荧光分光光度计使用

工作原理

荧光产生的原理

荧光的定义：某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的光。

荧光产生的原理：化学物质能从外界吸收并储存能量(如光能、化学能等)而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射(即发光)。

荧光化合物的两种特征光谱

1. 荧光激发光谱，就是通过测量荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，它反映了不同波长激发光引起荧光的相对效率。

2. 荧光发射光谱，如使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器后照射于检测器上，扫描发射单色器并检测各种波长下相应的荧光强度，然后通过记录仪记录荧光强度对发射波长的关系曲线，所得到的谱图称为荧光光谱。

物质的激发光谱和荧光发射光谱，可以用作该物质的定性分析。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。

荧光分析法的灵敏度一般较紫外分光光度法或比色法为高，浓度太大的溶液会有“自熄灭”作用，以及由于在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，故荧光分析法应在低浓度溶液中进行。

荧光发射的特点：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光;而一旦停止供能，发光(荧光)现象也随之在瞬间内消失。

溶液荧光光谱通常具有的特征：

(1) 斯托克斯位移：在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光的波长总是大于激发光的波长。

(2) 荧光发射光谱的形状与激发波长无关。

(3) 荧光发射光谱的形成与吸收光谱的形状有镜像关系

荧光的猝灭：荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光(特别是紫外光)的直接照射和与其他化合物的接触。

荧光效率：荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。

荧光效率=发射荧光的光量分子数(荧光强度)/吸收光的光量子数(激发光强度)

发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱(荧光光谱)，即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。

测量原理

稀溶液IF=2.303φFI0εc b,

其中，I0为激发光强度;If为荧光强度;

φf为荧光效率; b为液池厚度;

ε和c分别为发光物质的摩尔吸光系数和摩尔浓度。

技术指标：

波长扫描范围：220-900nm

波长精度：±1.5nm;

狭缝范围：0.15-20nm

信噪比：S/N比150以上(水拉曼峰测定，狭缝5nm)

最高扫描速度：5，500nm/min

操作规程

1. 开机

a. 确认所测试样液体或固体，选择相应的附件。

b. 先开启仪器主机电源，预热半小时后启动电脑程序RF-530XPC，仪器自检通过后，即可正常使用。

2. 测样

(1) spectrum模式

a. 在“Acquire Mode”中选择“Spectrum”模式。

·对于做荧光光谱的样品，“Configure”中“Parameters”的参数设置如下：

“Spectrum Type”中选择Emission;给定EX波长;给定EM的扫描范围(最大范围

220nm—900nm);设定扫描速度;扫描间隔;狭缝宽度，点击“OK”完成参数的设定。

·对于做激发光谱的样品，“Configure”中“Parameters”的参数设置如下：

“Spectrum Type”中选择Excitation;给定EM波长;给定EX的扫描范围(最大范围

220nm—900nm);设定扫描速度;扫描间隔;狭缝宽度，点击“OK”，完成参数的设定。

b. 在样品池中放入待测的溶液，点击“Start”，即可开始扫描。

c. 扫描结束后，系统提示保存文件。可在“Presentation”中选择“Graf” “Radar” “Both Axes Ctrl+R”来调整显示结果范围;在“Manipulate” 中选择“Peak Pick”来标出峰位，最后在“Channel”中进行通道设定。

d. 述操作步骤对固体样品同样适用。

(2) Quantitative模式

a. 在“Acquire Mode”中选择“Quantitative”模式。

b. “Configure”中“Parameters”的参数设置如下：

Method 选择“Multi Point Working Curve” ;“Order of Curve” 中选择“1st和“No” ;给定EX、EM波长;设定狭缝宽度，点击“OK”，完成参数的设定。

c. 在样品池中放入装有空白溶液的比色皿后执行“Auto Zero” 命令校零点。

d. 点击“Standard”模式，制作工作曲线。

e. 将样品池中的空白溶液换成一系列的已知浓度的样品标准溶液进行测量，执行“Read”命令，得到相应的荧光强度，系统根据测量值自动生成一条“荧光强度-浓度”曲线。

f. 在“Presentation” 中选择“Display Equation”，得到标准方程。将此工作曲线“Save”为扩展名为“.std”的文件。

g. 工作曲线制备完毕，即可进入未知样的测量，选择进入“Unknown”模式，将样品池中的已知浓度标准溶液换成待测样品溶液，执行“Read”命令，即可得到相应的荧光强度和相应的浓度。将此“Save”为扩展名为“.qnt”的文件。

(3) Time Course模式

a. 在“Acquire Mode”中选择“Time Course”模式。

b. “Configure”中“Parameters”的参数设置如下：

给定EX、EM波长;设定狭缝宽度;设定反应时间;读取速度;读取点数;

点击“OK”，完成参数的设定。

c. 在样品池中放入装有空白溶液的比色皿后执行“Auto Zero” 命令校零点。

d. 将样品池中的空白溶液换成待测溶液，点击“Start”，即可开始扫描。扫描结束后，即可得到荧光强度对时间的工作曲线。