马铃薯茎尖脱毒培养技术研究21页PPT
我国马铃薯茎尖培养脱毒和脱毒试管苗微繁研究进展
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内 蒙 古农 业科 技
职教专辑
霉素类植物生长物质， 多数研究者采用 !"# ， 且浓 度 在 $% $& ’ $% ($)* + , 的 居 多 ， 少 数 人 采 用 $% &)* + , 或 -% $)* + ,. 笔者以 /0 1 2""$% -)* + , 1 3 4 5"$% -)* + , 1 !"# $% -)* + , 诱导 6 个生产 用种， 均获成功。 先将茎 -77& 年肖玉兰采用分阶段培养方案： 尖接种在分化培养基 8 /0 1 泛酸钙 ()* + , 1 肌醇 &$)* + , 1 !"$% 6)* + , 1 蔗 糖 (&* + , 1 琼 脂 3* + ,9， #$: 后转入茎尖生长培养基 8 /0 1 5"$% &)* + , 1 !"$% 6)* + , 1 2""$% $$()* + , 1 蔗 糖 (&* + , 1 琼脂 3* + , 9 ； 李静华等则采取先以 - + (/0 1 ;< "" -)* + , 1 (= 6 4 > 丁酯 $% &)* + , 1 ?@ -)* + , 培养， 泛绿后转入 - + (/0 1 A@ -)* + , 1 (= 6 4 > 丁酯 $% &)* + , 。茎尖成活率一般在 (6B ，成活 株中脱毒苗占 &$B 。 -% -% # 培养条件 液体培养的以 (- ’ (&C ，光 照 #$$$ ’ 6$$$DE 进行培养；固体培养的多采用 (&C 或上下浮动不超过 (C ，稍宽一点的范围是 -F ’ (&C 或 ($ ’ (&C 。 光照强度多为 ($$$DE 或以 ($$$DE 为中心上下浮动不超过 -$$$DE，也有严格 限定在 (&$$ ’ #$$$DE 的。光周期则多采用 -3G + :， 也有用 -(G + :， 少有用 -$G + : 的。 若以滤纸桥法 液体培养， 在光照强度 -$$$ ’ #$$$DE 、 光照 -3G + : 的条件下， 经 -($: 的培养， 茎尖即可长成小苗。 -77F 年李天然认为：马铃薯茎尖在 -$$DE 下培养 (F:，然后扩大为 ($$DE ，而在芽长到 -H) 左右时 必须扩大光量达 6$$$DE ， 否则生长不好。 -% -% 6 病毒种类 依司怀军所述，马铃薯茎尖 培养 脱毒按 从易到 难的顺 序为： I,JK、 IK"、 IKL、 I"/ K、 IK/、 IKM、 IK0， 另有类病毒 I0@K: 较 IK0 更难脱去， 而很多实验证明有些病毒也可 （烟草花叶病毒） 侵入分生组织， 如 IKM、 均 @/K 可侵入茎尖， 所以顶端分生组织可以汰除病毒， 但 并不是所有的均可汰除，因而必须采用与热处理 结合的顶端分生组织培养方法， 先热处理母株， 然 后切取顶芽进行培养。二法相结合处理可除去部 分单用茎尖培养难以汰除的病毒。 /N,,NO 和 0PQHN ’ 0)RPG 以 ## ’ #SC 热处理 长根的茎 6( ’ &3: 后剥取 $% - ’ $% #)) 茎尖培养 去除了 F&B IKM 和 3(B IK0= 这一方法适用于以 未能完全脱除病毒的试管苗的再脱毒处理。其他 以块茎为处理对象的研究，恒温处理温度中间值 分别为 ##% &C = #S% &C = #FC ， 在此范围内， 选择
论文 ppt
1.2.1 脱毒试管苗的制取
（1）脱毒材料的选择及催芽 （2）茎尖剥离、消毒及接种 （3）茎尖培养
在用作脱病毒原种苗之前，必须进行病毒检测证明 无病毒后才能推广。一般用ELISA（酶联免疫吸附试验）、 血清学方法和指示植物鉴定法。从中筛选出脱毒试管苗 用于继续繁殖。马铃薯X病毒和S病毒离生长点很近，茎 尖剥取长度须在0.2mm以下，Y病毒等离生长点较远， 茎尖切取0.3~0.5mm就可以去掉，X病毒脱去与否是植 株有无病毒的重要标志，因此应特别注意对X病毒的检测。
170
440 22.30 8.6
1700
4400 2230 860
微 量 元 素
Na2MoO4·2H2O
CoCl2·6H2O H₃BO₃ KI GuSO4·5H2O
0.25
0.025 6.2 0.83 0.025 37.25 27.85
25
2.5 620 83 2.5 3725 2785 1000 100 10 1000 100 10
1.1 热处理法
热处理法是利用病毒和寄主植物对高温的忍耐性的差异，使植物的 生长速度超过病毒的扩散速度，得到一小部分不含病毒的植物分生组织， 然后进行无毒个体培育。选择适当的温度和处理时间，植物组织中的很 多病毒被部分地或完全地钝化而可控制其的活动，但很少伤害甚至不伤 害寄主组织，从而让植物细胞加快生长，使生长点附近不带病毒，从而 达到脱毒的目的。主要缺点是脱毒时间长，脱毒不完全，例如TMV这类 杆状病毒就不能用这种方法脱除，因而该方法有一定的局限性。
马铃薯的脱毒培养快繁PPT课件
马铃薯的脱毒试管苗
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再将其转入生长箱中，每天光照16 h， 光照强度3000-4000 lx。2 周后去掉顶芽， 以促进腋芽的生长。当腋芽长到1-2 cm时， 折下腋生枝，用于消毒、接种。
