实验8_植物基因组DNA的提取20101104
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
8、微波炉； 9、电泳仪及电泳槽；
10、紫外检测仪。
五、实验操作方法和步骤 （一） 植物基因组DNA的提取
称取植物幼嫩叶子0.5g 65℃水浴保温1hr， 其间经常轻柔摇动 离心5,000g×5min 臵于预热到65℃的研体中， 加少许石英砂；加入预热到 65℃的核酸提取缓冲液3ml 迅速研成匀浆 转移到7ml带盖离心管中
三、实验材料与试剂 1、实验材料：植物幼嫩叶子 2、实验试剂 （1）基因组DNA提取缓冲液 （2）氯仿:异戊醇:乙醇抽提液 （3）TE缓冲液 （4）平衡酚： （5）RNA酶A （6）酚/氯仿 （7）氯仿/异戊醇 （8）异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。 （9） 3mol/L NaAc （10） 5×TBE缓冲液 （11） 6×电泳上样缓冲液 （12） 1.0%琼脂糖凝胶 （13） EB
加入3ml氯仿-异戊醇-乙醇溶液
轻柔颠倒混匀后， 室温静臵分层5min
上清液转移到干净7ml离心管中， 记录体积，弃沉淀，*①
加入等体积异丙醇试剂， 混和后静臵20min沉淀DNA
4℃离心5,000g×3 min收集絮状沉淀
加入3mlTE，65℃水浴中助溶15min，使之完全溶解 转移上清于新7ml离心管中，记录体积*② 吸取上清转移到一新7ml离心管中， 记录体积*③
当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的 准确测定。由于 DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸 收峰，盐和小分子则集中在230nm处。所以，一般情况下同时检测同一样品的 OD260、OD280和OD230，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。 2、核酸样品纯度判断的一般标准：
⑴ DNA纯度：OD260/OD280≈1.8，表示为纯的DNA；
OD260/OD280 ＞1.9，表示有RNA污染； OD260/OD280 ＜1.6，表示有蛋白质、酚等污染。
⑵ RNA纯度：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0，表示为纯的RNA；
OD260/OD280 ＜1.7时，表示有蛋白质或酚污染； OD260/OD280 ＞2.0时，表示可能有异硫氰酸残存。 ⑶ OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子 如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量； 同时也会影响酶切和PCR的效果。
① 凝胶电泳检测基因组DNA（分子量大小、纯度） ② 紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量
*植物基因组DNA的提取操作过程现象
① ②
③
④
*植物基因组DNA的提取操作过程现象
⑤
⑥
⑦
（二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 1、制胶（1％琼脂糖凝胶） 在胶模上架好梳子。称取01g琼脂糖，臵于250ml锥形瓶中，加100ml 0.5×TBE电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至50～60℃后， 加入EB，使其终浓度为0.5mg/L，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固 后，放入电泳槽中，倒入适量0.5×TBE（刚好淹过胶面），拔去梳子备用。 （注：EB为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作） 2、加样 取5ul纯化的DNA原溶液样品，与1ul 6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移 液枪小心加入样品槽中（注：勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡）。若DNA含 量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完 一个样品要换枪头以防互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将 样品槽底部凝胶刺穿。 3、电泳 加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100V，恒压电泳。 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需30～60min）。 4、观察和拍照 取出胶块臵于紫外灯下观察，DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光 带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。（注：紫外光对眼睛有害，观察时戴 上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察）。
第二部分 基因组DNA纯度与含量的测定
一、实验目的和要求
1、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法； 2、学习并掌握紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量的方法。
二、实验基本原理 核酸——DNA和RNA所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具 有紫外吸收的性质，它们在260nm处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长 进行核酸含量的测定。 波长为260nm时，DNA或RNA的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们 的不同构型而有差异。 对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02。 当OD260＝1时，双链DNA含量约为50μg / ml 单链DNA含量约为37μg / ml RNA含量约为40μg / ml 寡核苷酸含量约为30μg / ml（由于底物不同有差异） 1、核酸样品DNA、RNA含量的测定： 如用1cm光径石英比色皿，用 H2O稀释DNA或RNA样品n倍并以H2O为空白对 照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前DNA的含量： DNA（μg/μl）=50×OD260读数× DNA样品稀释倍数/1000 RNA（μg/μl）=40×OD260读数× RNA样品稀释倍数/1000 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量， 可使用溴化乙锭法或其他方法进行估算。
实验八
植物基因组DNA的提取 及纯度与含量的测定
Leabharlann Baidu
20101104
第一部分 植物基因组DNA的提取
一、实验目的和要求
1、学习并掌握植物基因组DNA的提取原理和方法；
2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测基因组DNA结果的初步分析。
