白桦脂酸体外抗肿瘤的活性和机制

　第47卷　第3期吉林大学学报(理学版)Vol.47　No.3　2009年5月Journal of J ilin University(Science Editi on)May　2009

白桦脂酸体外抗肿瘤的活性和机制

王开祥1,张　慧2,郑克岩3,田家川1,由宇润4,孙　可1,费晓方1

(1.吉林大学生命科学学院,长春130021;2.辽宁中医药大学药学院,辽宁大连116600;

3.吉林大学化学学院,长春130021;

4.国家新药沈阳安全评价研究中心,沈阳110021)

摘要:研究白桦脂醇(Betulin)和白桦脂酸(Betulinic Acid,BA)对3种癌细胞株的增殖抑制作用以及白桦脂酸诱导MCF27细胞毒的分子机制.应用结晶紫染色方法对白桦脂醇和白桦脂酸对肿瘤细胞的生长抑制作用进行筛选;应用RT2PCR技术检测MCF27细胞p21mRNA,

p53mRNA,Bcl22mRNA和Bax mRNA的表达.结果表明,白桦脂醇和白桦脂酸有显著抑制肿瘤细胞生长的作用,且有浓度依赖性;白桦脂酸能够诱导MCF27细胞凋亡,并诱导其

p21mRNA和p53mRNA表达增高,但对其Bcl22mRNA和Bax mRNA的表达无影响.

关键词:白桦脂醇;白桦脂酸;细胞周期;凋亡

中图分类号:Q279 文献标识码:A 文章编号:167125489(2009)0320622206

Cytotoxi c ity and M olecule M echan is m of Betuli n i c Aci d

WANG Kai2xiang1,ZHANG Hui2,ZHENG Ke2yan3,TI A N J ia2chuan1,

Y OU Yu2run4,S UN Ke1,FE I Xiao2fang1

(1.College of L ife Science,J ilin U niversity,Changchun130021,China;

2.D epart m ent of D rug,L iaoning U niversity of Traditional Chinese M edicine,D alian116600,L iaoning Province,China;

3.College of Che m istry,J ilin U niversity,Changchun130021,China;

4.N ational N e w D rug Safety Esti m ate Center,Shenyang110021,China)

Ab s trac t:To investigate the anti2p r oliferative effect of betulin and betulinic acid on3kinds of hu man cancer cells and the mechanis m of betulinic acid induced cyt ot oxicity in MCF27cell line,crystal vi olet dyeing was used t o screen the cyt ot oxicity effect of betulin and betulinic acid in the cancer cells.RT2PCR was operated t o deter m ine the exp ressi on of p21mRNA,p53mRNA,Bcl22mRNA and Bax mRNA.This study shows that the gr owth of tu mor cells is significantly inhibited by betulin and betulinic acid in dose2dependence.The study als o indicates that betulinic acid induces the apop t osis of MCF27cells.So as t o make the exp ressi on of p21mRNA and p53mRNA increased but make the exp ressi on of Bcl22mRNA and Bax mRNA unchanged. Key wo rd s:betulin;betulinic acid;cell cycle;apop t osis

中药乌骨藤为萝藦科牛奶菜属植物通关藤(M arsdenia tenocissi m a(Roxb.)W ight et A rn.)的干燥藤茎.乌骨藤含有的独特化学成分具有免疫凋节、保肝利尿、败毒抗癌等作用,对胃癌、肝癌等多种肿瘤具有确切的疗效[122].中药乌骨藤主要含有白桦脂醇和白桦脂酸等成分[3].研究表明,白桦脂酸具有抗黑素瘤的活性[4];同时,对其他肿瘤,如神经内胚层脑肿瘤、神经胶质瘤等具有药理活性;此外,在抗H I V21感染方面也显示了较高的生物活性[5].但白桦脂酸的抗肿瘤机制目前尚还不清楚,对白桦脂醇

收稿日期:2008210227.