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（2）消毒： 水洗干净，无菌条件下先用70%的酒精
浸组织15-20 s，再用2%次氯酸钠溶液浸泡 4-5 min，然后用无菌水冲洗3 次。
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（3）接种： 把芽置于解剖镜下，左手用一把镊子将
芽按住，右手用解剖针将叶片和叶原基剥 掉，当形似一个闪亮半圆球的顶端分生组 织充分暴露出来后，用锋利的长颈刀片将 分生组织切下来，上面可带/也可不带叶原 基，再用刀片将其接种到培养基上。
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（4）培养基： MS 培 养 基 （ 提 高 NH4+ 、 K+ 浓 度 ， 利 于
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4、微型种薯的扩大繁殖 采用试管、温室、底畦生产的微型薯原原 种，可进一步通过塑料大棚或大田在春秋 两季扩大繁殖，以提供足够大田使用的优 良种薯。
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思考题：
１、对马铃薯脱毒苗的培养大致分几个 阶段？各阶段是怎样操作的？ ２、马铃薯的生物学习性有哪些？
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（二）微型薯生产技术 1、试管生产 （1）单茎节扩大繁殖：由无性繁殖的
试管苗中获得茎切段（每个茎段带1-2个 叶 片 或 腋 芽 ） ， 每 个 三 角 瓶 里 接 4-5 个 茎 段，进行培养。
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（1）单茎节扩大繁殖： 培养条件：22 ℃，16 h补充光照1000 lx
马铃薯茎尖脱毒及组培快繁技术研究
配 置 成 ５ ０ ｇ Ｌ的 溶 液 待 用 。 当两 个 品 种 的种 薯 芽 长 ０ ／ ｍ
到 ２ ３ｃ ～ ｍ时 ． 选 生 长 健 壮 的 芽 ， 清 水 冲 洗 芽 部 表 挑 用
面 污 物 ．在 无 菌 操 作 室 采用 ｌ 种 不 同 的方 法 进 行 表 面 ２ 消 毒 ， 最 近 制 作 的蒸 馏 水 冲洗 四 五 次 ， 表 面 消 毒 剂 用 将 彻 底 清 除 ， 同表 面消 毒 剂 处 理 时 间 见 表 １ 不 。
２１ ０２年第 １ ６期
马铃 薯茎 尖脱毒及组培快 繁技术研究
田 成 津
（ 海 大 通 县 农 业 生 态 环境 与 可再 生 能 源 工作 站 ， 海 大通 青 青 ８ ００ ） １ １０
摘 要 ： 以下寨 ６ ５和青薯 １８为实验 对 象， 用不同培养基 ， ６ 采 对马铃薯 两个 品种进 行脱毒及组培 ， 对培养 基及 关键技 术措 施进行 了分析 ， 结果表 明 ： 与青 薯 １ ８ 不 同培 养 中生长表现不 同， ６在 下寨 ６ ５茎尖组织在 Ｍ Ｓ中加入 Ｂ ２ Ａ ｍ／ ｇ Ｌ的培养基 中生长表现 突出， 而青薯 １８茎尖组织在 Ｍ ６ ｓ中加入 Ｂ ２ｍ ／ Ａ ｇ Ｌ的培养基 中成苗率较 高。 同等条件下 ， 在 加入 ＩＡ ．０ ｇＬ的培养基宜用于下寨 ６ 脱毒苗 的组织快繁 ，加入 ＩＡ０ ３ ｍ ／ Ａ ５ ｍ ／ ０ ５ Ａ ． ０ ｇ Ｌ的培 养基宜用于青薯 １８脱毒 ６
厂化生产提供帮助 。
１ 材 料 和 方 法
１ １ 供 试 材 料 ．
１２ １ 催 芽 于 １ 月 中 旬 左 右 ， 拣 表 皮 光 滑 、 常 ． ． １ 挑 正 薯 形 、 小 均 匀 、 病 害 和 无 损 伤 薯 块 ， 置 在有 供 暖 的 大 无 放 房 间 ， 内温 度 ２ 室 ４℃ 左 右进 行 催 芽 。 催 芽 前 薯 块 正 处 在 于 休 眠期 ， 用 ０ ０ ～ ０ １ ｇ Ｌ的 Ｇ ３ 处 理 薯 块 ， 采 ．５ ．０ ／ ｍ Ａ来 浸 没 于 Ｇ ３溶 液 中 １￣ ２ ｉ ， Ａ ０ ０ ｎ 以打 破 休 眠 ［。 ｍ ４ ］ １２ ２ 种 薯 处 理 ．． 采 用 Ｍ 培 养 基 ， 入不 同 配 比的 激 Ｓ 加 素 ， 备 Ｂ 、Ａ 、Ａ 、Ｂ 准 ＡＮ Ａ Ｇ 。ＩＡ和 ＩＡ 由 于 激 素 在 培 养 基 中 Ａ，
马铃薯茎尖脱毒培养技术研究
马 铃薯 茎 尖脱毒 就 是利用 该原 理 ，把茎 尖 剥离 接 种到 培 养基 上 ，进而培养马铃薯种薯或微型薯 。 ２ 操 作 方 法
剪取促芽后的马铃薯块茎上合适大小的芽若干个 ，冲洗干净 后放于烧杯内用纱布封 口，置于 自来水下反复冲洗 ４０分钟，吸干 表面水分放进超净工作台进行深层消毒；先用 ７５％酒精浸泡 ２０～ ４５ｓ，无菌水冲洗 ３次 ；再用 ｏ．１％的升汞浸泡 ８￣１０ｍｉｎ，无菌水冲洗 ５次 ，冲洗时轻轻晃动烧杯时消毒剂彻底被漂洗掉 ，之后置于无 菌 滤纸 待用 。
毒 效果 的 因素进 行 了详 细分析 ，进 一步 阐述 了对病毒 检 测的 常 用方 法。
关 键词 ：马铃 薯 ；茎 尖脱毒 ；病毒 检 测
