北极海洋沉积物中放线菌多样性及抑菌活性筛选

北极海洋沉积物中放线菌多样性及抑菌活性筛选

作者：常显波，柳瑞翠，刘文正，等

来源：《湖北农业科学》 2014年第13期

常显波１，柳瑞翠１，刘文正２，张晓华２

（１．烟台大学环境与材料工程学院，山东烟台２６４００５；２．中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛２６６００３）

摘要：采用平板涂布法利用６种培养基从北极海洋沉积物中共分离出１０９株放线菌。选

取３４株代表菌株进行１６ＳｒDＮＡ测序分析。结果表明，它们分属于链霉菌属（Ｓｔｒｅ

ｐｔｏｍｙｃｅｓ）、假诺卡氏菌属（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）和拟诺卡氏菌属（Ｎ

ｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ），其中Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ为优势菌属；不同采样点获得放

线菌的种类和数量有较大不同，站位点Ｐ３７分离到的放线菌数量和种类最多；在１０９株放

线菌中，有３９株对病原菌有抑菌活性，其中有２１株、１１株和１７株放线菌分别对枯草芽

孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长有抑制作用。

关键词：北极；海洋沉积物；放线菌；多样性；抑菌活性

中图分类号：Ｑ９３９．９９

文献标识码：Ａ

文章编号：0439－８114（２０14）13－3014-05

自从Ｅｋｅｌｏｆ１９０８年首次报道从南极分离出微生物后，各国的微生物学家相继在极地进行过大量的研究工作，证明了微生物是极地生态系统的重要组成部分，特别是在极地的

海水、海冰、海底沉积物中存在着各种类型的微生物［１］。由于极地所处的地理位置比较特殊，从而形成了一个寒冷、干燥、强辐射的环境条件，生存于其中的微生物必须具备相应独特

的分子生物学机制和生理生化特征去适应这样的极端环境，特别是对于能够产生多种次级代谢

产物的放线菌来说，极地应该是产生新型生物活性物质的放线菌菌株的重要生存繁衍之地［２，３］。对极地海洋沉积物中的放线菌进行分离培养、鉴定、抗菌活性等方面的研究，有利于进

一步了解、开发和利用该地区放线菌资源。

为此，对来自北极的１０份海洋沉积物样品进行放线菌的分离培养，通过１６ＳｒＤＮＡ序列测定，对分离出的菌株进行分子鉴定和系统发育分析，再对放线菌株进行抗菌活性筛选，

希望能为今后极地海洋放线菌资源的研究和开发利用提供有价值的参考。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１主要试剂和仪器ＰＣＲ引物、ＰＣＲ常规操作用试剂和酶均购自ＴａＫ

ａＲａ公司。高压灭菌锅为上海产ＬＳ－Ｂ５０Ｌ、高速冷冻离心机为Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司５８１７Ｒ型、ＰＣＲ仪为ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＡＧ２２３３１Ｈａｍｂｕｒｇ；凝胶成像系统ＧＫ－３３０Ｃ购自美国伯乐公司。

１．１．２样品１０份极地海洋沉积物样品来自中国第三次北极科学考察，由中国极地

研究中心提供，采样点概况见表１。

１．１．３培养基①分离培养基：培养基Ｍ１（可溶性淀粉１０ｇ，干酪素０．３ｇ，ＫＮＯ３２ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４２ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．０５ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．０１ｇ，琼脂２０ｇ，陈海水１Ｌ，ｐＨ７．２~７．４）、培养基Ｍ２（酵母浸出粉４ｇ，麦芽浸出粉１０ｇ，葡萄糖４ｇ，琼脂２０ｇ，陈海水１Ｌ，ｐＨ７．２~７．４）、培养基Ｍ３（葡萄糖１０ｇ，天门冬氨酸０．５ｇ，Ｋ２ＨＰＯ

４０．５ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．０５ｇ，琼脂２０ｇ，陈海水１Ｌ，ｐＨ７．２~７．４）、培养基Ｍ４（棉子糖１０ｇ，Ｌ－组氨酸１ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．０１ｇ，琼脂２０ｇ，陈海水１Ｌ，ｐＨ７．２~７．４）、培养基Ｍ５（天门冬氨酸０．１ｇ，蛋白胨２ｇ，丙酸钠４ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．０１ｇ，琼脂２０ｇ，陈海水１Ｌ，ｐＨ７．２~７．４）和培养基Ｍ６（甘油６ｍＬ，精氨酸１ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，琼脂２０ｇ，陈海水１Ｌ，ｐＨ７．２~７．４）。所有分离培养基中均添加终浓度为２５μｇ／ｍＬ的萘啶酸以抑制快速生长的细菌，尤其是革兰氏阴性细菌；同时添加终浓度为１０

