琼脂免疫扩散试验

（三）结果判定
当标准阳性血清孔与抗原之间出现一条明显致密 的沉淀线时，再进行被检血清孔的判定。 若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗 体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉 淀线，为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线 则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出 现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能 确定待检样品为真正阳性。
4．挑孔 挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔 缘。

5．封底 把溶化琼脂7uL左右加入孔中，以 免加样后液体从孔底渗漏。
6．加样 以加样器（枪）吸取样品加入 孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。 加少了，影响反应程度，加多了，易溢 出，也影响反应结果。
7．放置 加样完毕后，37℃自由扩散24h～ 48h。
二、琼脂扩散原理
1％~2%琼脂凝胶所形成的构架网孔较大， 空隙中是98％~99%的水，允许分子量在20 万以下甚至更大些的大分子物质通过，绝 大多数可溶性抗原和抗体的分子量在20万 以下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩散， 所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇， 在最适比例处发生特异性免疫结合反应， 结合物分子量一般大于20万，此结合物因 颗粒较大而不扩散，故形成沉淀带。
（二）操作方法（步骤）
1．凝胶的配制 称取一定量的琼脂粉，按 1%左右（0.8％～1.5%）的比例加入8%盐 水，水浴煮沸融化20min。 2．制板 将融化的琼脂倒入平板上，使厚 度2mm～3mm。自然冷却。
3．打孔 根据要求（孔径即孔的直径，孔 距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半 径）按模板打孔。也可直接用组合打孔器 打孔。打成梅花形孔（共7孔）。用直径3 毫米打孔器，孔间距为5毫米。
三、琼脂扩散的种类
琼脂扩散反应根据其扩散方向可分单相 （向）扩散和双相扩散，根据抗原抗体二 者是一方扩散还是双方扩散，又有单扩散 和双扩散之别。因此，琼脂扩散反应就有 单相单扩散、单相双扩散，双相扩散、双 相双扩散4种类型。
四、以诊源自文库禽流感为例讲解双相双扩散
（一）材料与试剂 1．标准禽流感诊断血清，购买自生物制品 所。 2．标准禽流感诊断抗原，购买自生物制品 所。 3．待检血清 4．琼脂板 5．打孔器
琼脂免疫扩散试验
一、相关知识介绍
可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸 出液、血清以及其他来源的蛋白质、多糖 质、类脂体等）与其相应的抗体相遇后， 在电解质参与下，抗原抗体结合形成白色 絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称 为沉淀反应。沉淀反应中的抗原叫沉淀原 （precipitinogen）,与沉淀原发生反应的抗 体称为沉淀素（precipitin）。