中图分 类号 ：￥５３２
文 献标 识码 ：Ａ
文章编 号 ： １６７４—０４３２（２０１３）一１０—２３—２
马铃薯是我国重要的粮食作物 ，近年来 ，政府加大力度发展 现代 马 铃 薯 产业 ，促 进 了马 铃 薯 产业 的 快速 发 展 ，种植 面 积 和 鲜 薯产量均居世界首位 ，产业链条逐步拓展 ，经济效益稳步提升。但 是 ，马铃薯是通过块茎进行的无性繁殖 ，在连年种植过程 中土壤 和种薯本身携带的病害逐年严重 ，导致品种退化 ，严重降低了马 铃薯的产量和品质。１９５５年法国 Ｍｏｎｅｌ通过剥离马铃薯茎尖获 得 了不 带病 毒 的 马铃 薯 脱 毒苗 ，引起 了 科学 界 的广 泛 关 注 ，世 界 各地纷纷采用马铃薯茎尖脱毒快繁应用于大田生产 ，提高马铃薯 产量 ，改善其品质。 １马 铃薯 茎 尖脱 毒原 理
马铃薯茎尖组织培养脱毒技术要点
灵、 绿亨一号等杀菌剂及时 涂抹防治 ， 阻止病菌 浸入危害 。将 去掉的老叶清出棚外深埋 ， 防止病菌的传染 。 ２ 采 用吊秧栽培 管理 吊秧是调节长势 、增加 生长空间 、 ． ３ 合理利用光能 、 增产增效 的一 种新 的栽培措施 。在吊秧栽培中 应注意 以下 几点 ： 吊绳 要选择抗老化 的聚乙烯高 密度塑料线 ； 铁丝架设高 度控 制在距离棚膜 ３ｃ ０ｍ左右 ， 如果架设过矮会 影 响棚室空 间利用率 ；吊绳 的方法是下端用 一活扣固定在植株 上或用死扣 系在 叶柄上 ，上端 用活扣 系在 铁丝上并应 多余一 部分 ， 以便后期落秧时随 秧一起下落 ； 吊绳调节瓜秧 的长 利用 势 。如果瓜秧长势过 旺或出现徒长 ， 要将 生长 点向下弯 曲 ， 如 果 瓜秧 长势较弱 ， 要把生长点夹在吊绳缝中让 其直立 生长 。通 过 吊秧 ，还可以控制 瓜秧的生长 点由南到北成为一 稍微倾斜 的斜线 ， 达到北高南低 ， 以使受光均匀 ， 产量一致 。
技 术版 块
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园艺
ｉｓ ｕｂ ｕ Ｊｉ ｈ ａｎｋ ｉ Ｊ ｓｈｕ ｂ ｎ ｋ ａ ａ ｕ
技 术ｌ
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１法 国 冬 玉 西 葫 芦 的 经 济效 益 ．
不暴露 在空气中 ， 待温 室内干燥 后 自然变黄枯 萎 ； 次去叶数 每
冬玉西葫芦 是从法国 引进 的极 耐寒越冬 １光 温室栽培 的 ９ 优 良品 种 ，并在 公主 岭 大 岭 乡温 室 试 种成 功 。每 栋 温 室 （０ ｍ２平均产西葫芦 ２ ０ｋ ， ６０ ） ５ ０ ｇ 在市 场上平均批 发价是 ０ ． ９元 ／ｇ每栋温室收入 ９０ 元 。 ｋ， ００ 每栋温室年产值 ６ 万元 ， 扣除每栋 费用 １ ． ５万元 ， 每栋年纯收入 ４５ ．万元 。
马铃薯茎尖脱毒及组培快繁技术研究
马铃薯茎尖脱毒及组培快繁技术研究摘要：以下寨65和青薯168为实验对象，采用不同培养基，对马铃薯两个品种进行脱毒及组培，对培养基及关键技术措施进行了分析，结果表明：与青薯168在不同培养中生长表现不同，下寨65茎尖组织在MS中加入BA2 mg/L 的培养基中生长表现突出，而青薯168茎尖组织在MS中加入BA2 mg/L的培养基中成苗率较高。
在同等条件下，加入IAA 0.50 mg/L的培养基宜用于下寨65脱毒苗的组织快繁，加入IAA 0.30 mg/L的培养基宜用于青薯168脱毒苗的组织快繁。
关键词：马铃薯；茎尖脱毒；组织快繁我国是马铃薯生产第一大国，2008年种植面积达到573.33万hm2，鲜薯总产达8 800万t，平均单产约15.45t／hm2，总产位居世界第一[1]。
马铃薯是无性繁殖作物，体内病毒的积累可使品种种性退化、品质和产量降低，对其生产造成严重危害[2]。
因为大部分病毒不能感染马铃薯茎尖组织，通过茎尖脱毒，生产脱毒种薯用于生产是防止马铃薯退化的切实可行的措施[3]。
马铃薯脱毒及组培快繁中所用基质和培养条件等关键技术方面的报道较多，但对下寨65和青薯168报道较少，本文既通过对马铃薯下寨65和青薯168两个品种进行脱毒及组培试验研究，为西部高原地区当家品种脱毒种薯的工厂化生产提供帮助。
1材料和方法1.1供试材料采用当家品种下寨65和青薯168。
1.2试验方法1.2.1催芽于11月中旬左右，挑拣表皮光滑、正常薯形、大小均匀、无病害和无损伤薯块，放置在有供暖的房间，室内温度24 ℃左右进行催芽。
在催芽前薯块正处于休眠期，采用0.05～0.l0 mg/L的GA3来处理薯块，浸没于GA3溶液中10～20 min，以打破休眠[4]。
1.2.2种薯处理采用MS培养基，加入不同配比的激素，准备BA、NAA、GA3、IBA和IAA，由于激素在培养基中用量非常少，且不易溶于水，所以采用特殊的配置方法，配置成500 mg/L的溶液待用。
20.项目七 马铃薯茎尖培养脱毒技术
• 三、脱毒苗的保存方法
• 无毒苗要很好的保存，可以在生产上经济有效地发挥作 用。常用的瓶苗继代保存需要在培养基中加入一些生长 延缓剂。
• 但无病毒植株并没有获得额外的抗病性，它还可能被同 一病毒或不同病毒感染。
• 低温保存是在苗长到2cm左右时，放在4℃冰箱内的暗处 保存，可保存一年。而在液氮低温-196℃中保存，细胞 的代谢完全停顿，可以长期保存。
