白桦脂酸体外抗肿瘤的活性和机制

第47卷　第3期吉林大学学报(理学版)Vol.47　No.3　2009年5月Journal of J ilin University(Science Editi on)May　2009白桦脂酸体外抗肿瘤的活性和机制王开祥1,张　慧2,郑克岩3,田家川1,由宇润4,孙　可1,费晓方1(1.吉林大学生命科学学院,长春130021;2.辽宁中医药大学药学院,辽宁大连116600;3.吉林大学化学学院,长春130021;4.国家新药沈阳安全评价研究中心,沈阳110021)摘要:研究白桦脂醇(Betulin)和白桦脂酸(Betulinic Acid,BA)对3种癌细胞株的增殖抑制作用以及白桦脂酸诱导MCF27细胞毒的分子机制.应用结晶紫染色方法对白桦脂醇和白桦脂酸对肿瘤细胞的生长抑制作用进行筛选;应用RT2PCR技术检测MCF27细胞p21mRNA,p53mRNA,Bcl22mRNA和Bax mRNA的表达.结果表明,白桦脂醇和白桦脂酸有显著抑制肿瘤细胞生长的作用,且有浓度依赖性;白桦脂酸能够诱导MCF27细胞凋亡,并诱导其p21mRNA和p53mRNA表达增高,但对其Bcl22mRNA和Bax mRNA的表达无影响.关键词:白桦脂醇;白桦脂酸;细胞周期;凋亡中图分类号:Q279 文献标识码:A 文章编号:167125489(2009)0320622206Cytotoxi c ity and M olecule M echan is m of Betuli n i c Aci dWANG Kai2xiang1,ZHANG Hui2,ZHENG Ke2yan3,TI A N J ia2chuan1,Y OU Yu2run4,S UN Ke1,FE I Xiao2fang1(1.College of L ife Science,J ilin U niversity,Changchun130021,China;2.D epart m ent of D rug,L iaoning U niversity of Traditional Chinese M edicine,D alian116600,L iaoning Province,China;3.College of Che m istry,J ilin U niversity,Changchun130021,China;4.N ational N e w D rug Safety Esti m ate Center,Shenyang110021,China)Ab s trac t:To investigate the anti2p r oliferative effect of betulin and betulinic acid on3kinds of hu man cancer cells and the mechanis m of betulinic acid induced cyt ot oxicity in MCF27cell line,crystal vi olet dyeing was used t o screen the cyt ot oxicity effect of betulin and betulinic acid in the cancer cells.RT2PCR was operated t o deter m ine the exp ressi on of p21mRNA,p53mRNA,Bcl22mRNA and Bax mRNA.This study shows that the gr owth of tu mor cells is significantly inhibited by betulin and betulinic acid in dose2dependence.The study als o indicates that betulinic acid induces the apop t osis of MCF27cells.So as t o make the exp ressi on of p21mRNA and p53mRNA increased but make the exp ressi on of Bcl22mRNA and Bax mRNA unchanged. Key wo rd s:betulin;betulinic acid;cell cycle;apop t osis中药乌骨藤为萝藦科牛奶菜属植物通关藤(M arsdenia tenocissi m a(Roxb.)W ight et A rn.)的干燥藤茎.乌骨藤含有的独特化学成分具有免疫凋节、保肝利尿、败毒抗癌等作用,对胃癌、肝癌等多种肿瘤具有确切的疗效[122].中药乌骨藤主要含有白桦脂醇和白桦脂酸等成分[3].研究表明,白桦脂酸具有抗黑素瘤的活性[4];同时,对其他肿瘤,如神经内胚层脑肿瘤、神经胶质瘤等具有药理活性;此外,在抗H I V21感染方面也显示了较高的生物活性[5].但白桦脂酸的抗肿瘤机制目前尚还不清楚,对白桦脂醇收稿日期:2008210227.