种子引发课题组实验步骤

种子引发试验方案（一）预试验试验材料：郑单9581、找到最佳引发时间在垫有两层滤纸经过灭菌的培养皿中，分别加入0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.25mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L 的SA溶液10mL，每个培养皿均匀摆放50粒种子（腹沟向下，种胚向上），加盖后用封口膜密封，在15℃下引发，每个浓度有3个重复，随时观察萌发时间直至每个发芽盒有一两个种子突破种皮，再此基础上向前推6~12h，计算出的时间为引发的最佳时间T。

2、找到最佳引发浓度在垫有两层滤纸经过灭菌的培养皿中，分别加入0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.25mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L的SA溶液10mL，每个浓度有3个重复，每个培养皿均匀摆放50粒种子（腹沟向下，种胚向上），加盖后用封口膜密封，在15℃下引发T，引发结束后，用蒸馏水将种子快速冲洗干净，滤纸吸干种子表面水分，种子放于室温下回干至原始含水量。

以未进行引发处理的种子作对照。

选取籽粒饱满、均匀度一致的玉米种子进行培养，未进行引发处理的种子作对照，种子使用0．1% HgCl2消毒15 min，并用蒸馏水冲洗三次，直至冲洗干净。

发芽盒中加入11mL 15%的PEG-6000 溶液。

将引发和对照种子依次摆放在垫有两层滤纸经灭菌后的培养皿中。

每个发芽盒50 粒种子（腹沟向下，种胚向上），每个处理设置3次重复。

25℃下进行标准发芽试验，逐日记录种子根和芽的生长情况，判断在哪个浓度下生根发芽长势最好即为最佳浓度C。

(实验结果见表1)3、加速老化试验a 样品准备：在测定老化处理之前，如果不知道带测定种子批的水分，应采用标准水分测定法检查种子批的水分。

对于水分低于10%或高于14%的种子批，应在加速老化测定前将种子批的水分调节至10%-14%，然后将不同种子批的水分在相同温度和湿度条件下预先平衡含水量。

b①方案1选取3个使用过的老化盒、盖和网架经过热消毒或用15%次氯酸钠溶液浸洗（我们用的是0.1% HgCl2）并烘干，将适量蒸馏水40mL加入老化内箱中，放上网架，确信水不会渗到网架和将要放置的种子上。

称取40g玉米种子放在网架上，摊平成一层，以保证每粒种子均匀吸湿，再加上盖子（不用密封）。

老化外箱设置温度45℃。

将老化盒放入老化箱，老化72h。

取出后立即进行称重，自然条件下风干两天，使含水量降低至13%，再做发芽试验。

将老化后的种子进行标准发芽试验，3次重复，以未老化的种子做对照。

（实验结果见表2）玉米种子加速老化试验条件内箱外箱老化后种子水分种子重量（g) 箱数目老化温度老化时间（h)40.0 2 45 72 26-29②方案2热水浴老化法（Hot water aging method HW）：一定量的种子放入到小网袋内，将装有种子的网袋放入到58±1℃的水浴锅中，60min后取出晾于室温，风干到自然含水量。

邸宏,吕婷婷,刘玲玲,等.不同人工老化法测定玉米种子耐储性的比较分析[J].玉米科学,2015,23(3):71-75.（二）正式试验试验材料：郑单9581 种子引发处理在垫有两层滤纸经过灭菌的培养皿中，加入浓度为0.1 mmol/L的SA溶液10mL，每个浓度有3个重复，每个培养皿均匀摆放50粒种子（腹沟向下，种胚向上），加盖后用封口膜密封，在15℃黑暗引发36h，引发结束后，用蒸馏水将种子快速冲洗三遍，滤纸吸干种子表面水分，种子放于室温下回干至原始含水量。

以未进行引发处理的种子作对照2 种子干旱胁迫下吸胀发芽选取籽粒饱满、均匀度一致的郑单958玉米种子进行培养，未进行引发处理的种子作对照，种子使用0.1% HgCl2消毒15 min，并用蒸馏水冲洗干净将引发和对照种子依次摆放在垫有两层滤纸经灭菌后的培养皿中。

培养皿中加入11mL 浓度15%的PEG-6000 溶液。

每个发芽盒50 粒种子（腹沟向下，种胚向上），每个处理设置3次重复。

放在25℃下吸胀萌发7天，逐日记录种子根和芽的生长情况，统计发芽率，发芽势并计算发芽指数、平均发芽日数和活力指数。

3 种子吸胀期间生理生化指标测定将引发和未引发种子依次摆放在垫有两层滤纸经灭菌后的培养皿中。

引发和对照种子在培养皿中均加入11mL浓度15%的PEG-6000 溶液，引发和对照种子在培养皿中加入等量蒸馏水作为对照，每个处理设置3次重复，分别吸胀0、12、24、36、48h后，取出种子用滤纸将表面水分吸干，用刀片将引发和对照种子的种皮、胚和胚乳切割开并分别称取一定的重量，分别测定各项指标。

