冰冻切片及电镜标本的制备
冷冻电镜技术的原理和样品制备方法
冷冻电镜技术的原理和样品制备方法当我们谈论到电子显微镜（electron microscopy）时，多数人会想到传统的高分辨率电镜，然而冷冻电镜（cryo-electron microscopy）技术在近年来却引起了科学界的广泛兴趣。
冷冻电镜技术是一种能够观察生物大分子结构的重要技术手段，主要包括扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）两种主要形式。
本文将会介绍冷冻电镜技术的原理和样品制备方法。
冷冻电镜技术是一项复杂而独特的技术，广泛应用于病毒学、细胞生物学和生物物理学等领域。
其主要原理是将待观察的样品在低温下迅速冷冻，以减小样品中的弥散和聚集现象。
这样可以保持样品在接近生理环境下的原貌，更好地揭示生物分子的结构及其功能。
冷冻电镜技术具有高分辨率、无需染色和易于操作等特点，因此广泛应用于人们对生物体系的研究中。
样品制备是冷冻电镜技术的关键步骤之一。
样品制备的主要挑战是如何在保持样品原貌的同时使其适应电镜观察。
一般来说，样品的制备分为固态样品和溶液样品两种类型。
对于固态样品，首先要将待观察的样品制备成薄片。
这可以通过机械划片、离心切片或冷冻刀片切片等方法实现。
接下来的关键步骤是样品的冷冻。
为了避免样品的溶解和水分的蒸发，科学家们通常会采用高压冷冻法或液氮冷冻法。
高压冷冻法可以原位固化样品，减少水分蒸发；而液氮冷冻法则可以快速冷却样品，保持样品的自然结构。
冷冻后，样品可以通过薄片金箔浇筑、有机玻璃浇筑等方式加固，以提高其稳定性。
对于溶液样品，主要有两种常见的制备方法：投射和冷冻.为了制备冷冻样品，要将待观察的样品溶解在适当的缓冲液中，并通过超速离心来去除残留的颗粒物质。
然后，将样品放置在薄膜上，通常是铜格子膜或碳膜，并在低温下迅速冷冻以固化样品。
这种方法需要使用特殊的冷冻装置，如液氮盒，其可以通过控制温度和湿度，确保样品冷冻过程中的环境条件。
无论是固态样品还是溶液样品，接下来的步骤都是与电镜观察密切相关的。
冷冻电镜实验方法
冷冻电镜实验方法引言：冷冻电镜（Cryo-EM）是一种先进的显微镜技术，可以用于观察生物分子的高分辨率结构。
与传统的电镜技术相比，冷冻电镜在样品制备过程中避免了化学固化和染色等步骤，因此能够保持生物分子的原始状态，提供更真实的结构信息。
本文将介绍冷冻电镜实验方法的基本步骤和关键技术。
一、样品制备1. 选择合适的样品：冷冻电镜适用于观察各种生物分子的结构，包括蛋白质、核酸、病毒等。
样品应具有较高的纯度和稳定性，以确保实验结果的准确性。
2. 冷冻固化：将样品溶液滴在金属网格上，然后迅速将其浸入液氮中，使样品迅速冷冻成无定形的冰层。
冷冻过程中，要尽量避免样品的晶化和结构变化。
3. 选择合适的冷冻介质：冷冻介质可以增强样品的稳定性并减少冷冻过程中的结构损伤。
常用的冷冻介质包括蔗糖、甘油等。
二、冷冻电镜图像获取1. 冷冻电镜仪器设置：调整冷冻电镜的操作参数，如加速电压、聚焦、对比度等，以获得清晰的图像。
2. 样品加载：将冷冻固化的样品网格安装到冷冻电镜仪器中，确保样品的位置准确，并避免震动和晶格偏移。
3. 图像获取：通过调整电子束的强度和聚焦，使电子束通过样品并与样品相互作用，产生散射。
通过捕捉和记录散射电子的位置和强度，得到样品的二维或三维图像。
4. 图像处理：对获得的图像进行去噪、对齐、投影重建等处理，以提高图像的质量和分辨率。
三、冷冻电镜实验注意事项1. 样品保持低温：在整个实验过程中，要保持样品的低温状态，以防止样品结构的热损伤和冰晶的熔化。
2. 避免辐射损伤：电子束的辐射可能会对样品产生破坏，因此在图像获取过程中要控制电子束的强度和曝光时间。
3. 样品纯度和稳定性：样品的纯度和稳定性对于获得高质量的冷冻电镜图像至关重要。
应该避免样品中的杂质和聚集现象。
结论：冷冻电镜实验方法是一种强大的工具，可以帮助科学家们研究生物分子的结构和功能。
通过合理的样品制备和仪器调整，冷冻电镜可以提供高分辨率和真实的结构信息，为生物科学研究提供有力的支持。
冷冻超薄切片原理和使用
冷冻超薄切片原理和使用冷冻超薄切片原理和使用冷冻超薄切片技术是一种为了研究更接近于生物生活状态结构和功能而发展起来的电镜样品制备技术。
它是把样品进行冷冻固定后，进行超薄切片，省去了经典超薄切片法的长时间的固定、脱水和也埋等处理。
样励在切片前后，不经过强烈的化学处理，约胞结构能得到很好的保存；尤其是可溶性成分小会被抽提，使得电镜图像更接近于生物的生活状态。
可用于细胞免疫化学、可溶性成分自显影、尤其在X射线微区成分分析等研究中。
冷冻超薄切片机操作：在超薄切片机上加上高压冷冻仪冷冻附件就可进行。
冷冻超薄切片的制备程序可为两类：1.无溶液制备法：包括取材、快速冷踪、冷冻替代、切片、干燥、染色或不染色、镜检等几个步骤。
主要用于可溶性物质的放射白显影和X射线微区分析。
2.固定样品制备法：包括取材、醛类阑定、样品包埋或不包埋、冷冻保护处IR、快速冷冻切片、染包及镜检等步骤。
适用于进行形态学、细胞化学和免疫细胞化学研究。
用户经培训后取得资格可自行使用超薄切片机，使用步骤如下：1）开机2）检查是否处于切片模式，检查顶光底光是否亮度正常；3）将包埋块放入适当夹头并用六角扳手旋紧，以固定包埋块；（然后将夹头安装在修快台进行修快）；4）将夹头放入机械臂，并用手旋好螺丝上紧夹头（不可用六角扳手）；5）将玻璃刀/钻石刀安装在刀台上，用手旋好螺丝以固定刀，并注意检查刀台是否固定于底座上；6）检查刀间隙角，调整刀台角，选择适当的夹头角度等；7）设定切片窗口（上下范围）；8）对刀；9）选择所用切片速度和厚度；10）在刀槽内注水，注意水面平整；11）切片、捞片；12）关机、清理切片机，拿走个人物品，保持切片台面整洁；13）登记使用记录。
冷冻电子显微镜的使用技巧与样品制备方法
冷冻电子显微镜的使用技巧与样品制备方法冷冻电子显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，可以用来观察生物样品的微观结构。