作者简介:王开祥(1986～),男,汉族,从事抗肿瘤机制的研究,E2mail:wangkaixiang068@.通讯作者:费晓方(1971～),女,汉族,博士,副教授,从事细胞凋亡及细胞周期调控的研究,E2mail:f oxf oxcn@.抗肿瘤的活性研究报道也较少.本文筛选了白桦脂醇及白桦脂酸的细胞毒活性,并初步研究了白桦脂酸的抗肿瘤机制.1　材料和方法1.1　试　剂白桦脂醇、白桦脂酸由辽宁中医药大学药学院张慧实验室从乌骨藤中提取精制,结构如图1所示.其他无机试剂均为国产分析纯.图1　白桦脂醇和白桦脂酸的化学结构F i g .1　Che m i ca l structures of betuli n and betuli n i c ac i d1.2　细胞培养人宫颈癌细胞He La,人乳腺癌细胞MCF 27和Z R (购于中科院上海细胞库),含质量分数为5%的小牛血清(购于北京鼎国公司)和质量分数为2%的谷氨酰胺的RP M I 21640细胞培养液(购于美国GI B CO 公司)培养,培养温度为37℃,二氧化碳的体积分数为5%.1.3　体外生长抑制实验以104个/孔的密度将细胞接于96孔板中,培养过夜.贴壁后换为含有不同浓度样品的RP M I 21640培养液培养,分别培养24,36,48h 后取出,去除死亡细胞,用结晶紫染色方法[6]为存活的细胞染色,用酶标仪测定染色后细胞在490n m 处的吸光度值A ,按下面公式计算细胞死亡率:细胞死亡率%=(A 490对照-A 490样品)/A 490对照×100%,其中,A 490对照和A 490样品分别为对照孔中和样品孔中细胞在490n m 处吸光度值的平均值.1.4　细胞形态变化及D NA 断片化实验1.4.1　细胞形态变化　以104个/孔的密度将细胞接于96孔板中,培养过夜,再加入含有不同浓度白桦脂酸的培养液,培养48h 后观察其细胞形态变化.1.4.2　DNA 的断片化实验　收集5×106个细胞,用P BS (-)离心洗涤5m in,细胞沉淀用100μL 细胞裂解液(10mol/L Tris 2HCl (pH =7.4),10mol/L E DT A (pH =8.0),质量分数为0.5%的Trit onX 2100)于4℃裂解25m in .12000r/m in 离心20m in,上清液转入另一EP 管中,加入10g/L RNase A (美国Sig ma 公司)溶液4μL,37℃孵育1h .再加入20g/L Pr oteinase K 2μL,37℃孵育1h .加入5mol/L 的NaCl 20μL 和异丙醇120μL (使终浓度为NaCl 0.5mol/L,异丙醇体积分数为50%),-20℃放置过夜.16000r/m in 离心15m in,除去上清液,加入20μL TE 缓冲液(10mol/L Tris 2Hcl (pH =7.4),10mol/L E DT A (pH =8.0))溶解.用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳分离.1.5　RT 2PCR 实验以105个/孔的密度将细胞接于6孔板中,加入含有质量分数为5%的小牛血清的RP M I 21640培养液培养过夜,再分别加入含不同质量浓度白桦脂酸的培养液,培养48h 后提取总RNA.加入500μL TR lz ol (日本T AK ARA 公司)混匀,室温静置5m in,再加入100μL 氯仿,振荡混匀,4℃条件下12000r/m in 离心15m in,将上清液转移至另一EP 管中,加入与上清液等体积的异丙醇,混匀,室温静置10m in,4℃条件下12000r/m in 离心10m in,弃去上清液,向沉淀中加入体积分数为75%的乙醇1mL 清洗沉淀,4℃条件下12000r/m in 离心5m in,弃去上清液,将沉淀于室温下干燥5m in,向沉淀中加入适量DEPC 处理水,使沉淀溶解,用于RT 反应.326　第3期 王开祥,等:白桦脂酸体外抗肿瘤的活性和机制 RT 反应按以下顺序加入试剂(日本T AK ARA 公司RNA PCR Kit (AMV )Ver .3.0试剂盒):MgCl 22μL,10×RT Buffer 1μL,RNase Free d H 2O 3.75μL,d NTP M ixture 1μL,RNase I nhibit or 0.25μL,AMV Reverse Transcri p tase 0.5μL,Random 9mers 或O ligo dT 2Adap t or Pri m er 0.5μL,样品RNA 1μL.按以下条件进行反转录反应:30℃10m in (使用Random 9mers 时,先进行30℃保温10m in,使Random 9mers 达到足够长度,以便在退火时与模板RNA 充分结合),42℃15～30m in,99℃5m in,5℃5m in .按下列组成配制PCR 反应液:5×PCR Buffer 10μL,灭菌蒸馏水28.75μL,TaKaRa ExTaq R HS 0.25μL,上游特异性PCR 引物0.5μL,下游特异性PCR 引物或M13Pri m erM4(反转录使用O ligo dT 2Adap t or Pri m er 时)0.5μL.