• 一、马铃薯脱毒苗ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ段组培技术
• 目前多应用茎段组织培养技术来快速繁殖脱毒苗，茎段组 织培养是指带有腋芽或叶柄、长数厘米的茎节段进行离体 培养。
• （一）茎段培养的培养基
• 在实践中，一般茎段培养用的培养基仍然是MS培养基， 但不像茎尖培养严格，为了降低成本，有时有机成分和微 量元素可酌减，只用大量元素和少数微量元素，并用白糖 代替蔗糖，琼脂改用0.5%等。
• 马铃薯茎尖培养一般常采用半固体（琼脂培养基）培养， 但去掉琼脂的液体培养基培养效果更好。
马铃薯茎尖培养培养基的成分表（mg/l)
成分 硫酸镁 磷酸二氢钾 硝酸钙 硫酸铵 硝酸钾 氯化钾 盐酸吡哆醇 马铃薯
蔗糖 琼脂
含量 125 200 100 100 1000 35
1 10% 90000 0.6%
• 已知感染马铃薯的病毒有18种，类病毒有1种。
• 在我国已发现7种专门寄生于马铃薯的病毒，即马铃薯X病 毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯 S病毒(PVS)、马铃薯 M病毒(PVM)、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯奥古巴花叶病毒 （又叫黄斑花叶病毒，简称PAMV）和马铃薯卷叶病毒 (PLRV)。
• 马铃薯由于具有高产、生育期短、适应性广、抗灾害能力 强、营养丰富、用途广泛等优势，在世界范围内广泛种植， 已成为世界第四大粮食作物。
《茎尖培养脱毒技术》课件
05
茎尖培养脱毒技术的发展前景
技术创新与改进
自动化与智能化
通过引入机器人和人工智能技术 ，实现茎尖培养脱毒技术的自动 化和智能化，提高工作效率和准 确性。
高效快速繁殖
研究更高效的繁殖方法，缩短培 养周期，提高脱毒苗的繁殖速度 ，以满足大规模生产的需求。
基因编辑技术
利用基因编辑技术对植物进行精 确的基因改造，提高茎尖培养脱 毒技术的成功率和应用范围。
《茎尖培养脱毒技术》PPT 课件
目录
• 茎尖培养脱毒技术简介 • 茎尖培养脱毒技术的操作流程 • 茎尖培养脱毒技术的优缺点 • 茎尖培养脱毒技术的应用实例 • 茎尖培养脱毒技术的发展前景
01
茎尖培养脱毒技术简介
茎尖培养脱毒技术的定义
茎尖培养脱毒技术是一种利用植物组织培养技术，对植物的茎尖 进行离体培养，诱导产生无病毒的植株，进而实现脱除病毒的目 的。
降低技术难度
简化操作步骤，降低对操作人员的技 术要求。
增强遗传稳定性
研究如何减少茎尖培养脱毒技术获得 的植株在遗传上的变异，提高其后代 的稳定性。
扩大适用范围
进一步探索该技术在更多种类的植物 上的应用，以扩大其适用范围。
04
茎尖培养脱毒技术的应用实例
在马铃薯脱毒中的应用
总结词
茎尖培养脱毒技术在马铃薯脱毒中应用广泛，有效解决了马铃薯病毒病问题，提高了马铃薯产量和品 质。
详细描述
除了马铃薯和草莓，茎尖培养脱毒技术还可应用于其他作物的脱毒处理，如甘蔗、葡萄 、花卉等。该技术的应用能够提高这些作物的抗病性和产量，改善品质，为农业生产和 园艺产业的发展提供有力支持。随着科学技术的不断进步和应用领域的拓展，茎尖培养
脱毒技术将继续发挥重要作用，为农业和园艺产业的可持续发展做出贡献。
马铃薯茎尖脱毒培养技术的研究进展
生 组织 旺 盛 的新 陈 代谢 活 动 。病 毒 的 复制 须利 用 寄 理后 再 进 行茎 尖 剥 离 ，发 现 可 以完 全脱 除 马 铃薯 卷 主 的 代谢 过 程 ，无 法 与分 生 组织 旺盛 的代 谢 活 动竞 叶病 毒 （ Ｌ Ｖ） Ｐ Ｒ ，用 变 温 培 养 处 理 ，Ｖ 脱 毒 率 为 ＰＸ 争 ； ２ 分生 组 织 缺乏 真 正 的维 管组 织 。大 多 数 病 毒 ９ 。 ， （） ６２ 比恒 温热 处 理 Ｐ Ｘ 的脱 毒 率高 。王 秀英 ｌ研 ％ Ｖ １ ｌ 】 在 植 株 内通 过 韧 皮部 进行 迁 移 ，或 在 细胞 间通 过胞 究 表 明 ： 高温 预 处 理对 提 高茎 尖 脱 毒率 效 果 明显 ， 可 问连 丝传 输 ， 为细 胞 与细 胞 间 的移 动速 度 较慢 ， 因 在 以把 不易脱 去 的 Ｐ Ｘ、Ｖ 、Ａ ｖ Ｐ Ｓ Ｐ ＭＶ脱 去 。 Ｓ Ｖ Ｐ Ｔ ｄ是 最 快 速 分 裂 的组 织 中病 毒浓 度 高 峰被 推 迟 ；３ 高 浓 度 难 以除去 的 ， 一 般 的方 法很 难 获得 无 病 毒植 株 ， （） 用 但 的生 长素 。分 生组 织 的生长 素 浓度通 常 很高 ， 可能 影 经过 热处 理则 可 以除去 。 罗玉等 ＿采 取选 健康 整薯 室 ｌ ７ Ｊ
因素 做 出综 述 ．以期 为 马铃 薯茎 尖 脱 毒技 术 的 深入 而 很少 伤 害 寄 主组 织 ， 而抑 制病 毒 的增殖 、 缓病 从 减 研 究 提供参 考 。
毒 在植 株体 内的扩增 速度㈣。 因此 热处 理 可 以提 高 培 养 中去 除病 毒 的能 力 ，但 不 同病 毒 对 高温 预 处 理 的
病 毒是 来 自其 它寄 主植 物 的病毒 。
由于 不 同病 毒在 茎尖分 布 不 同 ， 脱毒 的效 果也 与
马铃薯种薯的茎尖脱毒培养技术.