二、实验基本原理 植物基因组DNA的提取一般经过破碎细胞壁、裂解细胞膜、除去多糖和酚 等次生物质、变性蛋白质、沉淀核酸、去除RNA和浓缩DNA等几个步骤。 传统提取方法主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB)法、十二烷基 硫酸钠 (SDS)法。其基本原理是：十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等 离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得 以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分 相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和 大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，加 入RNA酶去除核酸中的RNA,即得植物基因组 DNA溶液。 由于植物中的次生代谢产物——多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的 污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及 DNA聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。传统的CTAB-DNA提取法步骤多，较 烦琐，DNA产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的 效率。SDS法操作简单，温和,也可提取到较高分子量DNA，但所得产物含糖类 杂质较多,这将直接影响DNA的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆 含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液 中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
加入等体积的平衡酚，轻柔颠倒混匀，室静臵10min 加入1/2体积的平衡酚与1/2 体积的氯仿，轻柔颠倒混匀， 室温放臵15min 加入等体积的氯仿，颠 倒混匀，室温放臵5min
4℃离心12,000g×10min
4℃离心（12,000g，5min）
4℃离心（12,000g，10min）
吸取上清转移到一新7ml 离心管中，记录体积*④
本实验采用十二烷基硫酸钠 (SDS)法提取植物基因组DNA，基因组DNA提
取后，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA分子量大小、纯度；用紫外吸收
法测定基因组DNA纯度与含量。
DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定:
DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电 点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分 子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速 度不同。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后， 在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位臵。
（14） DNA分子量Markers： 125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp.
四、实验器材与仪器
1、研体 2、离心机、离心管（7ml）及离心管架； 3、微量移液器10ul、1000ul及枪头； 4、恒温水浴箱65 ℃ 5、制冰机； 6、冰箱；
7、恒温水浴箱 37℃；
在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题： （1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、 有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时 避免使用变性的条件。 （2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎 片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、 调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA） 除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。 （3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综 合考虑，取pH8.0左右为宜。 （4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，极 易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽 提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也 不要剧烈摇动。 （5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提 取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取 DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎， 植物材料最好是新鲜的。
三、实验材料与试剂
1、实验材料 植物基因组DNA样品
2、实验试剂
⑴ ddH2O； ⑵ TE缓冲液（pH 8.0）。 四、实验器材与仪器 1、离心机、离心管（5ml）及离心管架； 2、微量移液器10ul、200ul、1000ul及枪头； 3、紫外分光光度计； 4、石英比色皿（0.5cm光径）或1cm光径的微量石英比色皿（50ul、100ul）。
影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有： ⑴ DNA分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分 子量越大，迁移率越小。 ⑵ DNA构型的影响：超螺旋DNA＞线状DNA＞开环DNA ⑶ 胶浓度的影响： 浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度 为1％～2％； ⑷ 电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分 离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm） （电场强度） 。而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0V/cm电泳过夜。进行 高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。 ⑸ EB的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增 加。 ⑹ 电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们 各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。 TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用 TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护 DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。 ⑺ 碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大
加入5μl RNase（5μg/μl）， 37℃ 保温10min
加入1/10体积3mol/L NaAC和 2×体积–20℃预冷的无水乙 醇–20℃放臵20min
4℃离心（5,000g，3min）收集沉淀*⑥
4℃保存备用
*⑤
用70%乙醇洗涤沉淀，倾倒掉乙醇溶 液，干燥，让酒精完全挥发
用1mlTE溶解沉淀，即为植物基因组DNA溶液*⑦ 说明：如果蛋白质和RNA未去除干净，重复酚，酚/氯仿， 氯仿抽提步骤，继续用RNase处理，乙醇沉淀和洗涤， 重溶于TE中，直至基因组DNA纯度和质量符合要求。