它的使用技巧和样品制备方法在生物学研究中非常重要。
本文将介绍冷冻电子显微镜的使用技巧以及一些常用的样品制备方法。
一、冷冻电子显微镜的使用技巧1. 仔细准备样品：在使用冷冻电子显微镜之前，首先需要准备好样品。
样品的选择要根据研究的目的来确定。
对于生物样品，通常需要制备成薄片或网状结构，以便电子束能够穿过样品并获得最佳的分辨率。
同时，还需注意样品的稳定性，避免冷冻过程中的溶胀或冻伤等情况。
2. 配置合适的显微镜参数：冷冻电子显微镜使用过程中，合适的显微镜参数配置也是非常重要的。
例如，应根据样品的大小和形状选择合适的孔径和窗口尺寸；合理选择加速电压和电流等参数，以获得最佳的成像效果。
此外，还需合理调节对比度和亮度，以获得清晰的图片。
3. 样品的冷冻和传输：冷冻是冷冻电子显微镜技术的关键步骤。
在冷冻过程中，样品应迅速冷冻，并保持低温以防止溶胀。
冷冻过程可以使用液氮或液氮混合物进行。
在将样品加载到冷冻电子显微镜中之前，还需要将样品传输到适用的载玻片上，以确保样品的稳定性。
4. 图像的拍摄和分析：在使用冷冻电子显微镜进行拍摄时，需要注意减少图像模糊和伪迹的产生。
可以通过调整对焦、快速曝光和合理选择显微镜参数等措施来优化图像质量。
对于采集的图像，可以使用图像处理软件进行后期处理和分析，以提取有关样品结构和特征的信息。
二、样品制备方法1. 冷冻固化法：冷冻固化法是一种常用的样品制备方法，适用于研究细胞和组织的结构。
首先，将样品固定在液氮或液氮混合物中，然后迅速冷冻以保持样品的原始结构。
冷冻后，可以通过切片或断面技术来观察样品的微观结构。
2. 冷刀法：冷刀法适用于制备大分子复合物等较大的样品。
在这种方法中，样品首先通过冷冻固化法获得，然后使用冷冻刀片切割成较小的块。
切割后的样品块可以通过冷冻切片技术获得较薄的样品切片，以便于冷冻电子显微镜的观察。
电镜切片样品制作步骤
电镜切片样品制作步骤1.样品固定：首先需要选择适当的固定剂将待观察的样品固定在其中一种状态下。
常用的固定剂有冷冻醇、甲醛、醋酸乙烯等。
固定剂的选择需根据待观察的样品性质和研究目的进行确定。
2.洗涤：固定后的样品需要进行洗涤以去除固定剂和不需要的杂质。
常见的洗涤液包括磷酸盐缓冲液(PBS)和磷酸盐缓冲液。
洗涤的步骤和次数根据样品和实验要求可以有所不同。
3.电镜样品预备：电镜切片样品制作需要将洗涤后的样品处理成合适的状态。
通常情况下，样品需要进行脱水和浸渍。
脱水是将样品逐渐从水中转移到乙醇或丙酮中，以保持样品在固定状态。
浸渍是将样品浸入浸渍剂，使得样品透明并易于切片。
4.树脂包埋：将经过脱水和浸渍的样品置于树脂中浸泡，待树脂浸透后，进行树脂包埋。
这一步骤的目的是使样品更加稳定，并得到均匀的切片。
5.切片：经过树脂包埋后，使用超薄切片机进行切片。
切片机通常配备钻石刀，可以切割出纳米尺度的切片。
切片过程需要控制多个参数，如切片角度、速度、厚度等，以获取最佳的切片切面。
6.切片品质检查：将切片放置在显微镜下观察，检查切片的品质。
如果切片有较多的损伤、断裂或不透明的区域，可以重新进行切片。
7.网格染色：切片制备完成后，进行网格染色以提高对比度和观察的清晰度。
常用的网格染色方法有使用庞氏染色剂或重金属染色剂。
8.显影：将染色后的切片放入显影剂中进行显影，增强对比度和细节。
9.气相金属喷镀：一些样品需要进行气相金属喷镀以提高导电性。
将样品放入金属喷镀仪器中，通过高温蒸发金属薄膜，在样品表面形成导电薄膜。
10.观察和记录：将制备好的切片放置在电镜台上，使用透射电子显微镜进行观察。
在观察的同时，及时记录所见到的现象和数据。
综上所述，电镜切片样品制作是一个复杂的过程，需要经过固定、洗涤、预备、包埋、切片、染色、显影、喷镀等多个步骤。
每个步骤都需要合适的条件和操作技巧，才能得到理想的样品，为电镜观察提供准确、可靠的数据基础。
冷冻电镜流程
冷冻电镜流程一、引言冷冻电镜（Cryo-EM）是一种用于观察生物分子结构的先进技术。
与传统的电子显微镜相比，冷冻电镜能够在冷冻状态下直接观察生物样品，避免了生物样品在制备过程中的伪装和变性，从而提供了更真实、更准确的结构信息。
本文将介绍冷冻电镜的基本流程。
二、冷冻电镜流程1. 样品制备冷冻电镜的样品制备是整个流程中非常关键的一步。
首先，需要选择适合冷冻电镜观察的样品，如蛋白质、细胞或病毒等。
然后，将样品制备成纯净的溶液或悬浮液。
接下来，将样品滴在特制的网格上，并通过吸附或冷冻的方式将样品固定在网格上。
2. 冷冻冷冻是冷冻电镜中非常重要的一步，它能够保持样品的原始结构。
冷冻的主要目的是使样品迅速冷却到液氮温度，避免样品在冷冻过程中发生结构变化。
通常，可以使用液氮冷冻样品，或者将样品暴露在液氮中的乙烷中进行冷冻。
3. 电子显微镜扫描在冷冻样品制备完成后，需要将样品放入电子显微镜中进行扫描。
在电子显微镜中，样品受到电子束的照射，并通过透射电子显微镜模式观察样品的结构。
通过调整电子束的条件和样品的位置，可以获取不同角度和不同焦距下的图像。
4. 图像处理获得的电子显微镜图像通常是模糊且包含噪声的。
因此，需要对图像进行处理，以获得更清晰、更准确的结构信息。
图像处理的主要步骤包括去噪、增强对比度、对齐和三维重建等。
通过这些处理步骤，可以获得高分辨率的三维结构模型。
5. 结果分析需要对获得的结构模型进行分析和解释。
可以使用分子建模软件将蛋白质或其他生物分子的原子坐标与结构模型进行比较，以验证模型的准确性。
此外，还可以使用其他生物物理学和生物化学技术对结构进行进一步的验证和研究。
三、总结冷冻电镜流程是一系列严格的步骤，其中每个步骤都非常关键。
样品制备、冷冻、电子显微镜扫描、图像处理和结果分析都需要仔细操作和科学实验设计。
通过冷冻电镜，我们可以获得高分辨率的生物分子结构信息，为生物科学研究提供了强有力的工具。
未来，冷冻电镜技术的发展将进一步推动生物科学的进步和发展。
冷冻电镜制样流程