3.1可溶性蛋白含量的测定一、实验目的与要求植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。

考马斯亮蓝G-250染料结合法是常用的蛋白质测定方法之一。

通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理及方法。

二、实验原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，游离状态下呈棕褐色，与蛋白质结合后变成蓝色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm，蛋白质含量0～1000μg·mL-1范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量呈正比，故可用比色法测定。

考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合2min左右即达到平衡，完成反应十分迅速。

其结合物在室温下1h内保持稳定。

该反应非常灵敏，可测微克(μg)级蛋白质含量，是一种常用的蛋白质快速微量测定法。

其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定的差异。

三、实验材料与用具1.材料：新鲜或烘干的植物种子。

2.器材：分析天平；试管(10mL)；吸管(0.1mL、1mL、5mL)；研钵；漏斗；离心管(10mL)；容量瓶(10mL)；离心机；分光光度计3.试剂：(1) 标准蛋白质溶液：称取100mg牛血清蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成1000μg·mL-1的母液；取出10 mL该溶液，用蒸馏水稀释成100μg·mL-1的母液。

(2) 考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%的乙醇中，加入85%(m/v)的磷酸100mL ，最后用蒸馏水定容到1000mL ，此溶液可以在常温下放置一个月。

四、实验方法和步骤 1. 标准曲线的制作（1）0～100μg·mL -1蛋白质标准曲线的制作表2-1 0～100μg·mL -1蛋白质标准液的配制试剂(mL )1 2 3 4 5 6 0～100μg·mL -1蛋白质标准溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 马斯亮蓝G-250试剂 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量(μg·mL -1)20406080100取6支试管，按表2-1数据配制0～100μg·mL -1牛血清蛋白溶液各1mL 。

准确吸取所配各管溶液0.1mL ，分别放入10mL 具塞试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，将试管中溶液重复摇匀，静置2min 后，在595nm 下比色(比色应在1h 内完成)。

以牛血清蛋白含量(μg·mL -1)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。

（2）0～1000μg·mL -1蛋白质标准曲线的制作取6支试管，按表2-2数据配制0～1000μg·mL -1牛血清蛋白溶液各1mL 。

与步骤（1）操作相同，绘制出0～1000μg·mL -1的标准曲线。

表2-2 0～1000μg·mL -1蛋白质标准液的配制试剂(mL )1 2 3 4 5 6 0～1000μg·mL -1蛋白质标准溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 马斯亮蓝G-250试剂 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量(μg·mL -1)20040060080010002. 样品中蛋白质含量的测定(1) 称取0.1g 种子干样品，放入研钵中，放入少许石英砂，加5mL 蒸馏水或磷酸缓冲液在冰浴中研成匀浆，10000r 离心10min ，将上清液倒入10mL 容量瓶，定容至刻度。

(2) 另取1支试管，准确加入0.1mL 样品提取液，再加0.9mL 蒸馏水、5mL 马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min 后，以标准曲线1号试管做参比，在595nm 波长下比色，记录吸光度。

五、结果与分析根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量，按下公式计算：()()()()()310mL g mL g g /⨯⨯⨯=测定时取用提取液体积样品鲜重提取液总体积查得的蛋白质含量鲜重样品蛋白质含量μmg六、注意事项1．由于此法十分灵敏，所用容器必须清洗干净，取量准确，否则会造成大的误差。

2．比色应在出现蓝色2min ～1min 完成。

3.2种子可溶性糖含量SS 的测定（蒽酮法）一、实验目的与要求掌握蒽酮法测定种子中可溶性糖含量的原理和技术。

二、实验原理糖类(包括单糖、双糖、寡糖)在浓硫酸存在下，脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，然后蒽酮与糠醛或羟甲基糠醛经脱水缩合，生成蓝绿色的糠醛衍生物，其在可见光区620nm 波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的浓度成正相关。

其反应式如下：显色反应与反应温度、加热时间、反应系统中水和硫酸比例有关。

本实验通过控制反应系统中水和硫酸比例，利用硫酸与水发生水合作用释放的热能，使反应系统自行升温而达到显色效果免去外加热步骤。

蒽酮法具有很高灵敏度，适用于糖的微量测定（含糖量在20～200μg 范围内），且试剂简单，操作简便，因而得到普遍应用。

三、实验材料与用具1.材料：作物种子，烘干材料粉末(过筛100目)或剪碎混匀鲜样品。

CH HOCHC OCHO△糠醛CH CH OH CH CH HOHOHHO CHO+ 3H 2O浓H 2SO 4戊糖羟甲基糠醛CH CH OH CH CH CH 2OHOHHO CHOHOCH HOCC OCHOCH 2HO△浓H 2SO 4+己糖羟甲基糠醛蒽酮糠醛衍生物（绿色）2.器材：分光光度计，烘箱，恒温水浴锅，电子天平，20mL 具塞刻度试管，漏斗，20mL 、50mL 、100mL 容量瓶，试管架，研钵。

3.试剂：(1) 蒽酮乙酸乙酯试剂：称取分析纯蒽酮1g ，溶于50mL 乙酸乙酯中，贮存于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微加热使其溶解。

(2) 浓硫酸（相对密度为1.84）(3) 100μg·mL -1蔗糖标准母液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g 。