10、紫外检测仪。
五、实验操作方法和步骤 （一） 植物基因组DNA的提取
称取植物幼嫩叶子0.5g 65℃水浴保温1hr， 其间经常轻柔摇动 离心5,000g×5min 臵于预热到65℃的研体中， 加少许石英砂；加入预热到 65℃的核酸提取缓冲液3ml 迅速研成匀浆 转移到7ml带盖离心管中
三、实验材料与试剂 1、实验材料：植物幼嫩叶子 2、实验试剂 （1）基因组DNA提取缓冲液 （2）氯仿:异戊醇:乙醇抽提液 （3）TE缓冲液 （4）平衡酚： （5）RNA酶A （6）酚/氯仿 （7）氯仿/异戊醇 （8）异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。 （9） 3mol/L NaAc （10） 5×TBE缓冲液 （11） 6×电泳上样缓冲液 （12） 1.0%琼脂糖凝胶 （13） EB
加入3ml氯仿-异戊醇-乙醇溶液
轻柔颠倒混匀后， 室温静臵分层5min
上清液转移到干净7ml离心管中， 记录体积，弃沉淀，*①
加入等体积异丙醇试剂， 混和后静臵20min沉淀DNA
4℃离心5,000g×3 min收集絮状沉淀
加入3mlTE，65℃水浴中助溶15min，使之完全溶解 转移上清于新7ml离心管中，记录体积*② 吸取上清转移到一新7ml离心管中， 记录体积*③
当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的 准确测定。由于 DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸 收峰，盐和小分子则集中在230nm处。所以，一般情况下同时检测同一样品的 OD260、OD280和OD230，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。 2、核酸样品纯度判断的一般标准：
⑴ DNA纯度：OD260/OD280≈1.8，表示为纯的DNA；
OD260/OD280 ＞1.9，表示有RNA污染； OD260/OD280 ＜1.6，表示有蛋白质、酚等污染。
⑵ RNA纯度：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0，表示为纯的RNA；
OD260/OD280 ＜1.7时，表示有蛋白质或酚污染； OD260/OD280 ＞2.0时，表示可能有异硫氰酸残存。 ⑶ OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子 如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量； 同时也会影响酶切和PCR的效果。
① 凝胶电泳检测基因组DNA（分子量大小、纯度） ② 紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量
*植物基因组DNA的提取操作过程现象
① ②
③
④
*植物基因组DNA的提取操作过程现象
⑤
⑥
⑦
（二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 1、制胶（1％琼脂糖凝胶） 在胶模上架好梳子。称取01g琼脂糖，臵于250ml锥形瓶中，加100ml 0.5×TBE电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至50～60℃后， 加入EB，使其终浓度为0.5mg/L，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固 后，放入电泳槽中，倒入适量0.5×TBE（刚好淹过胶面），拔去梳子备用。 （注：EB为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作） 2、加样 取5ul纯化的DNA原溶液样品，与1ul 6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移 液枪小心加入样品槽中（注：勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡）。若DNA含 量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完 一个样品要换枪头以防互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将 样品槽底部凝胶刺穿。 3、电泳 加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100V，恒压电泳。 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需30～60min）。 4、观察和拍照 取出胶块臵于紫外灯下观察，DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光 带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。（注：紫外光对眼睛有害，观察时戴 上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察）。
第二部分 基因组DNA纯度与含量的测定
一、实验目的和要求
1、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法； 2、学习并掌握紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量的方法。
二、实验基本原理 核酸——DNA和RNA所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具 有紫外吸收的性质，它们在260nm处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长 进行核酸含量的测定。 波长为260nm时，DNA或RNA的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们 的不同构型而有差异。 对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02。 当OD260＝1时，双链DNA含量约为50μg / ml 单链DNA含量约为37μg / ml RNA含量约为40μg / ml 寡核苷酸含量约为30μg / ml（由于底物不同有差异） 1、核酸样品DNA、RNA含量的测定： 如用1cm光径石英比色皿，用 H2O稀释DNA或RNA样品n倍并以H2O为空白对 照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前DNA的含量： DNA（μg/μl）=50×OD260读数× DNA样品稀释倍数/1000 RNA（μg/μl）=40×OD260读数× RNA样品稀释倍数/1000 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量， 可使用溴化乙锭法或其他方法进行估算。
实验八
植物基因组DNA的提取 及纯度与含量的测定
Leabharlann Baidu
20101104
第一部分 植物基因组DNA的提取
一、实验目的和要求
1、学习并掌握植物基因组DNA的提取原理和方法；
2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测基因组DNA结果的初步分析。