冷冻电镜制样流程冷冻电镜（cryo-electron microscopy）是一种用于观察生物分子的高分辨率电镜技术，它可以在冷冻的状态下直接观察生物分子的结构。
相比传统的电镜技术，冷冻电镜能够提供更高的分辨率和更真实的结构信息，因此在生物科学研究中得到了广泛的应用。
1.选择适当的样品：首先，要选择适合进行冷冻电镜观察的样品，通常是蛋白质、蛋白质复合物、病毒或细胞等生物分子。
样品应具有较高的纯度和稳定性，并且能够在低温条件下适当冻结。
2.制备冷冻电镜网格：使用特殊的电子显微镜网格制备样品载体，通常是由碳或氧化硅等材料制成。
这些网格是非常薄的，样品可以被直接放置在其表面。
3.调整制样参数：根据样品的特性和所需要的分辨率，调整各种制样参数。
这些参数包括冷冻速率、冻结液的成分和温度等。
冷冻速率是制样的关键参数之一，它能影响样品的冷冻效果和结构质量。
4.加载样品：将样品溶液滴在电镜网格上，然后迅速从反面用纸吸干多余的液体。
样品的浓度应适当，以避免结构中的过度吸收或散射。
5.冷冻样品：将已加载的样品网格迅速放置在冷冻压制机中，通过控制温度和压力来冷冻样品。
冷冻的目的是快速冻结样品，以保持其原始结构。
6.保存和传输样品：冷冻后的样品应立即封存，通常使用液氮来保存。
在传输或搬运时，需要采取适当的保护措施，确保样品不受到损坏。
7.电镜观察：将冷冻的样品网格放置在冷冻电镜中，然后使用高分辨率电子束来观察样品的结构。
观察过程中需要避免样品的加热和辐射。
8.取得图像和数据处理：通过电子镜的成像系统获得样品图像，然后使用图像处理软件对图像进行修正和重建。
这些步骤包括噪声过滤、对齐和三维重构等。
冷冻切片法流程
冷冻切片法流程冷冻切片法可是个很有趣的实验方法呢！让我来给你讲讲它的流程吧。
一、准备工作。
咱得先把要用的东西都准备好。
像冷冻切片机得提前检查好，确保它能正常工作。
还有载玻片、盖玻片，这些小物件可不能少。
冷冻剂也得备足了，这就像是给咱们的切片准备的“小冰箱”呢。
另外，取材工具也很重要，像手术刀之类的，要锋利又干净。
标本也是关键，要选取合适的组织，这个组织得具有代表性，就像选演员一样，得挑个能把整个故事讲清楚的“主角”组织。
二、取材。
这一步可不能马虎。
要快速地把组织取出来，为啥要快呢？因为时间一长，组织可能就会发生变化啦。
就像新鲜的水果放久了会烂一样，组织放久了结构可能就不那么准确了。
取出来的组织大小也要合适，不能太大也不能太小。
太大了放不进切片机，太小了又可能切不到想要的结构，就像穿衣服一样，得不大不小刚刚好。
而且在取材的时候，要尽量减少对组织的损伤，这组织可是很“娇弱”的呢。
三、冷冻。
把取好的组织放到冷冻切片机里面冷冻。
这个过程就像是把食物放进冰箱速冻一样。
冷冻的温度得调好，不能太冷也不能不够冷。
太冷了可能会让组织变得太硬，容易碎掉，就像冰块掉地上容易裂一样。
不够冷呢，组织又切不好，软趴趴的怎么能切出漂亮的切片呢。
在冷冻的时候还要注意观察组织的状态，就像看着锅里的菜有没有熟一样。
四、切片。
等组织冷冻好了就可以切片啦。
切片的时候手要稳，就像绣花一样。
切片的厚度也很有讲究，太厚了看不清楚细胞结构，太薄了又容易切坏。
这就需要不断地练习，找到那种恰到好处的感觉。
而且切出来的切片要完整，不能缺边少角的，不然就像漂亮的拼图少了几块，多可惜呀。
五、贴片。
切好的片子要贴到载玻片上。
这个时候要小心操作，就像把小宝贝轻轻地放在床上一样。
要确保片子贴得平平整整的，不能有褶皱，要是有褶皱就像衣服没熨平一样，看着就不舒服，而且还会影响观察呢。
六、染色。
贴片完成后就可以染色啦。
染色剂就像给组织穿上不同颜色的衣服，这样我们就能更清楚地看到不同的结构啦。
冰冻切片制作及质量控制
冰冻切片制作及质量控制冰冻切片是一种常用的组织学研究方法，广泛应用于生物医学研究领域。
它可以保持组织的原始形态和结构，适用于光镜、电镜和免疫组化等多种研究方法。
在进行冰冻切片制作时，需要注意一些关键步骤和质量控制措施，以确保获得高质量的切片材料。
1.样品准备样品准备是冰冻切片制作的第一步。
样品可以是动物组织或细胞，也可以是植物组织。
在样品准备过程中，需要注意以下几点：-样品的自然纹理：对于动物组织，应将样品固定在适当的溶液中，以保持其自然纹理。
对于植物组织，应注意保持组织的形态和结构。
-样品的尺寸：样品的大小应适合冰冻切片仪的切片室大小。
过大的样品可能无法完全冻结，导致切片质量降低。
2.样品冷冻将样品冷冻是冰冻切片制作的关键步骤之一、样品冷冻的目的是在不损坏样品的情况下将其冷冻成脆性，以便后续切片。
以下是几种常用的样品冷冻方法：-空气冷冻：样品通过将其放置在冷冻剂中（如液氮或酒精等）迅速冷冻，使其变得脆性。
这种方法适用于较小的样品。
-次凝胶冷冻：将样品浸入液体凝胶中，使其均匀冷冻。
这种方法适用于较大的样品。
-快速冷冻机冷冻：使用快速冷冻机将样品超快速冷冻。
这种方法可以快速冷冻样品，并保持其形态和结构。
3.样品切片样品冷冻后，可以使用冰冻切片机将其切成薄片。
以下是一些注意事项：-选择合适的切片机：合适的切片机应具有良好的冷冻性能和切割能力。
切片机的刀片应尖锐，以便切割样品。
-控制切片厚度：切片厚度直接影响到后续研究结果的准确性。
根据实验需求选择合适的切片厚度，并保持在一定范围内的一致性。
-控制切片速度：切片速度应适中，过快可能导致切片不均匀，过慢可能导致切片丢失或拉长。
-冷藏切片：在切片过程中，应将切好的切片放入冷冻盒中，以防止其变形或融化。
冷藏过程中应注意避免切片受压。
4.质量控制为了确保冰冻切片的质量，需要进行一定的质量控制措施：-内外标准：在切片中加入内外标准物质，以确保切片的准确性和可比性。
冰冻切片的制备
冰冻切片组织的制备:固定将组织置于4%多聚甲醛固定液中，4℃摇床过夜。
漂洗将固定后的标本用1X PBS漂洗三次，每次15分钟。
脱水将组织置于30%蔗糖溶液中，4℃摇床过夜。
第二天观察是否脱水完全，判断的标准是，当管竖直时，组织是否沉到蔗糖溶液的底部，若组织已完全沉降到蔗糖溶液的底部，平放或震荡后仍能沉降，则可判断组织已脱水完全。