将上述反应液加入到反转录反应结束后的PCR 反应管中,轻轻混匀.按以下条件进行PCR 反应,预变性:94℃2m in .扩增:94℃30s,55℃45s,72℃45s,35个循环.延伸:72℃,4m in,反应完毕,将样品用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测.引物:β2actin:5′2GTGGGGCGCCCCAGGCACCA Bcl 22:5′2CAGCTGCAGGTG ACG5′2CTTCCTT ATGTCACGCACG ATTTC;5′2ATGCACCT ACCCAGC;Bax:5′2ACCAAG AAGCTG AGCG AGTG p53:5′2CACTG ATTGCT CTT AGGTCT 5′2ACAAAG ATGGT CACGGT CTG;5′2AGTTGCAAACCAACCTG AGG;p21:5′2GTGG ACCTGTCACTGT CTTGT AC5′2CTTCCT CTTGG AG AAG ATCAGC .2　结　果2.1　白桦脂醇和白桦脂酸对肿瘤细胞的生长抑制作用图2和图3分别为白桦脂醇和白桦脂酸对不同肿瘤细胞的生长抑制曲线.经过细胞毒性筛选发现,白桦脂醇和白桦脂酸均能诱导肿瘤细胞生长抑制,细胞生长抑制率随剂量的增加而增加.He La 细胞和MCF7细胞对白桦脂醇和白桦脂酸的细胞毒比较敏感,而ZR 细胞敏感度较低.白桦脂酸较白桦脂醇的细胞毒作用强.100mg/L 的白桦脂酸诱导MCF 27细胞48h 后,细胞死亡率达到74%(图3(B )).(A )He La 细胞;(B )MCF 27细胞;(C )Z R 细胞.■24h;●36h;▲48h .图2　白桦脂醇诱导不同肿瘤细胞的生长抑制曲线F i g .2　D ose 2and ti m e 2dependen t i n h i b itory effects of betuli n on the growth of d i ffren t knobblycells(A )He La 细胞;(B )MCF 27细胞;(C )Z R 细胞.■24h;●36h;▲48h .图3　白桦脂酸诱导不同肿瘤细胞的生长抑制曲线F i g .3　D ose 2and ti m e 2dependen t i n h i b itory effects of betuli n i c ac i d on the growth of d i ffren t knobbly cells426 吉林大学学报(理学版) 第47卷　2.2　白桦脂酸诱导M CF 27细胞形态变化和D NA 裂解分析为了检验白桦脂酸诱导MCF 27细胞的生长抑制是否与凋亡有关,本文进行了细胞形态学考察.分别用浓度为0,1,10,100mg/L 的白桦脂酸诱导MCF 27细胞,培养48h 后观察其细胞形态变化,如图4所示.由图4(A )可见,1mg/L 白桦脂酸诱导48h 后,MCF 27细胞变圆并逐渐从培养瓶壁上脱落下来,如图4(B )所示.10mg/L 白桦脂酸培养48h 后,细胞膜发泡并呈现细胞核迸裂,逐渐形成凋亡小体,如图4(C )所示.100mg /L 白桦脂酸培养48h 后,大部分细胞形成凋亡小体,如图4(D )所示.(A )0mg/L;(B )1mg/L;(C )10mg/L;(D )100mg/L.(A )～(D )放大200倍凋亡细胞;(E )放大400倍凋亡细胞.图4　不同质量浓度的白桦脂酸诱导M CF 27细胞48h 后的形态变化F i g .4　D i fferen t concen tra ti on s of betuli n i c ac i d 2i n duced m orpholog i ca l changes of M CF 27cells after 48h2.3　白桦脂酸诱导M CF 27细胞产生D NA 断片A.0mg/L;B.1mg/L;C .10mg/L;D.100mg/L;E,F .mark .图5　不同质量浓度的白桦脂酸诱导M CF 27细胞48h 后的D NA 裂解F i g .5　D i fferen t concen tra ti on s of betuli n i c ac i d 2i n ducedD NA frag m en t a ti on of M CF 27cells after 48h 细胞凋亡伴随细胞质浓缩、细胞核崩裂、微粒消失、细胞膜皱缩、染色质浓缩继而解体,DNA 断裂成100bp 或180bp 的倍增片断,最后形成凋亡小体[7].为进一步验证凋亡现象,本文进行了DNA裂解分析.将质量浓度分别为0,1,10,100mg/L 的白桦脂酸培养液,培养MCF 27细胞48h 后,提取总DNA ,电泳后图谱如图5所示.