的荧光监控光学系统的问世；3. 3. 发明了能够对熔解状况进行细致分析的新算法。
高分辨率熔解分析最重要的应用是基因扫描，相比传统基因分型技术，HRM具有许多优势：1. 1. 省钱—相比较测序和Taqman® SNP分型技术，HRM更适合于大规模基因分型项目；2. 2. 快速—能够在更短时间内精确分型；3. 3. 简单—易上手操作，可在高分辨率的荧光PCR仪上方便实现。
由于突变导致的突变样本熔解曲线相对于参考样本的变化是可以明显识别出来的。
高分辨熔解曲线(HRM)
高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM) 分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。
HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。
随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。
HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。
基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR 基础上增加一个饱和染料。
所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。
高分辨溶解曲线突变检测
高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。
该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。
HRM原理HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。
在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。
不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。
因此不能用于熔解曲线的检测。
而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。
HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用HRM应用：•检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁•鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变•基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失•特定突变、多态性位点的筛选•外显子和短扩增子基因型扫描HRM特点：•灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。
如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线
HRM高分辨率溶解曲线是一种用于分析DNA序列变异的技术。
它通过在PCR反应中加入特异性引物和荧光染料，对PCR产物进行实时监测，从而获得高分辨率的溶解曲线。
HRM高分辨率溶解曲线具有高灵敏度、高分辨率和高通量等优点，可以用于检测DNA序列的变异、基因多态性、SNP等。
它不仅可以用于科研领域，还可以应用于临床诊断、生物信息学等领域。
HRM高分辨率溶解曲线的原理是利用PCR产物在变性过程中，双链DNA会逐渐解离成单链DNA，这个过程伴随着温度升高。
当温度升高到一定程度时，引物和模板之间的结合力会减弱，导致引物和模板之间的解离。
这个过程可以通过实时监测PCR产物的荧光信号变化来获得溶解曲线。
HRM高分辨率溶解曲线的应用非常广泛，例如在遗传疾病诊断、基因多态性分析、SNP筛查等领域都有应用。
在遗传疾病诊断中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于检测基因突变或缺失，帮助医生更准确地诊断疾病。
在基因多态性分析中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于研究不同人群或种群之间的基因变异情况。
在SNP筛查中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于快速检测大量的SNP位点，帮助研究人员更全面地了解基因变异情况。
总之，HRM高分辨率溶解曲线是一种非常有用的技术，可以用于分析DNA序列变
异、基因多态性、SNP等。
它的应用非常广泛，可以为科研、临床诊断、生物信息学等领域提供有力的支持。
高分辨率溶解曲线HRM
软件自动基因分型，PCR产物不需要处理
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25:67–90
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
为何要使用温度内标
A>T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表 纯合型CC和TT。
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
高分辨溶解曲线突变检测
高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。
该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。
HRM原理HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。
在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。