二、实验基本原理 植物基因组DNA的提取一般经过破碎细胞壁、裂解细胞膜、除去多糖和酚 等次生物质、变性蛋白质、沉淀核酸、去除RNA和浓缩DNA等几个步骤。 传统提取方法主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB)法、十二烷基 硫酸钠 (SDS)法。其基本原理是：十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等 离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得 以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分 相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和 大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，加 入RNA酶去除核酸中的RNA,即得植物基因组 DNA溶液。 由于植物中的次生代谢产物——多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的 污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及 DNA聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。传统的CTAB-DNA提取法步骤多，较 烦琐，DNA产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的 效率。SDS法操作简单，温和,也可提取到较高分子量DNA，但所得产物含糖类 杂质较多,这将直接影响DNA的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆 含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液 中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
加入等体积的平衡酚，轻柔颠倒混匀，室静臵10min 加入1/2体积的平衡酚与1/2 体积的氯仿，轻柔颠倒混匀， 室温放臵15min 加入等体积的氯仿，颠 倒混匀，室温放臵5min
4℃离心12,000g×10min
4℃离心（12,000g，5min）
4℃离心（12,000g，10min）
吸取上清转移到一新7ml 离心管中，记录体积*④
本实验采用十二烷基硫酸钠 (SDS)法提取植物基因组DNA，基因组DNA提
取后，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA分子量大小、纯度；用紫外吸收
法测定基因组DNA纯度与含量。
DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定:
DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电 点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分 子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速 度不同。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后， 在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位臵。
（14） DNA分子量Markers： 125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp.
四、实验器材与仪器
1、研体 2、离心机、离心管（7ml）及离心管架； 3、微量移液器10ul、1000ul及枪头； 4、恒温水浴箱65 ℃ 5、制冰机； 6、冰箱；
7、恒温水浴箱 37℃；
在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题： （1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、 有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时 避免使用变性的条件。 （2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎 片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、 调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA） 除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。 （3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综 合考虑，取pH8.0左右为宜。 （4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，极 易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽 提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也 不要剧烈摇动。 （5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提 取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取 DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎， 植物材料最好是新鲜的。
三、实验材料与试剂
1、实验材料 植物基因组DNA样品
2、实验试剂
⑴ ddH2O； ⑵ TE缓冲液（pH 8.0）。 四、实验器材与仪器 1、离心机、离心管（5ml）及离心管架； 2、微量移液器10ul、200ul、1000ul及枪头； 3、紫外分光光度计； 4、石英比色皿（0.5cm光径）或1cm光径的微量石英比色皿（50ul、100ul）。
影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有： ⑴ DNA分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分 子量越大，迁移率越小。 ⑵ DNA构型的影响：超螺旋DNA＞线状DNA＞开环DNA ⑶ 胶浓度的影响： 浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度 为1％～2％； ⑷ 电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分 离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm） （电场强度） 。而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0V/cm电泳过夜。进行 高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。 ⑸ EB的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增 加。 ⑹ 电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们 各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。 TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用 TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护 DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。 ⑺ 碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大
加入5μl RNase（5μg/μl）， 37℃ 保温10min
加入1/10体积3mol/L NaAC和 2×体积–20℃预冷的无水乙 醇–20℃放臵20min
4℃离心（5,000g，3min）收集沉淀*⑥
4℃保存备用
*⑤
用70%乙醇洗涤沉淀，倾倒掉乙醇溶 液，干燥，让酒精完全挥发
用1mlTE溶解沉淀，即为植物基因组DNA溶液*⑦ 说明：如果蛋白质和RNA未去除干净，重复酚，酚/氯仿， 氯仿抽提步骤，继续用RNase处理，乙醇沉淀和洗涤， 重溶于TE中，直至基因组DNA纯度和质量符合要求。