由图5可见,细胞DNA 断裂为180bp 倍增的DNA 碎片.2.4　RT 2PCR 实验为进一步研究白桦脂酸是否对细胞周期有影响,本文还进行了白桦脂酸诱导MCF 27细胞周期检验点相关蛋白mRNA 表达的研究.RT 2PCR 实验结果表明,白桦脂酸明显诱导MCF 27细胞p53和p21的mRNA 表达增加,但是对Bcl 22mRNA 和Bax mRNA 的表达无影响,如图6所示.A.0mg/L;B.1mg/L;C .10mg/L;D.100mg/L.图6　不同质量浓度的白桦脂酸诱导M CF 27细胞48h 后Bcl 22,Bax,p53和p21m RNA 的表达变化F i g .6　Effects of d i fferen t concen tra ti on s of betuli n i c ac i d on Bcl 22,Bax,p53andp21m RNA expressi on i n M CF 27cell li n e after 48h culture526　第3期 王开祥,等:白桦脂酸体外抗肿瘤的活性和机制 626 吉林大学学报(理学版) 第47卷　3　讨　论通过细胞形态学分析及DNA裂解分析表明,白桦脂酸能够诱导MCF27细胞凋亡.本文选择了两个途径进行细胞凋亡的机理[829]研究.一个是与线粒体有关的Bcl22/Bax途径,另一个是与细胞周期相关的p532p21途径.Bcl22/Bax存在于线粒体膜上的蛋白质中.Bax基因高度保守区与Bcl22有广泛的氨基酸序列同源性,在活体中可自动形成同源二聚体.Bax激活诱导细胞凋亡而Bcl22的表达决定细胞的存活.通常Bax和Bcl22形成异源二聚体在细胞中存在,Bax和Bcl22出现的比率决定细胞能否存活.Bax2Bcl22二聚体控制凋亡时线粒体细胞色素C的释放水平,Bax促进细胞色素C释放,而Bcl22阻止细胞色素C 从线粒体中释放[10].一旦细胞色素C释放出来就会激活Cas pase9活性引起细胞凋亡[11].RT2PCR实验结果显示,Bax和Bcl22的mRNA表达水平均未发生变化,表明白桦脂酸诱导MCF27细胞凋亡与Bcl22/Bax的转录途径无关.p53通过信号转导参与细胞凋亡.外源p53在较高水平的DNA损伤细胞中或野生型p53缺失细胞中触发细胞凋亡[12].凋亡和生长抑制均由p53通过调节细胞周期依赖激酶的抑制因子p21的转录活性,或作为纺锤体检验点的一部分以确保有丝分裂中二倍体的稳定性完成的[13].对于有DNA损伤的细胞,通过激活p53基因启动p21基因表达.p21是G1/S期限制点的负向调控因子,使细胞周期停止进行DNA修复.p53与DNA序列结合参与一些基因表达的调节,如p53与抑癌基因p21/C I P1 (p21/C I P1基因编码的产物为p21蛋白)启动子特定序列结合启动或刺激p21/C I P1的转录,从而抑制CDKs2cyclins表达使细胞周期阻滞,抑制细胞生长.研究表明,野生型p53可以使含突变型p53的转化细胞生长停滞在G1期,并阻滞转化细胞的基因扩增[14215].这样DNA复制停止进行DNA修复,不能修复者诱导其凋亡.但激活的p53对DNA修复作用不大,当刺激引起DNA损伤而激活p53时,p53的作用主要为诱导细胞生长周期抑制或凋亡[16].细胞周期抑制使细胞内修复机制有足够的时间进行DNA 修复,避免了DNA损伤不断积累或传给下一代.p21功能障碍导致细胞越过G1期限制点,而激活的p53主要功能是产生细胞周期抑制.RT2PCR结果显示,p53的mRNA表达量升高,而p21的mRNA表达量也升高,因此,可以初步推测p53的mRNA表达量升高,导致了p21的mRNA的表达量增加.表明白桦脂酸诱导MCF27细胞凋亡与细胞DNA损伤和细胞周期的抑制有关.参考文献[1]　X I N G W ang2xing,CHE NG Rong2zhen,CHE N B in,et al.D iscri m inati on of Common Confounding Species of W uguteng[J].Research and Practice of Chinese Medicines,2004,18(1):33236.(邢旺兴,程荣珍,陈　斌,等.乌骨藤常见混用品种辨析[J].现代中药研究与实践,2004,18(1):33236.)[2]　S UN Jue,SHE N J ian2hua,ZHU M ei2hua,et al.Experi m ental Study on Therapeutic Functi on of“Carcinoma2Eli m inatingI njecti on”on Cell of Hu man Gastric Carcinoma[J].Acta Univ Traditi ons Medicalis Sinensis Phar macol ogiaequeShanghai,2000,14(2):41243.(孙　珏,沈建华,朱美华,等.消癌平对人胃癌细胞治疗作用的实验研究[J].上海中医药大学学报,2000,14(2):41243.)[3]　Z HANG Hui,Z HA I Yan2jun,CHU 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