作者简介:王开祥(1986～),男,汉族,从事抗肿瘤机制的研究,E2mail:wangkaixiang068@.通讯作者:费晓方(1971～),女,汉族,博士,副教授,从事细胞凋亡及细胞周期调控的研究,E2mail:f oxf oxcn@.

抗肿瘤的活性研究报道也较少.本文筛选了白桦脂醇及白桦脂酸的细胞毒活性,并初步研究了白桦脂酸的抗肿瘤机制.

1　材料和方法

1.1　试　剂

白桦脂醇、白桦脂酸由辽宁中医药大学药学院张慧实验室从乌骨藤中提取精制,结构如图1所示.其他无机试剂均为国产分析纯

.

图1　白桦脂醇和白桦脂酸的化学结构

F i g .1　Che m i ca l structures of betuli n and betuli n i c ac i d

1.2　细胞培养

人宫颈癌细胞He La,人乳腺癌细胞MCF 27和Z R (购于中科院上海细胞库),含质量分数为5%的小牛血清(购于北京鼎国公司)和质量分数为2%的谷氨酰胺的RP M I 21640细胞培养液(购于美国GI B CO 公司)培养,培养温度为37℃,二氧化碳的体积分数为5%.

1.3　体外生长抑制实验

以104个/孔的密度将细胞接于96孔板中,培养过夜.贴壁后换为含有不同浓度样品的RP M I 21640培养液培养,分别培养24,36,48h 后取出,去除死亡细胞,用结晶紫染色方法

[6]为存活的细胞染色,用酶标仪测定染色后细胞在490n m 处的吸光度值A ,按下面公式计算细胞死亡率:

细胞死亡率%=(A 490对照-A 490样品)/A 490对照×100%,

其中,A 490对照和A 490样品分别为对照孔中和样品孔中细胞在490n m 处吸光度值的平均值.

1.4　细胞形态变化及D NA 断片化实验

1.4.1　细胞形态变化　以104个/孔的密度将细胞接于96孔板中,培养过夜,再加入含有不同浓度白桦脂酸的培养液,培养48h 后观察其细胞形态变化.

1.4.2　DNA 的断片化实验　收集5×106个细胞,用P BS (-)离心洗涤5m in,细胞沉淀用100μL 细

胞裂解液(10mol/L Tris 2HCl (pH =7.4),10mol/L E DT A (pH =8.0),质量分数为0.5%的Trit onX 2100)于4℃裂解25m in .12000r/m in 离心20m in,上清液转入另一EP 管中,加入10g/L RNase A (美国Sig ma 公司)溶液4μL,37℃孵育1h .再加入20g/L Pr oteinase K 2μL,37℃孵育1h .加入5mol/L 的NaCl 20μL 和异丙醇120μL (使终浓度为NaCl 0.5mol/L,异丙醇体积分数为50%),-20℃放置过夜.16000r/m in 离心15m in,除去上清液,加入20μL TE 缓冲液(10mol/L Tris 2Hcl (pH =7.4),10mol/L E DT A (pH =8.0))溶解.用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳分离.

1.5　RT 2PCR 实验

以105个/孔的密度将细胞接于6孔板中,加入含有质量分数为5%的小牛血清的RP M I 21640培养液培养过夜,再分别加入含不同质量浓度白桦脂酸的培养液,培养48h 后提取总RNA.加入500μL TR lz ol (日本T AK ARA 公司)混匀,室温静置5m in,再加入100μL 氯仿,振荡混匀,4℃条件下12000r/m in 离心15m in,将上清液转移至另一EP 管中,加入与上清液等体积的异丙醇,混匀,室温静置10m in,4℃条件下12000r/m in 离心10m in,弃去上清液,向沉淀中加入体积分数为75%的乙醇1mL 清洗沉淀,4℃条件下12000r/m in 离心5m in,弃去上清液,将沉淀于室温下干燥5m in,向沉淀中加入适量DEPC 处理水,使沉淀溶解,用于RT 反应.

326　第3期 王开祥,等:白桦脂酸体外抗肿瘤的活性和机制