０μｇ／ｍL的制霉菌素溶液以抑制真菌的生长。②抑菌活性试验培养基：培养基Ｍ２和ＬＢ

培养基（酵母膏５ｇ，蛋白胨１０ｇ，氯化钠１０ｇ，琼脂２０ｇ，去离子水１０００

ｍL，ｐＨ７．０）。

１．１．４病原菌菌株以金黄色葡萄珠菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）和迟缓爱德华氏菌（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａｔａｒｄａ）为指示菌，菌株由中国海洋大学海洋生命学院海洋微生物实验室提供。

１．２试验方法

１．２．１菌株分离方法采用传统的平板涂布法对样品进行分离，在２８℃培养７～１５ｄ。根据菌落大小、形态、颜色进行初步分离筛选并纯化，将纯化后的菌株接种到Ｍ２斜面上，培养３～４ｄ后，以５ｍＬ灭菌保种液（０．８５％ＮａＣｌ溶液＋１５％甘油）洗

下菌苔，制成菌悬液，每个菌种保存３管，－８０℃保存。

１．２．２菌株的抑菌活性检测方法采用牛津杯法检测。

１）用竹签将供试放线菌株接种到Ｍ２液体培养基试管中，于２８℃摇床以１５０ｒ／

ｍｉｎ培养２～３ｄ；菌液于１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，取上清液进行试验。

２）将金黄色葡萄珠菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和迟缓爱德华氏菌接种于ＬＢ培养基，

迟缓爱德华氏菌置于２８℃、１５０ｒ／ｍｉｎ的摇床中振荡培养，大肠杆菌、金黄色葡萄

球菌、枯草芽孢杆菌则置于３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ的摇床中振荡培养８～１０ｈ后即可。

３）取各种病原菌１００μＬ分别涂布于各自的培养基平板上，再在平板上等距离放置６～８个无菌的牛津杯，吸取１２０μＬ发酵上清液加入牛津杯中。移至３７℃培养箱培养

１８～２４ｈ后，观察牛津杯周围是否形成抑菌圈。

１．３系统发育特征分析

１６ＳｒDＮＡＰＣＲ扩增和系统进化分析：参照文献［４］的方法提取放线菌基因组ＤＮＡ，应用细菌１６ＳｒDＮＡ通用引物（正向引物：８－２７Ｆ，反向引物：１４２９－１４４５Ｒ）进行ＰＣＲ扩增。测序所得结果用Ｂｌａｓｔ软件在ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ等数据库中进行相似性搜索，选取同源性比较高的典型菌株的１６ＳｒDＮＡ序列

作为参比对象，用Ｃｌｕｓｔａｌ－Ｘ［５］软件进行多重序列比对，利用ＭＥＧＡ－４［６］软件，采用邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ＪｏｉｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）进行聚类分析和系统进化树构建。

２结果与分析

２．１放线菌菌株的分离

从１０份极地样品中共分离出１０９株放线菌，菌株编号为ＣＸＢ５０３、ＣＸＢ５１３、ＣＸＢ５１６、ＣＸＢ５２１～ＣＸＢ５２３、ＣＸＢ５２５～ＣＸＢ５３１、ＣＸＢ５３３、ＣＸＢ５３５～ＣＸＢ５５２、ＣＸＢ５５４～ＣＸＢ５７５、ＣＸＢ５７９～ＣＸＢ５８９、ＣＸＢ５９２～ＣＸＢ６０１、ＣＸＢ６０３～ＣＸＢ６３５、ＣＸＢ６３６、ＣＸＢ６３９、ＣＸＢ６４０。从图１可知，各个站位点放线菌分离情况有较大差别。从采样点Ｐ３７分离到

的放线菌菌株无论是在数量还是种类上都是最多的，共分离到３个属的４３株放线菌，放线菌

分离率为３９．４％，其次是站位点Ｂ１２、Ｓ１４、Ｂ－８５－Ｂ和Ｓ２４，而从Ｐ２３样

品中分离到放线菌的数量和种类最少，只分离到１个属的２株放线菌，放线菌分离率只有１．８％。

２．２放线菌的１６ＳｒＤＮＡ序列分析

根据放线菌的特殊形态特征和颜色差异，选取３４株代表菌株提取ＤＮＡ及进行１６ＳｒＤＮＡ的扩增，并进行测序分析，将测序结果提交到ＧｅｎＢａｎｋ数据库，获得序列号（Ｊ

Ｆ５１２５４０～ＪＦ５１２５６１）。由图２可知，从北极沉积物样品中共分离出３个属的

放线菌：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（３１株）、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ（１株）和