作物生产技术专业 / 教学资源库
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5．茎尖培养与病毒检测
5．2 培养 5.2.1外植体培养
从已催出芽（芽长一般2—4cm）的干净健康马铃薯块茎上掰下芽， 用自来水冲洗干净，放入0.1—0.15%的升汞溶液中浸泡8—10分钟，在超 净工作台上消毒完后，放入无菌水中浸泡6次，每次5分钟，然后接种到 MS＋6－BA1.5mg/L（毫克/升）＋GA3 0.5mg/L＋IBA0.5mg/L＋琼脂8g/L ＋蔗糖30g/L（PH值为5.8）的培养基上，每个培养瓶接种1—5个外植体。
任务二马铃薯种薯的茎尖 脱毒培养技术
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1．材料的选择
选择具有 该品种典型特 性、生长健壮 的单株（或无 性系），结合 产量情况，选 择高产、大薯 率高、无病斑 的单株作为茎 尖脱毒的基础 材料，以提高 脱毒效果。
马铃薯种薯
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4．剥离茎尖和接种
在超净工作台上，将消毒过的芽置于40X的解剖镜下，一手用一把眼 科镊子将芽按住，一手用灭过菌的解剖针将叶片一层一层仔细剥掉，直 至露出圆亮的生长点，用锋利的无菌解剖针小心切取0.3毫米以下的带12个叶原基的茎尖，随即将茎尖接种于已准备好的马铃薯茎尖培养基上， 以切面接触琼脂。
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5．茎尖培养与病毒检测
5．3病毒检测
病毒检测的目的，是鉴定所获得的试管苗是否完全脱除所有病毒。
病毒检测方法一般采用指示植物鉴定法、电镜检测法或抗血清鉴定法。
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马铃薯茎尖脱毒技术 (1)精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版马铃薯茎尖脱毒技术作者：刘学武方大雨关永明来源：《吉林蔬菜》2014年第03期马铃薯（Solanurn tuberosurn），茄科、茄属作物，作为一种蔬菜，深受人们的喜爱。
目前在我国的栽培面积大约有500多万公顷，已经成为世界上栽培面积最大的国家，但在其繁殖过程中退化问题比较严重，症状是叶片卷缩，产量降低，实验研究表明，病毒浸染是其退化的根源。
因此生产脱毒种薯成了在马铃薯生产过程中的关键环节，常用的马铃薯脱毒技术是茎尖组织培养，下面介绍一下马铃薯的茎尖脱毒技术。
1 取材进行脱毒培养的材料，可以直接从大田取。
一般当苗高约15厘米时，将顶端切下6～8厘米，去掉下面2片叶，在切口处涂上生根激素后，把切条植入一个口径为10厘米、内装有消毒营养土的花盆中，然后用玻璃烧杯罩上，保持10天。
然后将其转入生长箱中，光照3 000～4 000Lx，每天光照16小时。
两周后去掉顶芽，以促使腋芽的生长。
当腋芽长出约1～2厘米时，折下腋生枝，用于消毒，接种。
2 消毒及接种一般来说，茎尖分生组织由于彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，不进行表面消毒也能得到无菌的外植体，但分生组织不带菌，并不等于包在它外面的叶片及其下部的茎段不带菌，将外植体从超净台外面的空间拿进去可能会带进一些菌。
因此，在切取外植体之前仍需对茎芽进行表面消毒。
常用的消毒方法是，先剥去大叶片，用自来水冲洗干净，在75%酒精中浸泡30秒钟左右，用1%～3%次氯酸钠或5%～7%的漂白粉溶液消毒10～20分钟（或用0.1%HgCl2消毒数分钟），最后用无菌水冲洗材料4～5次。
接种时，先把解剖显微镜置于超净工作台，然后把茎芽置于解剖镜下，左手用一把镊子将它按住，右手用解剖针将叶片和叶原基剥掉。
当形似一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来后，用锋利的长颈刀片将分生组织切下来，一般以0.2～0.3毫米，带1～2个叶原基为好，然后再用刀片将其接种到培养基上。
马铃薯茎尖脱毒及病毒鉴定技术研究
