基因工程技术笔记整理

基因工程技术：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型。

质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中，它具有自主的复制和转录系统。质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝。

质粒的不相容性：利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存。

从细胞中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

溶菌酶：破坏菌体细胞壁；SDS和Triton X-100：使细胞膜裂解。

染色体DNA通常用于构建基因组文库和Southern杂交等。

基因组DNA的提取

植物基因组DNA提取：提取缓冲液（Tris.Cl—保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA，异丙醇—沉淀DNA（提染色体），TE（Tris.Cl,EDTA）--溶解DNA，RNase—保存液，降解RNA，NaAC—加盐，70%乙醇—漂洗。

细菌基因组DNA提取：SDS，蛋白酶K，氯仿：异戊醇（24：1）-- 沉淀DNA，苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）-- 抽提，70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—调节离子强度，RNase A，CTAB/NaCl 溶液—CTAB--一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，异丙醇/无水乙醇—沉淀上清液。

总RNA制备

mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。仪器—玻璃器皿：200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液处理—所有器皿最后硅烷化处理。

RNA酶抑制剂：DEPC--强烈但不彻底，与氨水溶液混合会产生致癌物；异硫氰酸胍--最有效，使RNA酶失活；其他--RNA酶蛋白抑制剂（RNasin）SDS, 尿素等。

细胞内总RNA制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先将组织在液氮中研磨成粉末）

异硫氰酸胍热苯酚法：异硫氰酸胍(GIT)与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT与十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)作用使蛋白质变性。

酚/SDS法：用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA 和其它不纯物。

Trizol法：Trizol试剂（含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等）。

mRNA提取

制备mRNA原理：分离的总RNA 可利用mRNA3’端含有poly(A)的特点，用oligo(dT)纤维素柱分离，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。然后经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。（上样buffer和洗脱buffer）。溶液中无盐时要沉淀RNA，必须加盐NaAC。

琼脂糖凝胶电泳

DNA凝胶电泳：琼脂糖-- 分离DNA片段大小范围广；聚丙烯酰胺-- 小片段，分辨力高。

琼脂糖凝胶电泳特性：1.DNA分子大小：DNA分子在一定琼脂糖浓度下的迁移率；2.琼脂糖浓度：1.0-1.2%；3.DNA分子构象：超螺旋DNA最快，线状双链最慢；4.电源电压：不大于5V/cm，负—正；5.染料：溴化乙锭（EB）--强诱变剂；6.离子强度：0.5*TBE（不能过高，避免buffer发烫）。

RNA凝胶电泳：RNA分子有很多二级结构，需经变性剂处理，可以破坏RNA中的二级结构。然后，用琼脂糖凝胶电泳可分级分离不同大小的mRNA分子。

RNA琼脂糖凝胶电泳方法有三种：乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞（剧毒）琼脂变性电泳。

DNA限制性内切酶

限制性内切酶：限制性内切酶是指能特异性结合于一段被称为限制性识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。

I类酶：结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的DNA；II类酶：由二种酶分子组成的二元系统（核酸酶—切割、甲基化酶—修饰），其识别位点和切割位点是同一位置；III类酶：在识别位点之外切割DNA 分子，然后从底物上解离。甲基化：保护DNA分子，越活跃的地方，甲基化程度越低。

切割性能：回文对称特异核苷酸序列、平末端DNA片段、粘性末端。

酶单位：在合适缓冲液和反应温度下，在20ul反应体积中一小时内完全降解1mg DNA 所需要的量。

载体：把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA 技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。常见载体：质粒、λ噬菌体、粘粒、BAC、YAC等。

质粒载体的特性：分子量小、多拷贝、松弛控制型；具有多种常用的限制性内切酶的单切点；能插入较大的外源DNA片段；具有容易操作的检测表型。

pBR322、pUC18/19（分子量更小、α-互补原理—蓝白筛选、多克隆位点区MCS）、pBluescript SK(+/-)（MCS）。

乳糖操纵子：

α-互补原理：lacZ（β-半乳糖苷酶基因）基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间可以实现互补的现象。

蓝白斑筛选：X-gal-----IPTG（乳糖类似物—诱导剂）--------蓝色吲哚产物

（当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色）。

λ噬菌体：侵染细菌的病毒（裂解性侵染、溶源性侵染）。

【碱性磷酸酶--活性好, 但较抗热和去污剂,在去磷酸化反应后很难去除】

细胞转化（transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段（E.coli）。

【如需将质粒载体转移进受体细胞，需诱导受体细胞产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA.】

感受态细胞：受体细胞经一些特殊方法（如CaCl2、RbCl（KCl）等化学试剂）处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞状态。【LB培养基不含Amp，设2个对照（防污染）】

提高转化效率的因素：细胞生长状态和密度（刚进入对数生长期）、质粒的质量和浓度（DNA溶液体积不超过感受态细胞体积的5%）、试剂质量（最高纯度）、防止杂菌和杂DNA 污染（无菌器皿）。