不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。
因此不能用于熔解曲线的检测。
而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。
HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用HRM应用：∙检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁∙鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变∙基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失∙特定突变、多态性位点的筛选∙外显子和短扩增子基因型扫描HRM特点：∙灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。
如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution Melting，简称HRM）是一种基于PCR技术的高灵敏度、快速检测和基因分型等应用的新兴方法。
它通过对PCR产物进行高温梯度退火，利用DNA序列中的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP）或突变等，可以对不同的DNA样本进行鉴别和分类。
HRM技术的原理是利用DNA双链在高温梯度环境下的失配特性。
在PCR反应中，经过一定的循环扩增过程，得到目标序列的大量复制品。
然后，通过控制扩增产物的温度、缓慢升温，逐渐增加其中的失配碱基数目，最终使DNA双链断裂解离。
同时，加入一种特定的DNA染料（例如SYBR Green），该染料能够与双链DNA结合并发光。
当溶解曲线进行扫描时，溶解温度越高，样品中的双链DNA越容易解离，染料释放的荧光信号越强。
而当双链DNA中存在SNP或突变时，会引起其中某一个区域的碱基配对发生改变，导致产物的熔解曲线发生改变。
根据熔解曲线的形状、峰型、峰面积等特征，可以判断样品中的SNP型态或突变类型，并进行分类鉴别。
HRM技术具有多个优点。
首先，HRM技术不需要引入特异性的探针或标记物，减少了实验操作的复杂性和成本。
其次，HRM技术具有高度灵敏性和准确性，能够鉴别并区分出少量变异的DNA样品，并且对于SNP的鉴定准确度高。
此外，HRM技术具有高通量、快速、操作简单等特点，适用于大规模基因分型和突变检测等实验。
HRM技术在药物研发、医学诊断和遗传学研究等领域有着广泛的应用。
例如，在药物研发中，可以通过HRM技术对候选靶点进行筛选，评估药物的安全性和有效性。
在医学诊断中，HRM技术可以应用于肿瘤的分型和突变检测，早期发现和预测疾病的风险。
在遗传学研究中，HRM技术可以用于亲子鉴定、人群遗传学调查和基因组学研究等方面。
尽管HRM技术具有许多优点和应用前景，但也存在一些局限性。
HRM技术详解
HRM技术高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称HRM，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
主要的研究方向集中在：1、基因未知突变以及SNP的扫描；2、已知突变及SNP的基因分型；3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定；4、法医鉴定、亲子鉴定；5、HLA的配型；6、甲基化的研究等。
一、HRM 技术的基本原理：HRM技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。
不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的，任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是在PCR反应之前加入饱和染料，在PCR反应之后进行升温变性，采集荧光信号，根据熔解曲线的不同即Tm值的不同来对样品来进行区分。
以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过PCR扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子；而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在（图一）。
杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。
这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。
如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。
下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：图一：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。
以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。
二、HRM 技术的必备条件：HRM 技术走向实践应用主要基于两种技术的改进 :1、双链DNA嵌入型饱和荧光染料 LC-Green 的开发；采用饱和的荧光染料是进行HRM分析的必备条件之一。
高分辨率熔解曲线（HRM）分析指南
高分辨率熔解曲线（HRM）分析指南HRM(High Resolution Melting analysis，高分辨熔解曲线)同许多荧光PCR技术一样，是利用特定dsDNA染料可以插入DNA双链小沟中（PCR产物）的特性，通过实时监测升温过程中dsDNA解链，荧光染料脱落，荧光信号减弱或消失的过程，高分辨记录熔解曲线，从而对样品进行检测。