收稿日期:2023-02-15基金项目:宁波市 科技创新2025 重大专项(2019B10017,2021Z106);浙江省农业新品种选育重大科技专项子课题(2021C02064-1-5);慈溪市科技局重大公益项目 马铃薯-晚稻双优主粮轮作高效栽培模式研究与示范作者简介:王芳(1981 ),女,高级农艺师,从事薯类育种与推广研究,E-mail:wangfang811028@㊂通信作者:严成其(1966 ),男,研究员,主要从事粮食作物抗病育种研究,E-mail:yanchengqi@㊂文献著录格式:王芳,鲁宇文,周金波,等.马铃薯茎尖脱毒及病毒鉴定技术研究[J].浙江农业科学,2023,64(7):1736-1739.DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.2020355马铃薯茎尖脱毒及病毒鉴定技术研究王芳1,鲁宇文2,周金波1,郑晓红3,金树权1,毕继安1,严成其1∗(1.宁波市农业科学研究院,浙江宁波㊀315051;2.农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室,浙江宁波㊀315100;3.余姚市第二职业技术学校,浙江余姚㊀315430)㊀㊀摘㊀要:为探讨利用马铃薯茎尖分生组织获得脱毒苗以及脱毒苗鉴定的方法,本实验以马铃薯茎尖分生组织为培养对象,通过外源激素分化愈伤组织形成组培苗,并用分子生物学的手段对病毒进行鉴定㊂实验中将本地小黄皮马铃薯品种的芽通过显微镜切下0.2~0.3mm 的茎尖,在基本培养基(MS)+0.5mg㊃L -16-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.1或0.5mg㊃L -1萘乙酸(NAA)培养基中进行试管苗分化培养,当分化出的试管苗培养到苗长5~10cm 时,转接到MA +6-BA 0.15mg㊃L -1+NAA 0.2mg㊃L -1培养基中进行壮苗培养,然后采用qRT-PCR 的方法对小黄皮马铃薯试管苗进行病毒检测,实验表明,在试管苗中未检测出马铃薯X 病毒(potato virus X,PVX)㊁马铃薯Y 病毒(potato virus Y,PVY)㊁马铃薯H 病毒(potato virus H,PVH)和马铃薯M 病毒(potato virus M,PVM)等,大田种植的脱毒试管苗形成试管薯后,其产量和品质明显优于对照组㊂该研究为马铃薯茎尖脱毒苗生产提供合适的培养基配方以及简易的脱毒鉴定技术,为宁波马铃薯产业的发展提供技术保障㊂关键词:马铃薯;试管苗;脱毒鉴定中图分类号:S532㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:0528-9017(2023)07-1736-04㊀㊀马铃薯是仅次于小麦和玉米的全球第四大主要粮食作物㊂中国作为最大的马铃薯生产国,全年种植面积533万hm 2,其产业化发展备受关注[1]㊂宁波地处亚热带,冬季温光资源较为丰富,马铃薯是有效利用冬闲田㊁开发冬季农业的主要品种,对发展冬季农业,实现绿色过冬,有着重要的促进作用㊂但是马铃薯作为一种无性繁殖作物,常年种植容易受到病毒的侵染㊂从而导致品种退化㊁产量下降㊁品质变差,严重影响马铃薯产业的可持续发展㊂目前已报道的侵染马铃薯的病毒及类病毒有40多种,发生率高㊁危害较大的主要有PVX㊁PVY㊁PVS㊁PVM㊁PVA㊁PVH 等[2-3]㊂因此,采用脱毒种薯是降低病毒病发生的关键技术,而利用茎尖脱毒技术建立脱毒试管苗体系是生产脱毒种薯的前提条件,为保障种薯质量,高效㊁快速㊁经济地进行脱毒苗的病毒检测必不可少㊂本研究通过对宁波本地马铃薯茎尖脱毒,繁育脱毒苗,用qRT-PCR 技术对试管苗进行病毒检测,最终建立一套脱毒及病毒检测体系,为脱毒种薯快繁以及良种良法的推进打下基础㊂1㊀材料与方法1.1㊀试验材料1.1.1㊀毒源材料㊀㊀供试品种本地小黄皮马铃薯由宁波市农业科学研究院提供㊂用血清学DAS-ELISA 方法检测,发现薯块含有PVX㊁PVY㊁PVH㊁PVM 等病毒㊂1.1.2㊀试验试剂㊀㊀培养试管苗的供试培养基为基本培养基(MS),固体培养基加琼脂,液体培养基不加琼脂,120ħ灭菌20min㊂Trizol 购自Invitrogen 公司;反转录酶购自TaKaRa 公司㊂1.2㊀试验方法1.2.1㊀试管苗的诱导㊀㊀茎尖细胞分裂的速度极快,新分裂出来的细胞不带病毒,病毒通过胞间连丝传播的速度远远慢于植物细胞分裂的速度,故分生组织往往不带病毒[3]㊂我们对本地小黄皮马铃薯进行催芽处理,当芽生长到2~3cm时,用自来水冲洗3min,然后转移至超净工作台用75%乙醇消毒处理30s,再将消毒过的芽使用0.2%HgCl2处理7~10min,接着用无菌水冲洗4~5遍㊂在解剖显微镜下切取0.2~0.3mm的小黄皮马铃薯茎尖,然后转接到不同激素浓度的MS诱导培养基上,即MS+6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.1㊁0.5㊁1.0㊁1.5㊁2.0mg㊃L-1+萘乙酸(NAA)0.1㊁0.2㊁0.3㊁0.4㊁0.5mg㊃L-1㊂设置培养室温度25ħ,光照时间12h,光照强度2000lx㊂1.2.2㊀试管苗的壮苗培育㊀㊀当诱导出的马铃薯试管苗生长到5~10cm时,接种在5种不同激素浓度的MS中,进行马铃薯试管苗的壮苗培养,即MS+6-BA(0.10,0.15, 0.20mg㊃L-1)+NAA(0.05㊁0.10㊁0.15㊁0.20㊁0.25mg㊃L-1),同时以不加激素的MS作对照㊂待培养2周之后观察记录马铃薯试管苗芽㊁根㊁叶以及苗高㊂1.2.3㊀RNA提取㊀㊀称取0.05~0.10g马铃薯试管苗的叶片,加入1mL