包埋将组织倒入培养皿中，用眼科刀将脑和脊髓根据切片切面的需要在不同的部位切开，并做好头尾端的标记。
之后将组织置于包埋盒中，用滤纸吸干组织周围多余的蔗糖溶液，滴加OCT（optimal cutting temperature compound）到包埋盒中，用移液枪头小心的将组织周围的O.C.T混匀，切忌起气泡，静止10分钟，以防切片时脱片。
重新取一个包埋盒，将组织移入到包埋盒中，倒入OCT，再次用移液枪头将组织与O.C.T 混匀，将组织按切片需要方向摆放于包埋盒的底部，迅速置于干冰与酒精的混合物中。
在包埋盒上做好标记，用保鲜膜和锡纸包好后放入-80℃冰箱贮藏待切。
切片：切片前先将切片机的箱体温度及刀头温度均设为-20℃，把包埋盒从-80℃冰箱取出置于切片机中平衡半小时左右。
之后将包埋块用O.C.T固定在样品托上，然后将样品托固定在样品头上，调整合适的位置，以使样品与刀头处于平行位置。
手动切片。
用细毛笔将切片均匀整齐地平铺在明胶包被的载玻片上，室温下晾片30min-1h后进行免疫组化染色。
冰冻切片的快速染色法冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。
以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。
根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。
冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。
图解细胞学冰冻切片的制作方法
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图解细胞学冰冻切片的制作方法
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载玻片叠加其上并予轻压 ，再将该 ２张载玻片朝反 向拉 动 ， 从而获得 ２张涂片 ， 每个离心管都相应地 制作这样的 ２张涂
片， 当载玻 片 上涂有 细胞的周边部 分已经 自然风干而 中部仍
没
有完 全风干后 即可用 乙醇一 冰 醋酸液 固定 液固定 １ ５ ３ ０ ａｉ ｒ ｎ
瘤脱落细胞 中的也川 『 Ｊ １ ． 临 床 与实验 病理 学 杂志 ，２ ０ ０ ３ ，Ｉ ９
（ ４） ： ４ ０ ９ — ４ １ ０ ．
（ 收 稿 日期 ： ２ ０ ｌ ６ — ０ ７ — １ ６ ）
整个流程通过文字结合图解 的方式介绍如下 。
１ 方 法
１ ． １ 离心 ：用一次性塑料 吸管 或者一次性针筒 吸取标 本瓶／ 袋 中底部 的胸 、 腹 腔积液 ， 尽量多 吸取沉 淀 物或 者絮 状物 ， 加 人到 一次性 离心管 中进 行离 心 （ ２ ０ ０ ０ ｄ ａ ｒ ｉ ｎ ， １ ０ ～ ２ ０ ａ ｒ ｉ ｎ ） ， 弃掉』 － 清液 ， 置于震荡机上面震荡 ５ ～ １ ０ ｓ ． 见图 １ 。 １ ． ２ 常规细胞学涂片 ： 采用拉片法的方法 ： 用规格 ｌ Ｏ ～ ｌ ｏ ０ Ｌ
２ ． １ 常 规 细 胞学 涂 片 染 色 结 果 ： 因 为 高度 怀 疑 恶 性 肿 瘤 患 者
冰冻组织切片样品制备方法
冰冻组织切片样品制备方法组织采集后，经固定、冷冻、切片、晾片，方可进行免疫抗体标记。
1、组织的采集、固定和保存：不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而考虑采用不同的固定和保存方法。
此处介绍几种实验室常用方法。
液氮冷冻法：采取新鲜组织后，即可放入液氮中，并保存于液氮中。
固定法：采取新鲜组织后，4%多聚甲醛（4%PFA）4︒C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜，PBS缓冲液洗三次，每次10-30min，20%蔗糖中浸泡1小时或过夜，4︒C保存于20%蔗糖（含0.05%NaN3）中。
2、组织的冷冻和切片：组织的冷冻方法可根据固定和保存条件不同而不同。
使用冷冻切片机，将组织冰切成4-20μm的切片，粘贴于处理过的载玻片上，室温干燥1小时后，可进行免疫标记。
或放入载片盒，-80︒C密闭保存。
气体CO2冷冻法：将样品置于样品台的OCT中，打开钢瓶开关，CO2气体喷出，迅速冷冻组织样品。
干冰冷冻法：（适合小块和致密度低的组织，如胚胎、小块组织、活检组织等）将小组织块放入冷冻包埋模具中，调整切面位置（必要时可在体视镜下操作）后，置于干冰上（暂时无干冰，可置于-80︒C），待冷冻完全后，-80︒C密闭保存。
●直接冷冻法：将样品直接粘着在涂有OCT的样品台上，于冰切机（箱体温度-80︒C）中直接冷冻。
3、冰冻组织切片的免疫荧光标记：将冰冻组织切片从-80︒C 冰箱中取出，室温放置10min, 待切片回温并干燥，PBS 10min 洗去OCT，可无需Triton处理，即可进行免疫抗体标记，操作步骤与培养细胞反应方法相同。
4、冰冻组织切片的免疫酶反应：（酶联免疫反应，在抗体作用之前或显色时组织样品需进行内源性酶抑制作用，以降低反应背景）碱性磷酸酶（AP）:密封保存的组织切片PBS 5min↓含0.5%NS,1%BSA的PBS中室温封闭30min-1hr↓一抗（稀释过）室温1-1.5hr或4︒C 过夜↓PBS 10min ⨯ 3↓二抗-AP（稀释过）室温1.5-2hr↓PBS 10min ⨯ 3↓显色: AP-CDS 5min⨯ 2↓NBT4.5μl/ml、BCIP3.5μl/ml in AP-CDS 室温或37︒C 5-30min↓TE 室温10min↓梯度乙醇脱水↓二甲苯透明↓中性树胶封片辣根过氧化物酶（HRP）:密封保存的组织切片PBS 5min↓3%H2O2.10% MeOH in PBS 室温3min↓PBS 5min⨯ 3↓含0.5%NS,1%BSA的PBS中室温封闭30min-1hr↓一抗（稀释过）室温1-1.5hr或4︒C 过夜↓PBS 10min ⨯ 3↓二抗-HRP（稀释过）室温1.5-2hr↓PBS 10min ⨯ 3↓显色: HRP-CDS室温20-30min↓梯度乙醇脱水↓二甲苯透明↓中性树胶封片。