HRM技术利用dsDNA的物理性质，准确反映DNA序列碱基配对特异性与解链温度变化的情况，无需使用特异性标记探针，不受突变种类和突变位点的限制，具有高灵敏度和特异性、高通量、操作简单灵活、成本低等优点。
实验室检测证明，在PCR反应前或反应后加入饱和dsDNA染料，对HRM分析，效果相同。
在PCR后加入，可闭管进行HRM分析，无需凝胶电泳。
HRM分析，不损伤PCR产物，用于HRM分析的PCR产物仍可用于电泳、胶回收、测序等一系列后续操作。
HRM可应用于核酸突变扫描、基因分型、甲基化检测、短串联重复序列分析、序列匹配和RNA编辑等多方面研究，已越来越受到国内外核酸分子实验室的欢迎和重视。
对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。
在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。
HRM技术在遗传学研究方面也带来很大便利，只需在PCR反应体系中加入双链DNA饱和荧光染料，在PCR反应之后再花15 分钟，就可以完成96或384个样品的DNA变异扫描。
采用这种方法，当片段的大小在400bp或者更小时，灵敏性最高。
一、HRM分析条件1. 设备PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列，序列中如有一个碱基发生突变，都会改变dsDNA的解链温度。
但是这种变化差异极小，只有零点几摄氏度，HRM技术需要区分Tm值差异极小的样品，以鉴别单个碱基的差异，因此，对温度分辨率的要求相当高，如果仪器的分辨率不高，是无法检测的。
HRM应用实验设计及结果分析
HRM分析过程
原始曲线 随着DNA熔解，插入 DNA双链中的染料被 释放，荧光信号骤降
对PCR的扩增子进行加热，温度 从50℃逐渐上升到95℃。扩增子逐 渐解链，到达熔解温度（Tm）时， DNA双链完全分开。
初期，荧光强度很高，随着温度 升高，双链DNA逐渐减少，荧光强 度下降。通过检测器，记录荧光变 化的过程。对数据作图，就生成了 熔解曲线 。
三、反应体系
Component Diluent (Mol. Biol. Grade water) PCR Buffer MgCl2 dNTPs Forward primer Reverse primer SYTO®9 EvaGreen Taq DNA polymerase DNA Template Concentration 1X 1.5 mM 0.2 mM 300 nM 300 nM 1.5 µM 1-2X 1.25 U 3 x 109 copies/µL
扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。只要一个碱基发生了突 变，就会改变DNA链的解链温度。 解链温度差异极小，零点几摄氏度，使用高分辨率的仪器才可以检测。
孔间温度差异（温度均一性：Tm的标准偏差为0.020-0.264℃），孔间温度均一性要达到 0.264 ℃以内才能保证HRM分析结果的准确性。大多数Real Time PCR仪的孔间温度差在 0.3-0.5℃，决定了无法胜任HRM 熔解速率（最低要求：0.1℃/秒） 数据密度（最低要求：10个数据点/℃）
导数图 “速率”曲线的最高 峰是分离速率最大的 点，即等于熔解温度
HRM应用主要基于两种技术的 进步：
• •
双链DNA嵌入型饱和荧光染料如 LC Green 具有精确控温装置和高密度数据 采集的仪器
高分辨溶解(HRM)分析
一、原理
PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序 列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA 链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏 度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。 HRM分析采用高精密仪器，在拥有饱和染料和高 分辨率仪器之后，对 PCR的扩增子进行加热，温度从 50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐 解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA链分开，荧 光强度迅速降低。在HRM分析的初期，荧光强度很高， 随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下 降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个 过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。
HRM 的应用领域
1 、基因的突变扫描：检测杂合子 SNP 、区段 / 碱基缺 基因的突变扫描： 前后重复、杂合子缺失。 失、前后重复、杂合子缺失。 相关研究方向： 1 ） 样本中特定突变位点（ SNP ）的筛查，包括一 个片段中多个位点的复合杂合突变的Genotyping。 2 ） 疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的 扫描，新突变的发现。 3 ） 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。 4 ） 植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。 5 ） 动植物品质相关多态性位点的研究等。
6 ．法医学鉴定、亲子鉴定。 法医学鉴定、亲子鉴定。 检测单核苷酸多态性 SNP 鉴定，插入 / 缺 失多态性 DIP 鉴定等 将 HRM 用于法医学 SNP 、 DIP 鉴定，协 助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法， HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基 因分子标记鉴定的方法