TRIzol,按照使用说明书提取RNA㊂将沉淀溶解在25~100μL经DEPC处理的水中,55~ 60ħ放置10min使RNA充分溶解,保存备用㊂1.2.4㊀多重qRT-PCR㊀㊀反转录体系:取有PVX㊁PVY㊁PVH和PVM 病毒的RNA2.5μL,65ħ变性10min,冰上放置2min;接着加入1μL RT buffer和dNTPs,0.5μL 病毒随机引物(100ng㊃μL-1),5U RNase Inhibitor,100U随机反转录酶,用ddH2O补足至10μL,混匀离心㊂反应程序:37ħ反应1h, 85ħ灭活1min,-20ħ保存待用㊂PCR反应体系:取2μL cDNA,加入2.5μL PCR buffer㊁0.5μL dNTPs㊁1.5μL MgCl2,上㊁下游引物(10ng㊃μL-1)各0.5μL,0.05U㊃μL-1Taq DNA聚合酶浓度㊂PCR反应程序:92ħ预变性3min;92ħ变性30s,56ħ退火30s,72ħ延伸45s,循环32次;72ħ延伸10min㊂取5μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析㊂1.2.5㊀用qRT-PCR检测茎尖组织培养获得的马铃薯试管苗的带毒情况㊀㊀目前世界范围内报道的侵染马铃薯的病毒大约有40种[4-6],本实验鉴定危害马铃薯生产的4种主要病毒(P VX㊁P VY㊁P VH㊁P VM)㊂多重qRT-P CR检测技术是将全部需要检测的病毒特异性引物同时加入到一个体系中再进行反应,依此建立的检测技术可以同时检测多种病毒[7],节约时间,提高效率㊂自然环境中生长的马铃薯时常能同时感染多种病毒,所以多重qRT-P CR检测技术在马铃薯病毒检测中较为重要[8]㊂1.2.6㊀马铃薯大田病毒鉴定及产量比较㊀㊀试验地点位于横溪大岙村㊂前茬为甘薯,土壤为砂壤土㊂试验采取随机区组排列,试验地面积54m2,分6个小区,2个小区为一个区组㊂3次重复,1个区组包括2个处理,处理1是组培繁育的原种,处理2是农家自留种,每小区1畦,畦宽连沟1.0m,长9.0m,每畦两行种植,每行30株,每小区60株,每667m2种植4200株㊂四周设保护行㊂肥料一次性作基肥施入,每667m2施用商品有机肥150kg,复合肥80kg㊂2月15日播种,5月7日收获㊂试验过程中对田间每小区的病株及产量进行调查统计㊂2㊀结果与分析2.1㊀马铃薯茎尖诱导培养基筛选㊀㊀以MS培养基为基础,分别加入不同浓度的NAA和6-BA,配制25组培养基,在每组培养基中接种20个茎尖,培养40d后进行调查(表1)㊂由表1可知,6-BA的浓度影响茎尖成苗,随着6-BA浓度的增加,茎尖成苗率逐渐下降㊂当NAA浓度为0.1或0.5mg㊃L-1,6-BA浓度为0.5mg㊃L-1时茎尖成苗率最高,可达75%㊂2.2㊀马铃薯脱毒苗壮苗培养基筛选㊀㊀当诱导成苗的植株长到5~10cm时,转接到加有不同激素浓度的MS壮苗培养基中,每组培养基接种50株苗㊂培养30d后进行调查(表2)㊂MS无激素培养基苗长得较高,茎节较长,但比较细弱㊂MS+6-BA0.15mg㊃L-1+NAA0.2mg㊃L-1培养基中苗长得最好,比较粗壮,根数和叶片数最多(图1)㊂2.3㊀马铃薯试管苗的病毒鉴定㊀㊀分别提取感病马铃薯和脱毒组培苗叶片的总RNA,反转录为cDNA后,用PVX㊁PXY㊁PVH㊁PVM外壳蛋白的特异性引物进行PCR检测㊂结果显示,脱毒组培苗中未能检测到这些病毒的CP基因(图2),说明组培脱毒能有效地清除马铃薯中的PVX㊁PVY㊁PVH和PVM㊂表1㊀茎尖分生组织在不同培养基中成苗情况培养基NAA/(mg㊃L-1)6-BA/(mg㊃L-1)成苗率/%10.10.125 20.10.575 30.1 1.020 40.1 1.55 50.1 2.00 60.20.130 70.20.560 80.2 1.015 90.2 1.55 100.2 2.00 110.30.120 120.30.550 130.3 1.015 140.3 1.55 150.3 2.00 160.40.125 170.40.565 180.4 1.010 190.4 1.50 200.4 2.00 210.50.130 220.50.575 230.5 1.010 240.5 1.55 250.5 2.00 2.4㊀脱毒后的马铃薯大田病毒鉴定及产量比较㊀㊀将小黄皮脱毒后的原种与农家自留种进行大田比较,处理1脱毒后的原种田间鉴定病株数量为0,处理2农家自留种大田鉴定病株率43%(表3)㊂㊀㊀表2㊀马铃薯脱毒苗在不同壮苗培养基中的表现培养基NAA/(mg㊃L-1)6-BA/(mg㊃L-1)每株平均叶片数平均株高/cm根数愈伤组织10.050.10 5.39.1 3.1无20.100.10 6.19.4 3.2无30.150.159.17.8 4.7无40.200.159.48.1 5.3无50.250.20 6.0 6.4 3.7有小块愈伤6007.110.3 