电镜标本的制备方法
电镜标本的制备方法我搞电镜标本制备可费了老劲了，一开始真的是瞎摸索。
我就先说说我最开始的尝试吧，简直是一塌糊涂。
那时候对于固定这个步骤完全没概念。
固定嘛，就像我们要把一个调皮捣蛋随时可能变形的小孩给稳住一样重要。
我第一次做的时候，固定液的浓度没掌握好，要么太浓把标本给弄得有些奇怪的变化，要么太稀根本就起不到固定的作用。
后来我就不断地查资料试不同的浓度，发现每种标本可能适合的固定液浓度真的不太一样，就像不同的人喜欢不同口味的食物是一个道理。
说到包埋这个步骤呀，我一开始也是搞得手忙脚乱的。
就跟咱们包饺子一样，这个皮得合适才行，包埋材料不好就像破皮的饺子，在后面切片的时候那可就要出大乱子了。
我试过一些普通的包埋材料，但是发现它们对于有些精细的结构的标本就不太合适，后来找了专业的、比较高级一点的材料，效果才好了起来。
切片这环节，哎，那就是一部血泪史。
我用过一些旧的切片机，那真叫一个难用，每次切出来的片子那厚度根本不均匀，就像被狗啃过一样参差不齐。
而且切的时候如果标本没固定好或者包埋有问题，那片子就碎得跟渣似的根本不能用。
我也是后来才知道，切片的时候速度呀、力度呀也是得根据标本的情况来调整的，就像开车一样，不同的路况得有不同的驾驶方式。
还有染色这个步骤，这可有点像给标本穿衣服，染得不好看或者不均匀，就像衣服没穿好，很难看清楚它的结构。
我有一次调染色剂的配方就搞错了，结果染出来的样本一片模糊，就好像在雾里看花一样。
后来慢慢尝试不同的比例，才找到了比较合适的配方。
关于电镜标本的制备方法呀，虽然我现在也不能说我已经炉火纯青了，但是我这些尝试的经验啊是很真实的。
我觉得大家在做的时候也要多尝试，多从错误中学习，不要害怕失败，就像我一样，一次又一次地做，总能摸索出适合自己研究样本的制备方法。
冷冻电镜流程范文
冷冻电镜流程范文冷冻电镜（cryo-electron microscopy，简称cryo-EM）是一种用于研究生物大分子结构的高分辨率成像技术。
相比于传统的电镜技术，冷冻电镜可以在细胞或组织样品冷冻的状态下进行成像，避免了样品处理过程中的伪影和结构变化，提供更准确和生理活性的结构信息。
下面将详细介绍冷冻电镜的一般流程。
1.选择合适的样品：样品的选择对于冷冻电镜成像至关重要。
通常，样品要求具有足够的纯度和浓度，并且在低温下有完整的结构保持。
常见的样品有蛋白质复合物、病毒、细胞色素和膜蛋白等。
2.制备冷冻电镜样品：样品制备是整个流程中最关键的步骤之一、首先，样品必须以适当的缓冲液和添加剂进行稀释和退磷酸化。
然后，将样品滴加到一个高干燥的电镜网格上，使其在常温下形成一个薄的液滴。
3.冷冻：为了使样品在冷冻过程中维持其结构完整性，需要快速冷冻。
最常用的方法是将样品置于液氮中进行冷冻，也可以使用其他冷冻介质如乙烯基甘油等。
冷冻过程需要控制好速度和温度，以避免样品的结冰损伤。
4.制备冷冻电镜样品：在冷冻电镜样品制备中，还需要进行样品的挑选和筛选。
冷冻电镜网格具有大量的孔洞，每次成像只能选择其中的一到两个。
所以冷冻电镜样品制备需要快速扫描和筛选出较高质量的样品。
5.冷冻电镜成像：冷冻电镜成像是整个流程的核心部分。
成像前需要将样品置于电镜中，并进行调试和校准。
冷冻电镜成像过程中，电子束通过样品，并通过电子镜中的透射电子和反射电子产生图像。
成像时，需要控制好电子束的强度和对样品位置的精确控制。
6.数据采集和处理：完成冷冻电镜成像后，可以进行图像的数据采集和处理。
数据采集通常使用数字化相机记录图像。
数据处理中，首先对图像进行对齐和校正，去除图像的扭曲和伪像，然后使用计算方法重建三维结构。
数据采集和处理的过程需要利用专业的软件和算法来完成。
7.结果分析和解释：在获得三维结构后，可以对结果进行进一步的分析和解释。
可以使用特定的软件进行结构分析，并与已知的结构进行对比。
冰冻切片及电镜标本的制备
冰冻切片的制备一、冰冻切片技术的概述(一)优点:1.简便,可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片,减少了一些中间环节。
2.快速,用时短。
3.组织变化不大。
4.能很好保存脂肪,类脂等成分。
5.能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类,特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。
(二)缺点:1.不容易做连续切片。
2.切取的组织不能过大,组织过大不容易冻结或者组织冻结不均,影响切片及染色效果。
3.不容易制作较薄的切片。
4.组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位,并且组织结构也不如石蜡切片清晰。
(三)主要应用于:1.用于有些水解酶的定位的组织化学方法以及免疫组织化学方法等。
2.用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染色时的切片。
3.用于临床手术的快速病理诊断。
二、冰冻切片机的使用及注意事项(1)新鲜的组织制备组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好,才能避免冰晶,常用的骤冷剂有:①CO2气(-78℃)②丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷(-80℃)③液氮(-190℃)④液氮冷却的丙烷(-19℃)。
液氮适用于组织化学,较安全。
缺点:组织块易发生龟裂。
(2)固定组织的制备为防止水解酶和其他物质的移位、弥散,常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用,低温,冷甲醛短时间固定(10分钟左右)固定,可显示琥珀酸脱氢酶。
