高中生物 实验八动物组织和细胞中核酸的提取和测定

实验九动物组织和细胞中核酸的提取和测定

第一部分动物组织和细胞中DNA和RNA的提取

【实验目的】

学习从组织和细胞中提取DNA和RNA的方法

【实验原理】

1.从动物组织和细胞中提取DNA

DNA存在于细胞核中。提取DNA的方法首先需要温和裂解细胞及溶解DNA的技术，接着需采用化学和酶学方法，除去杂蛋白、RNA及其他的大分子。本实验在EDTA（螯合二价阳离子以抑制Dnase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞和组织，用去垢剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂抽提得以纯化，污染的RNA通过RNase消化清除。这个方法可产生十微克至数百微克的DNA，适用于标准琼脂糖凝胶上的Southern分析，可用作PCR 反应的模板，以及用于构建基因组DNA文库。

2.从动物组织和细胞中提取RNA

RNA存在于细胞质及核中，是一种极易降解的核酸分子。为了快速从细胞中分离完整的RNA，许多方法都用到了高浓度的强变性剂硫氰酸胍使细胞破裂。高浓度的硫氰酸胍还使细胞内的各种RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA，核DNA，蛋白质和细胞残片，通过酚，氯仿等有机溶剂处理，离心，使RNA最终与其它细胞组分分离开来。

【实验材料】

1.实验器材

研钵和研棒，匀浆机，橡胶刮棒，低温冷冻离心机，恒温水浴，宽口移液管，锤子，塑料袋，涡旋。

2.实验试剂

(1)裂解缓冲液：10mmol/L Tris-Cl (PH8.0)，0.1mol/L EDTA (PH8.0)，0.5%(m/V) SDS，20µg/mg无Dnase的胰RNase，裂解缓冲液的前三种成分可预先混合并于室温保存。RNase在用前适量加入。(2)溶液D(变性液)：4 mol/L 硫氰酸胍，25mmol/L 柠檬酸钠. 2H20，0.5%(m/V)月桂基肌酸钠，0.1mol/L β-巯基乙醇，将250g硫氰酸胍、0.75mol/L(PH7.0)柠檬酸钠17.6ml和26.4ml10%(m/V )月桂基肌酸钠溶于293 ml水中.加入搅拌子于磁力搅拌器上65℃混匀,直至完全溶解。室温贮存溶液D,每次使用前加入14.4 mol/L的β-巯基乙醇,每50ml溶液D加0.36ml。溶液D可在室温下避光保存数月。

(3)平衡酚：用0.5mol/L Tris-Cl (PH8.0)平衡的苯酚

(4)TBS：在800 ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl和3gTris碱、加入0.015g酚红并用HCl调节溶液的PH值至7.4,加水定容至1L,分装后在15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。保存于室温。

(5)PBS：在800 ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4, 用HCl调节溶液的PH值至7.4, 加水定容至1L, 在15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。保存于室温。

(6)TE（PH8.0）：10mmol/L Tris.Cl（PH8.0），1 mmol/LEDTA（PH8.0）

(7) 蛋白酶K（20mg/ml），10mol／L醋酸铵，2mol／L的醋酸钠(pH4.0)，0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）

(8)无水乙醇，70％乙醇，氯仿—异戊醇(49:1,V/V)，异丙醇，酚

(9) 液氮

【实验操作】

(一) 用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物组织和细胞中分离DNA

1.组织样品和培养细胞的裂解

（1）组织样品

①将lg新鲜切取的组织在液氮中速冻，并用液氮预冷的研钵研磨。

②液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有10倍体积裂解液的烧杯中，使其分散于裂

解液表面，后振摇烧杯使粉末浸没。

③将悬液转移至50ml三角瓶中，并于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。

（2）培养细胞

①单层培养细胞

i.从孵箱中取出长满单层细胞的培养皿，迅速吸去培养液，用冰冷的TBS洗2次，

加入1ml新鲜的冰冷的TBS。

ii.用橡胶刮棒将细胞刮入1ml TBS中，用吸管将细胞悬液转移到冰上的离心管中。用

0.5 ml冰冷的TBS冲洗培养皿，后并入离心管的细胞悬液。

iii.于4℃3000r/min离心10min以收集细胞。

iv.将细胞重悬于5倍~10倍体积的冰冷TBS中并再度离心。

v.用1 ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。

vi.每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。

②悬浮培养的细胞

i.将细胞转移至离心管，于4℃3000r/min离心10min以收集细胞，吸去上清。

ii.用1倍体积冰冷的TBS重悬细胞并再度离心，吸去上清，小心地再次重悬细胞于冰冷的TBS中，离心收集细胞。

iii.去上清，用1ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。

iv.每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。

2.将裂解液转移至离心管中，裂解液不能超过1/3体积。

3.加入蛋白酶K（20mg/ml）至终浓度100µg/ml。用一灭菌玻璃棒温和地将酶混入细胞裂解液

中。

4.将细胞裂解液置于50℃水浴中保温3 h，并不时振摇。

5.将溶液冷却至室温，加入等体积的平衡酚，将离心管置于涡旋器上,使离心管缓慢颠转10min

以温和地混合两相。

6.室温下，6500r/min离心15 min以分离两相。

7.用宽口移液管将黏滞的水相转移至另一离心管。

8.苯酚抽提两次，收集水相。

9.加入0.2倍体积10mol/L醋酸铵及2倍体积无水乙醇，旋转离心管直至溶液彻底混匀为止。

10.DNA随即形成沉淀，在室温下6500r/min离心5 min，收集沉淀。

11.用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，按步骤1.10.离心收集DNA。

12.尽可能吸去残余乙醇,于室温下，将DNA沉淀置于敞开的管内，直至乙醇挥发殆尽。

13.按每0.1m1细胞(步骤1.1)加入1ml TE溶解DNA，将DNA溶液储存于4℃。

14.用紫外分光光度法或二苯胺显色法检测DNA含量。详见本实验第二部分。

(二)酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取法纯化组织和细胞中的RNA

1．组织样品和培养细胞的处理

(1) 组织样品