2.3无图1㊀马铃薯试管苗培养图2㊀马铃薯试管苗的PVX㊁PVY㊁PVH和PVM病毒鉴定处理1产量和抗性明显优于未脱毒的农家自留种,原种产量比对照提高34.9%,薯块光滑,商品性好(图3)㊂表3㊀病毒病田间抗性和产量处理小区病株数量重复1重复2重复3平均病株率/%小区产量/kg重复1重复2重复3平均667m2产量/kg10000018.721.620.320.21500.1 2272031264314.415.415.215.01111.73㊀结论与讨论㊀㊀病毒病是马铃薯种植生产中的重要病害,由于马铃薯经常被多种病毒复合侵染,单一抗性在生产中很难起到保护作用㊂马铃薯茎尖脱毒技术利用茎尖干细胞抑制病毒增殖的特点,取茎尖的无毒细胞进行组织培养㊂当切取马铃薯试管苗茎尖大于0.3mm时,其带病毒含量随着切取茎尖增长而增加[9]㊂在温室组织培养的条件下,马铃薯试管苗的生长往往受到多种环境因素的调控,光照㊁温度以及培养基类型等都能影响试管苗的生长㊂光照不仅仅作为光合作用的能量来源,而且还作为一种重要的信号分子能够调节基因的表达,影响酶的活性以及光形态建成等[4],光照可以促使植物更好地适应外界生长环境,更是马铃薯试管薯生长的主要影响因素,光照强度对不同品种的试管薯形成和膨大的影响有所不同㊂常规试管薯诱导多是在全黑暗条件下进行,而在本实验中不同品种的试管薯形成对光质(光密度等)的要求有一定差异[5]㊂同时,多种外源激素会影响马铃薯试管苗生长发育,根据马铃薯品种的不同,其对激素的敏感程度也有所不同㊂研究表明,NAA或6-BA单独使用时试管苗生长比较差,NAA利于试管苗的生根, 6-BA对试管苗茎叶的生长有显著促进作用,同时使用这2种激素的试管苗生长状况较好,这与前人研究[3,10]的结果相一致㊂图3㊀脱毒马铃薯与农家自留种马铃薯的田间表现综上所述,针对宁波小黄皮马铃薯病毒长期积累导致的品种退化现象,对该品种进行茎尖组培脱毒,大田种植脱毒后的试管苗后,叶子平坦,有利于光合作用,生长旺盛[11-13],其产量和品质明显优于未脱毒的马铃薯对照组,为宁波马铃薯产业的可持续发展提供了有效保障㊂参考文献:[1]㊀刘丽宅,谢晶,汪洋,等.马铃薯主食产品研究现状及发展㊀㊀前景[J].粮食加工,2016,41(6):64-67.[2]㊀宋进库,万秀云.环境条件对马铃薯生长的影响[J].热带农业工程,2020,44(2):13-15.[3]㊀代欣玉,孙璐.植物组织培养技术在马铃薯上的应用[J].中国果菜,2020,40(12):67-70.[4]㊀李彦军,滕巍,耿伟,等.脱毒马铃薯试管苗生长的影响因素及壮苗措施[J].中国果菜,2020,40(9):113-116.[5]㊀杜荣骞,李德森,罗智敏,等.马铃薯病毒RNA的提取方法:CN1473839A[P].2004-02-11.[6]㊀宋静静,蒙姣荣,邹承武,等.用小RNA深度测序鉴定广西冬种马铃薯病毒[J].中国农业科学,2013,46(19):4075-4081.[7]㊀吴兴泉,时妍,杨庆东,等.马铃薯病毒的RT-PCR检测技术评述[J].中国马铃薯,2011,25(4):251-254. 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y第十二章1马铃薯的组织培养幻灯片PPT
1.马铃薯脱毒技术市场前景:
★ 我国单产为13.60吨/公顷，是世界单产的1/4。最主要因
素是种薯差，品种布局不合理。
★ 全国现有播种面积300多万公顷，且有逐步增加趋势，年
需合格种薯45亿公斤，脱毒原种4亿公斤，脱毒小薯或微型 薯45亿粒。因此，脱毒马铃薯推广具有广阔的市场前景。
★ 采用脱毒快繁技术，种用脱毒种薯，一般可增产30-50%，
★ 培养基：MS ＋ NAA 0.1＋ GA3 0.2 ＋ BA 0.5 ＋ 2%蔗糖 〔液体，pH5.8〕
★ 培养条件：21～25℃、2000～3000lx、
12h/d。
★ 生长情况: 2～3周愈伤，4-5周绿点，3～6月
长成2～3厘米小芽，越慢越好，出芽很快的扔掉。
〔2〕继代和生根
★ 培养成功的马铃薯脱毒苗，经ELISA 〔试剂盒〕鉴定后〔检测:1次/3月，4次 /年〕鉴定后，采用固体、液体培养基相 结合方法扩繁。 ★★ 培取养试基：管M苗S +单N节AA切0.2段～0扦.5 +插D在-泛〔酸钙或10平+放3%〕蔗糖 固★ 培体养培条件养：基20上-25培度，养30，00长-40成005LX～，1140-1c6m小时高光，照， 继每试3管续周苗继切用代2段一年次—繁，3殖年单。芽，茎每段约月1厘可米繁，可殖插5也～可8平倍放，；原试那么 管苗也可采用浅层静止液体培养。
用纱布滤出汁液
蒸馏水稀释１０倍（混入
金刚砂接种物） 蘸取接种液均匀在寄主叶背面
擦过（不成伤痕） 清水冲洗多余接种物
放置在防虫室内
５～１０天可发病。
五、无病毒株的繁殖
通过茎尖培养只能得到很少的无病毒 植株，而生产上需要数以万计的安康种 薯。同时无病毒植株并没有对该病毒获 得〔免１疫〕 能直接力块，茎仍繁殖会在繁殖中再次侵染。 如〔何２防〕 止扦插病繁毒殖再侵染，有主要几种方法：