电镜出现后,需要保存细胞的超微结构,以4%缓冲戊二醛(25%戊二醛16ml;0.1M二甲胂酸(pH7.)84ml;蔗糖8g)固定较好。
这些固定液主要用于水解酶,而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
(3)恒冷箱温度一般在冷冻后10分钟,到接近冷室温度时再切,一般组织在-15~-20℃切片最易成功。
每种组织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度,Pearse及Bancroft 的经验如下:组织刀温度组织温度恒冷箱温度肝-18 -10 -5肾-15 -8 -5皮肤-35 -10 -5脑-18 -5 -5固定组织一般高3-5度(4)抗卷板抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离,使切片平滑通过。
冷冻电镜样品制备技术研究
冷冻电镜样品制备技术研究冷冻电镜是一种非常重要的生物学、化学和材料学分析手段，利用其高分辨率的成像能力，可以研究生物分子的结构、微观材料的组成和晶体的结晶状态等。
而样品制备是冷冻电镜研究中的一项重要技术，样品质量的好坏直接影响到冷冻电镜的成像效果和信号质量，因此制备技术的研究非常重要。
一、样品制备原理冷冻电镜样品的制备基本上采用的是低温快速冷冻的方法，旨在使生物样品处于尽量接近生理状态的冻结状态下，以避免样品受到化学和物理损伤的影响。
在样品冷冻前，往往需要对其进行预处理，例如标记或染色，以便更好地观察样品中组成的分布和形态等。
在样品冷冻后，需要使用冷冻切片方式将样品切成纳米级厚度的薄片，以便在冷冻电镜中进行成像和分析。
二、样品制备的关键技术1. 冷冻速率控制实现样品的快速冷冻是样品制备的基本要求之一，关键在于如何控制样品的冷冻速率。
在样品冷冻过程中，如果冷却速度过慢或过快，都有可能对样品产生不利影响；过慢的冷冻会导致样品表面形成较大的冰晶，使样品损伤严重，不利于获得优质的冷冻电镜成像；而过快的冷冻则可能导致样品内部组织结构的不均匀冷冻，影响样品的结构真实性和准确性。
因此，控制样品的冷冻速率非常重要。
目前，学术界和工业界已经发展出了多种方法来控制冷冻速率，例如圆盘冷却法、对流纳米冷却法、液氮冷却法等。
2. 样品处理在样品冷冻前，往往需要进行化学标记、染色或脱溶等处理，以便更好地观察目标样品的特征和内部结构等。
但是，这些处理会对样品产生影响，甚至会对其造成破坏。
因此，在样品处理过程中，需要采用一些较为温和的方法，以保证样品的完整性和真实性。
3. 冷冻切片技术在完成样品的冷冻后，需要将其切成纳米级薄片，以便在冷冻电镜中进行成像和分析。
冷冻切片是样品制备中较为复杂的步骤之一，需要采用专业的设备和技术，以获得优质的样品切片。
目前，常见的冷冻切片技术有多刀切片、离心切片和冷切片法等。
三、研究现状和发展趋势样品制备技术是冷冻电镜研究的重要环节，其发展和研究始终得到学术界和工业界的广泛关注。
冰冻切片制备 实验步骤
冰冻切片制备实验步骤冰冻切片制备是一种常用的实验技术，用于制备生物样品的切片，以便进行显微镜观察和分析。
下面将按照实验步骤的顺序进行详细介绍。
1. 样品的准备选择合适的样品进行制备。
样品可以是细胞、组织或生物体的一部分。
根据实验的需要，样品可以是新鲜的或者固定的。
2. 样品的固定如果选择的样品是新鲜的，需要先进行固定以保持其形态和结构。
常用的固定剂有福尔马林、戊二醛等。
将样品放入固定剂中，根据样品的大小和种类，固定的时间可以从几分钟到几小时不等。
3. 样品的冰冻将固定后的样品进行冷冻以减少切片时的变形。
可以使用液氮或冰冻机将样品迅速冷冻至零下20摄氏度以下。
冷冻的时间要尽量短，避免冰晶的形成对样品造成损伤。
4. 切片仪的准备将切片仪调整到适当的工作状态。
切片仪的刀片需要保持锋利，切片盒需要清洁干净。
5. 样品的切片将冷冻的样品取出，迅速放入切片盒中。
使用切片仪将样品切片，切割的速度和厚度根据需要进行调整。
切片时要保持手稳定，避免切出的切片变形或损坏。
6. 切片的收集将切下的样品片收集到盛有PBS（磷酸盐缓冲液）的培养皿中。
这样可以避免切片的干燥和变形。
7. 样品的染色根据实验需要，可以对切片进行染色以便于观察。
常用的染色方法有荧光染色、组织学染色等。
染色后的切片需要进行洗涤以去除多余的染料。
8. 切片的保存将染色后的切片放入玻片盒中，用透明胶带密封。
存放在适当的温度和湿度条件下，避免切片的变形和腐败。
通过以上步骤，我们可以得到冰冻切片制备的样品，以供显微镜观察和分析。
冰冻切片制备技术可以用于各种生物学研究，如细胞生物学、组织学和病理学等领域。
它可以帮助我们观察样品的细节结构，了解其功能和病理变化，为科学研究和临床诊断提供重要的依据。
冰冻切片制备的主要步骤
冰冻切片制备的主要步骤冰冻切片制备是一种常用的生物学和医学实验技术，用于在冷冻状态下快速切割组织样本，并进行随后的病理学诊断或研究。
以下是冰冻切片制备的主要步骤：一、准备样本在进行冰冻切片制备之前，需要准备好待检测的组织样本。
这些样本可以来自各种来源，如手术切除、活检、尸检等。
样本应该尽快放入适当的冷冻介质中，如OCT包埋剂，以保持其冷冻状态。
二、冷冻将准备好的样本放入冷冻切片机中，通常是一个恒温的金属块。
这个金属块被冷却到低于-20℃的低温，确保样本快速冷冻。
在这个过程中，需要特别注意不要让冷冻过度或不足，因为这会影响切片的品质。
三、切片使用冷冻切片机将冷冻好的样本切成薄片。
切片的厚度通常在5-10微米之间，以确保切片能够清楚地显示组织的结构和特征。
这个过程需要熟练的技术员操作，以保证切片的完整性和均匀性。
四、固定刚切好的切片非常容易受到热和湿气的影响，因此需要迅速固定。
通常使用甲醇或乙醇作为固定剂，将切片固定在载玻片上。
这一步可以防止切片在接下来的步骤中滑落或移动。
