易学版m6A：肾癌预后和机制分析

易学版m6A：肾癌预后和机制分析

Effect of m6A RNA Methylation Regulators on Malignant Progression and Prognosis in Renal Clear Cell Carcinoma m6A RNA甲基化调控因子对透明细胞肾癌恶性进展及预后的影响

一.研究背景

m6A RNA甲基化调控因子在ccRCC的发生和发展中起着重要的作用。本研究旨在探讨13种m6A RNA甲基化调节因子在中的作用，并确定m6A RNA甲基化调节因子在ccRCC中的risk signature和预后价值。

二.分析流程

三.结果解读

1.m6A RNA甲基化调控因子的表达与ccRCC的临床病理特征相关

作者基于TCGA-KIRC样本RNA-Seq数据和临床病理特征，筛选了13个m6A调节因子。

•图2A-C：所示为13个m6A 调控因子在不同组织样本中的热图(A图：肿瘤状态，B图：WHO分级，C图：病理阶段)。

•图2D - F：所示为13个m6A 调节因子在不同组织样本中的表达(D图：肿瘤状态，E图：WHO分级，F图：病理阶段)。

▪图2D显示肿瘤状态中大多数m6A甲基化调节因子的表达较为显著。且与正常组织样本相比，ccRCC组织样本中ZC3H13、METTL14、YTHDF2表达下调，FTO、ALKBH5、WTAP、METTL3、YTHDC2、KIAA1429、RBM15表达上调。

▪图2E,F显示分级越高及晚期病理期的样本中FTO、METTLE14、YTHDC1、ZC3H13、KIAA1429显著低表达。

•用GSE15641和GSE15641数据集验证这些差异表达的调控因子。验证结果表明，FTO、WTAP、RBM15、ZC3H13在ccRCC组织中明显表达异常(图2G、H)，与之前的结果近似一致。

图2.不同临床病理特征的ccRCC中m6A RNA甲基化调控因子的表达

RCC中13m6a RNA甲基化调控因子的相互作用及相关性研究

从STRING数据库中检索到13个m6A RNA甲基化基因之间的相互关系，构建PPI网络(图3A)，并使用R中的“corrplot”包对它们之间的相关性进行分析(图3B)。结果显示：

•除METTL3和ZC3H13、METTL3和KIAA1429、ZC3H13和WTAP在ccRCC中的表达显著相关外，其余6个reader的表达均显著相关(图3B)。

•在PPI网络中，5个阅读器之间的相互作用很少(图3A)。此外，FTO、KIAA1429、ZC3H13、METTL14、YTHDC1的表达呈高度相关(图3B)。

图3.m6A RNA甲基化调节因子之间的相互作用

3.m6A RNA甲基化调控因子的预后价值和基于两个m6A RNA 甲基化调控一致建立的Risk Signature

接下来为了研究ccRCC中这13个m6A RNA甲基化调节因子的预后价值，作者根据TCGA-KIRC中调节因子的表达水平进行了单变量Cox回归分析(图4A)。

•显示13个调节因子中有7个预后显著(p < 0.05)。

为了确定最优的预后m6A调节因子，作者对7个预后相关基因进行了LASSO Cox回归分析(图4B)，每个独立预后基因的系数如图4C所示。

•LASSO结果显示两个调节因子(METTL14和METTL3)是强有力的预后因素。

然后作KM生存分析，对这两个调节因子的预后进行了验证。结果显示：

•METTL14高表达的ccRCC患者预后良好(图4D)，而METTL3

高表达的ccRCC患者预后较差(图4E)，与LASOO结果一致。

作者基于这两个强有力的预后因素(METTL14和METTL3)，构建risk signature。然后，根据LASSO分析得到的系数构建risk score。risk score(RS)的计算公式如下:

其中n为RNA模块的数量，Coef (i)为系数，X(i)表示经LASSO 分析鉴定的每个基因的z-score-transformed相对表达量。每个基因的z-score-transformed相对表达量分别乘以各自的Coef系数后加和，即为RS。

将TCGA-KIRC患者(n = 525)按中位risk score分为高、低风险组(表1)，来测试METTL14和METTL3基因risk signature的预后作用。生存分析的结果表明,低风险组的患者的OS较好(图4F)。

采用ROC曲线来评价预测的敏感性和特异性，结果显示AUC值为0.704(图4G)，预测效果良好。

图4.2个m6A RNA甲基化调节因子的risk signature

表1.本研究包括的患者的临床病理特征

4.risk score预后与ccRCC的临床特征密切相关

图5A：热图显示两种m6A RNA甲基化调控因子在高风险组和低风险组中的表达水平。结果显示，高风险组与低风险组中WHO分级(p < 0.001)、病理分期(p < 0.001)、T分期(p < 0.001)、M分期(p < 0.01)统计学上显著性差异。

还探讨了risk score与临床病理特征之间的关系：

•图5B，C：显示按WHO分级和病理分期划分的患者的risk score存在显著差异。

•图5D，E：ROC曲线显示，在预测5年生存率方面，risk score （AUC = 0.708）预后优于WHO分级 (AUC = 0.655)；而与病理分期相近(AUC = 0.709)。

然后进行了单变量和多变量Cox回归分析：

•在单变量分析中，年龄、WHO分级、病理分期、TNM分期、

risk score等均与预后相关(图5G)，

•而在多变量Cox回归分析中，显示只有risk score、诊断年龄与OS是独立的预后因素(p < 0.05)(图5H)。

作KM生存分析，分析不同分级及病理分期的risk signature对预后的影响。结果显示，低risk score组的具有更好的OS（图5I-J)。这些结果表明，risk score可以作为ccRCC的独立预后因素。

图5.risk score与临床病理特征的关系，以及按WHO分级和病理分期的患者risk signature的预后价值

5.两组独立预后m6A调节因子的一致聚类鉴定了两组具有不同临床结果的ccRCC

基于2个m6A 的METTL14和METTL3两个强有力的独立预后因子，作k = 2 - 9逐渐增加的聚类分析，发现k = 4为最优选择(图6A,B)。但当k = 2时，各子组之间的干扰最小。

所以作者使用k = 2进行一致性聚类分析，并确定了两个cluster：cluster1和cluster2。KM生存分析发现cluster1组患者的OS明显短于cluster2组(图6C)。

此外，使用主成分分析(PCA)来比较cluster1和cluster2的转录谱。结果表明，两个cluster之间存在显著差异(图6D)。

接着利用KEGG (图6E)和GO(图6F)对cluster1中不同表达的基因进行通路分析和功能注释。

•KEEG分析的结果表明,差异表达基因主要富集在恶性肿瘤相关的途径(图6e)。

•GO分析结果与癌症相关的生物学过程相关，包括“白细胞迁移”、“白细胞激活调节”、“免疫效应调节”等(图6F)。

•GSEA显示cluster1中高表达基因的恶性肿瘤特征显著富集(图7)。

•以上结果表明，根据METTL14和METTL3识别出的两个cluster 与ccRCC的恶性程度密切相关。

图6.cluster1和cluster2的ccRCC患者的总生存期