高分辨溶解（ 第二课 高分辨溶解（HRM）分析 ）
hnxide@
高分辨率熔解（High-resolution melting，简 称HRM）分析是一门新兴的技术。它仅仅通 过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR 片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、 序列配对和基因分型等多个方面
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution melting curve）是一种广泛应用于基因分型、突变检测和SNP分析等领域的检测技术。
其基本原理是利用荧光染料与DNA双链结合，随着温度的升高，DNA双链会逐渐解旋，导致荧光强度的变化。
通过检测荧光信号的变化，可以获得一条关于温度的曲线，称为溶解曲线。
高分辨率溶解曲线分析的优势在于其高灵敏度和高分辨率。
它可以快速、准确地检测出不同DNA序列之间的差异，甚至能够区分相似度达到99.99%的DNA序列。
这使得高分辨率溶解曲线成为一种非常重要的基因分型和突变检测技术。
高分辨率溶解曲线的操作相对简单，通常包括以下几个步骤：1.样品准备：从生物样本中提取DNA，并进行纯化和扩增，以获得足够的DNA量。
2. PCR扩增：选择适当的引物，进行PCR反应，扩增目标DNA片段。
3.荧光染料加入：在PCR反应结束时，将荧光染料加入PCR体系中。
荧光染料可以与双链DNA结合，从而产生荧光信号。
4.温度梯度扫描：利用PCR仪器进行温度梯度扫描。
通过逐渐升高温度，将DNA片段逐渐解旋，并观察荧光信号的变化。
5.数据分析：通过对荧光信号进行分析，可以得到一条溶解曲线。
根据曲线的形状和荧光峰值的位置，可以判断样品中的DNA序列。
高分辨率溶解曲线的分析可以被广泛应用于许多领域，例如基因分型、突变检测、SNP分析等。
在基因分型中，通过对多个基因位点的高分辨率溶解曲线进行分析，可以确定个体的基因型。
在突变检测中，溶解曲线的形状和荧光峰值的位置可以指示是否存在DNA序列的突变。
而SNP分析则是通过溶解曲线的变化来检测单核苷酸多态性。
除了上述应用之外，高分辨率溶解曲线还可以被用于测定DNA的荧光特性和结构特点。
通过观察溶解曲线的形状和荧光峰值的位置，可以获得DNA的熔解温度、熔解曲线宽度等信息，进而了解DNA序列的稳定性和结构特点。
总之，高分辨率溶解曲线是一种重要的基因分型和突变检测技术。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线在战略管理中，高分辨率溶解曲线（High Resolution Melting Curve，HRM）是一项重要的技术，它用于检测DNA样本中的序列变异。
HRM技术通过监测DNA双链解旋和融合的过程中释放的荧光信号，能够快速、准确地分析DNA序列的变异情况。
本文将详细介绍HRM技术的原理、应用以及在人力资源管理中的潜在价值。
一、HRM技术的原理HRM技术基于PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）扩增的基础上，结合特定的荧光染料和曲线分析软件，实现对DNA序列变异的检测和分析。
在PCR扩增过程中，引物与DNA靶标序列结合，通过高温将DNA双链解旋成为两条单链，然后通过降温使引物与DNA靶标序列结合并生成新的双链，这个过程称为融合。
同时，荧光染料会与DNA结合，并放出荧光信号。
在HRM分析中，荧光信号会被连续监测并记录下来。
当DNA序列存在变异时，由于突变的序列结构和碱基成分的改变，其解旋和融合的过程会产生不同的热力学特性，从而导致荧光信号的变化。
通过分析荧光信号曲线的形状、峰值和面积等参数，可以准确地判断DNA序列是否存在变异。
二、HRM技术的应用领域1. 疾病诊断与预测HRM技术可用于检测与疾病相关的基因突变，例如肿瘤标志物、遗传性疾病、感染性疾病等。
与传统的测序方法相比，HRM技术具有快速、高通量、高灵敏度和低成本等优势，因此在疾病诊断与预测方面具有潜在的应用前景。
2. 品种鉴定与遗传分析在农业领域，HRM技术可用于鉴别农作物品种、检测动植物基因突变、分析遗传多样性等。
通过快速、准确地判断DNA序列的差异，可以帮助农业科学家提高品种鉴定的准确性，加速新品种的培育进程。
3. 药物研发与剂量调控HRM技术在药物研发中的应用主要包括药物基因敏感性筛选、药物代谢酶基因多态性检测等。
通过分析患者的基因型和药物反应之间的关系，可以优化药物疗效，减少药物副作用。
高分辨率熔解曲线
高分辨率熔解曲线（HRM）技术的应用举例HRM应用举例1 突变筛查HRM的特点是高灵敏度和高特异性，检测灵敏度可以达到1%-0.1%，既能检测出已知突变，也能检测出未知突变。
在大量样本、多个突变位点的筛查上，比传统的非均一性方法（如dHPLC）更方便、性价比更高，因为后者需要将扩增产物转移到另一台仪器上进行突变分析（表1）。
表1、突变检测方法的比较研究方法优点缺点直接测序法突变检测金标准，能发现已知和未知突变位点每个位点均需要经PCR扩增，然后测序，成本较高，工作量大，周期特别长，价格昂贵，不适合大样本、少位点的样本检测，容易交叉污染。
Taqman探针法适合已知突变位点、位点数量少、通量高的检测价格昂贵（探针合成费用高），不能同时发现未知突变位点普通PCR方法技术简便，价格便宜，仅适用已知SNP判断，不能确定何种突变，适宜少量样本检测费时费力，速度较慢，灵敏度差；RFLP仅能检测有酶切位点的片断，无酶切位点不能检测；上述方法都需要凝胶电泳，DNA链二级结构容易造成人工假相，使结果出现偏差。
SSCP、DGGE花费时间长、稳定性差、灵敏度有限，难以大规模开展工作。
芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点仅适用于全基因组扫描，不适宜单个或少数基因的突变位点检测，精度低，价格昂贵。
Illumina技术这种方案可以帮助研究人员在得益于起始样品量要求很低优点的同时，还能够检测多个感兴趣的区域，从而检出罕见的基因突变。
高通量检测，在全基因组上扫描分析上有优势，价格昂贵。
MALDI-TOF MS 质谱技术检测速度快，理论上能分开单个碱基变化这种纯物理检测易受到样本因素的多种干扰，如盐离子含量等，适宜于已经优化的特定突变检测，不适宜该服务商未做过或很少做过的新突变检测。
检测过程需要多点质控，否则精确度很低。
另外，很重要的一点是过程复杂：PCR+电泳+割胶+纯化等，最后才是质谱监测，PCR需要自己做，并不便宜。
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高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM) 分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。
HRM 原理
HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。
随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。
HRM 特点
由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。
基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR 基础上增加一个饱和染料。
所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。
高分辨率熔解曲线分析可以鉴别出PCR 产物中杂合的单碱基突变
这种方法比起普通的技术来说有更好的灵敏性和特异性。
采用这种方法进行的突变的检测不依赖于突变在片段中所在的位置。
当片段的大小在400 bp 或者更小时，灵敏性最高。
除了能鉴定出未知的杂合突变，高分辨率熔解曲线还可以被用来鉴定特定位点的突变，在这种情况下，扫描未知突变和进行基因分型可以结合在一起，使得分析更为简单。
对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。
在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。
HRM 技术在遗传学研究方面也带来很大便利，只需在PCR 反应体系中加入双链DNA 饱和荧光染料，在PCR 反应之后再花15 分钟，就可以完成96 或384 个样品的DNA 变异扫描。
HRM 在这些方面的优势使其具有极强的可操作性，成为近年来国外新兴的遗传学、方法学研究和应用热点。
HRM 技术优势
高通量：1 次可同时检测10-384 样本。
高敏度：HRM 检测灵敏度达1%-0.1% ，是传统“PCR+ 测序”方法25-250 倍。
特异性好：PCR 产物无需后续处理，特异性达100%。
重复性好：用HRM 方法进行分析时，样品经PCR 扩增后直接进行HRM，PCR 产物无需再转入其它分析装置，而直接在同一个PCR 管内进行分析，实现闭管操作，避免交叉污染。
操作简便：只需设计PCR 引物，进行PCR 反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限，在Roche LlightCyclerTM 480 荧光定量PCR 仪器上直接获得高分辨率熔解曲线分析，即可完成对样品基因型的判断。
成本低：相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且拓展了其应用面。
适用范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。
传统“PCR+测序”方法难以检测大部分不能手术的患者。
其它：只检测PCR 样品中荧光强度的变化，不消耗任何PCR 样品，无污染，PCR 产物可以进行下游分析。
HRM 技术不损伤DNA ，分析之后可以直接纯化测序，这使得它非常适合于测序前的SNP 预扫描筛查。
HRM 的应用
1、基因的突变扫描：检测杂合子SNP、区段/碱基缺失、前后重复、杂合子缺失相关研究方向：样本中特定突变位点（SNP）的筛查;疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的扫描，新突变的发现;遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现;植物抗逆性，突变与性状关联性的研究;动植物品质相关多态性位点的研究等。
2、基因组配型：器官移植的HLA 配型、同胞之间HLA 基因型确定应用举例：快速确定HLA 高度多态性位点的类型，及非亲源关系个体间异源造血干细胞移植前的HLA 基因型确认。
3、等位基因频率分析：SNP 频率分析等
4、物种鉴定、品种鉴定：微生物品种、物种快速鉴定；动植物品种鉴定应用举例：临床细菌的鉴定。
对临床细菌的培养物进行16SrRNA 的实时扩增，并进行HRM 分析，每个菌种的熔解曲线模式就如果该物种的分子指纹，从而可以根据HRM 的不同对细菌进行鉴定。
5、甲基化研究：甲基化位点的筛查；甲基化程度分析应用举例：用HRM 方法检测MGMT 启动子区域内的甲基化，可检测低达0.1% 的甲基化程度；并根据已知甲基化程度的标准曲线对未知样品的甲基化百分比进行测定。
HRM 是一种高灵敏度的甲基化检测方法，并且其高度的重复性和低成本将对肿瘤的研究和临床应用有很大帮助。
6、法医学鉴定、亲子鉴定：检测单核苷酸多态性SNP 鉴定，插入/缺失多态性DIP 鉴定等应用举例：将HRM 用于法医学SNP、DIP 鉴定，协助犯罪鉴定，亲子鉴定。
相对于传统鉴定方法，HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基因分子标记鉴定的方法。