五、染色固定好的切片需要进行染色以更好地显示其结构和特征。
最常用的染色方法是hematoxylin and eosin (H&E)染色。
这一步可以在染色机中完成，也可以手工操作。
染色完成后，切片会被冲洗干净并彻底干燥。
六、观察和诊断最后一步是将制备好的切片放在显微镜下观察，并进行病理学诊断。
此时，病理学家可以根据切片的特征对疾病进行分类和分级，或者对手术切缘进行评估。
以上就是冰冻切片制备的主要步骤。
需要注意的是，每个步骤都需要严格的操作规程和技术要求，以保证制备出的切片能够准确地反映组织的结构和特征。
冷冻电镜实验流程
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冷冻电镜流程范文
冷冻电镜流程范文冷冻电镜技术是一种高分辨率的电子显微镜技术，可用于研究生物学样品的结构和功能。
在冷冻电镜流程中，主要包括样品制备、样品固定、样品切片、样品观察和图像处理等步骤。
下面是关于冷冻电镜流程的详细介绍。
1.样品制备冷冻电镜技术通常应用于生物学样品的研究，因此样品的制备显得至关重要。
首先，需要将生物样品固定在一个适当的载体上，例如碳膜或铜网。
固定方法通常包括化学固定、冷冻固定和真空冷冻固定等。
然后，将样品浸泡在特定的保护剂中，以防止冷冻过程中的机械和化学破坏。
最后，将样品放置在液氮中冷冻，使其温度快速降低至液氮温度以下。
2.样品固定样品固定是一项重要的步骤，旨在保持样品的原始形态和结构。
其中最常用的固定方法是化学固定，利用交联剂（如戊二醛）固定样品的细胞膜和细胞骨架等结构。
另外，冷冻固定是一种常用的固定方法，通过迅速将样品温度降低至液氮温度以下，可以保持样品的冻结结构。
3.样品切片在冷冻电镜流程中，需要将样品切割成薄片以透视样品的内部结构。
切片最常用的方法是利用切片机或超微震荡刀切片。
切片机使用钻石刀将样品切割成薄片，厚度通常为50-100纳米。
超微震荡刀利用超声波的振荡作用将样品切割成非常薄的切片。
4.样品观察在冷冻电镜中，通常使用透射电子显微镜（TEM）进行样品观察。
将切片样品放置在透明的铜网上，并通过载物将切片转移到透射电子显微镜上。
在观察前，通常需要将切片样品染色，以提高对样品的对比度。
常用的染色剂包括重金属染色剂和胶状染料。
然后，将样品放置在TEM中，使用电子束照射样品并收集由样品传递的散射电子，从而获得样品的高分辨率图像。
5.图像处理获得图像后，需要使用图像处理软件对图像进行处理和分析。
图像处理的目的是提高图像的对比度、清晰度和解析度。
最常用的图像处理步骤包括去噪、平滑、增强和三维重建等。
图像处理的目标是获得高质量的图像，以便于分析和解释对样品的研究结果。
综上所述，冷冻电镜流程包括样品制备、样品固定、样品切片、样品观察和图像处理等步骤。
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冰冻切片的制备
一、冰冻切片技术的概述
（一）优点：
1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。
2．快速，用时短。
3．组织变化不大。
4．能很好保存脂肪，类脂等成分。
5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。
（二）缺点：
1．不容易做连续切片。
2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。
3．不容易制作较薄的切片。
4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。
（三）主要应用于：
1．用于有些水解酶的定位的组织化学方法以及免疫组织化学方法等。
2．用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染色时的切片。
3．用于临床手术的快速病理诊断。
二、冰冻切片机的使用及注意事项
（1）新鲜的组织制备
组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：①CO2气（－78℃）②丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（－80℃）③液氮（－190℃）④液氮冷却的丙烷（－19℃）。
液氮适用于组织化学，较安全。
缺点：组织块易发生龟裂。
（2）固定组织的制备
为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。
电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4％缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7．）84ml；蔗糖8g）固定较好。
这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
（3）恒冷箱温度
一般在冷冻后10分钟，到接近冷室温度时再切，一般组织在－15～－20℃切片最易成功。
每种组织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度，Pearse及Bancroft的经验如下：组织刀温度组织温度恒冷箱温度
肝-18 -10 -5
肾-15 -8 -5
皮肤-35 -10 -5
脑-18 -5 -5
固定组织一般高3-5度
（4）抗卷板
抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离，使切片平滑通过。
抗卷板略高于刀面的最高点。
可凭经验调整刀对组织的角度，一般新刀为20゜
（5）切片机
操作程序：先接通电源，调定恒冷箱温度，调整切片刀的角度，调定切片厚度，标本置载台致冷达所需温度后，将其安放在切片机推进器上。
即可切片。
恒冷箱视使用情况每周或每月清洁一次冰霜。
（6）切片刀新刀切片满意，旧刀用自动磨刀机磨刀较好。
如果切片刀与抗卷板的位置，角度合乎要求，又有一把锐利的刀，就能获得理想的切片。
三、冰冻干燥
原理
为冰冻组织保持高度真空，直到去除组织中的水分。
过程
小块组织骤冷→立即在真空干燥脱水（－30～－40℃）冰升华，水气去除，不会发生酶的弥散→材料干后，升到室温浸于石蜡或碳蜡包埋。
特点
能出色地保存组织的酶活性，还有助于保持组织的结构。
但仪器贵，需时长。
四、冰冻替代法
原理
低温下用液体脱水剂取代组织中的水分。
过程
组织块骤冷→组织内的水，在低温（－40℃～－70℃）液体脱水剂中被替代（醇、丙酮），同时起到固定作用→脱水组织渐恢复到室温，用石蜡包埋。
特点
①新鲜组织在24小时内制成切片
②可保存较多的酶活性
③经济、简单且有重复性，但对细胞器保存不佳，不能用于电镜
电镜标本的制备
一、概述
20世纪30年代（1935年）在德国发明并生产了第一批电子显微镜以来，应用日渐广泛，使组织学的研究上了一个新的台阶，开避了新纪元，从一般显微结构领域迈入了亚显微结构水平。
（一）透射电镜（transmission electron microscope，TEM）：是最广泛使用的一类电镜。
它的特点是电子束必须穿透样品，因此观察的样品必须很薄，约为50nm左右。
可观察细胞和组织的超薄切片，复型膜，负染样品等。
（二）扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）：主要特点是观察物体表面的立体微细结构。
其在医学上主要用于观察组织或细胞的表面或断面结构，扫描图像具有立体感，样品制备较简单，因此在医学上应用日渐增多。
二、标本的制备
（一）取材
1．原则：
快、准、轻、小、冷；1mm3
2．注意事项：
（1）防止组织挤压和过度伸展；
（2）使用锋利的刀，尽量减少对组织的机械性损伤；
（3）取材最好在冰块上，或同时放在固定液内操作；
（4）培养细胞的收集时，要将培养液离心后，取沉淀物漂洗固定。
（二）固定
1．常用固定操作的方法
（1）戊二醛-锇酸双重固定法
前固定：2%戊二醛
后固定：1%锇酸
（2）培养细胞固定法
培养细胞需要固定时，先弃去培养液，加入戊二醛固定液，在冰溶或4℃的温度下放置5~10分钟，再用刮板将细胞刮下，倒入离心管中离心弃上清，沿管壁缓缓加入预冷的戊二醛固定液15 ~30分钟，再吸去上清，经缓冲液清洗15分钟后，继用1%锇酸对样品作后固定30分钟。
2．注意事项
（1）理想的固定剂应能迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细胞内各种成分；能即刻将细胞杀死尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化；对细胞产生收缩及膨胀作用，不产生人工假象及变形。
（2）固定液的酸碱度必须与被固定组织的酸碱度基本一致，大多数动物组织酸碱度的平均值是7.4。
（3）缓冲液的选择要根据实验不同要求加以选择；磷酸盐缓冲液可以有效地控制固定液的酸碱度，并能促进样与铅盐、铀盐之间的反应，是动物组织的有效缓冲系统，但缺点是可抑制细胞内某些酶（如6磷酸葡萄糖脱氢酶）的反应。
（4）戊二醛固定后必须充分浸洗，才能转入锇酸固定。
（5）戊二醛固定液一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸钠缓冲液配制，不能用醋酸—巴比妥缓冲液，因此缓冲液可使戊二醛的醛基失效。
（三）脱水
1．脱水过程
脱水剂：乙醇或丙酮
彻底清洗样品
50%乙醇或丙酮10~15分钟
70%乙醇或丙酮10~15分钟
80%乙醇或丙酮10~15分钟
90%乙醇或丙酮10~15分钟
100%乙醇或丙酮10~15分钟
100%乙醇或丙酮30分钟
2．注意事项：
（1）脱水要彻底；
（2）如果当天完不成浸透、包埋操作时，应将样品停留在4℃70%乙醇或丙酮中过夜。
（3）脱水操作动作尽量要快，特别是100%脱水剂，更要注意样品块不要在空气中停留时间过长，否则会造成样品干燥。
（四）浸透和包埋
1．浸透包埋剂：Epon812环氧树脂包埋剂
A液：Epon812 10ml
DDSA十二烷基琥珀酸酐16ml
B液：Epon812 10ml
MNA六甲酸酐8.9ml
A液和B液按比例混合，B液比例越大，包埋块越硬（冬天1：4；夏天1：9），待上述二液混匀后再按1.5~2%的体积比，在充分搅拌中滴加DNP-30
2．过程
（1）脱水后的样品入丙酮、环氧丙烷等量混合液15min
（2）环氧丙烷Ⅰ15min
（3）环氧丙烷Ⅱ15min
（4）环氧丙烷、包埋剂等量混合液数小时
（5）纯包埋剂数小时
3．包埋
（1）定向包埋
（2）烘干包埋板
（3）37ºC ~45ºC恒温箱中24小时
（4）60ºC恒温箱24小时
（5）72ºC恒温箱24小时
4．注意事项
（1）浸透、包埋用注射器、吸管、烧杯、胶囊、牙签及其它器皿，均应在用前烘干，有能有任何水分。
（2）所用的药品均应注意防潮，药品应在干燥器中存放或在冰箱里保存。
（3）包埋时动作要轻巧，避免产生气泡影响切片。
（4）操作时皮肤勿接触包埋剂，以防引起皮炎。
（5）制好的包埋块应放于带盖的小瓶里，存放在干燥器中，以防止包埋块吸潮变软影响切片。
（五）半薄切片
包埋块的修整
切片刀的制备：玻璃刀，钻石刀
定位
（六）超薄切片
选择与清洗载网
制备支持膜
切片
捞片
（七）电子染色
1．电子染色剂
（1）醋酸铀：浓度为饱和液
醋酸铀2g
50~70%乙醇100ml
PH4.2
（2）铅盐类
硝酸铅Pb(NO3)2 1.33g
柠檬酸钠Na(C6H5O7)·2H2O 1.76g
蒸馏水30ml
将上试剂放入50ml容量瓶内，用力振荡30分钟，发生化学反应，结合为柠檬酸铅，溶液呈现为乳白色的柠檬酸铅混悬液，然后加入1N氢氧化钠8ml，使柠檬酸铅溶解，变成无色透明状，
最后再加蒸馏水至50ml，PH为12 2．过程：
（1）醋酸铀滴注染色30分钟（2）清洗3次
（3）柠檬酸铅滴注染色30分钟（4）自然干燥即可电镜观察。