反向层析技术

反相介质的选择
• 根据分离要求
– 分辨率－介质的选择性（基质、配基种类）和柱效（介质粒径和 层析柱的填充） – 纯化规模－流速性能和结合容量（粒径） – 流动相条件－介质的稳定性（基质）
• 样品组分的分子量
– 结合容量－粒径和孔径
反相介质的选择
• 样品组分的疏水性
– 对样品中目标组分的疏水性强弱有个大致评估：疏水性弱的溶质 ，如氨基酸、寡聚核苷酸等，选用疏水性强的配基，如C18（十八 烷基）；疏水性较强的溶质，选用疏水性较弱的配基，如C8（辛 基）以下碳链的配基
5.2 流动相的选择和准备
• 反相层析多数在低pH条件下运行，流动相的pH通过添加 一定浓度的酸来调节； • 往流动相中添加离子对试剂可以改变溶质的保留值和选择 性，获得较好的分离效果； • 对于带正电荷的溶质应选择带负电荷的离子对试剂，如三 氟乙酸等，对于带负电荷的溶质则应选用带正电荷的离子 对试剂，如季铵盐等 • 准备流动相时，所用到的各种试剂都应当是最高纯度级别 的，所用的水也应是超纯水，添加了固体的流动相应当用 0.22μm 的滤膜过滤
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原理
120
70
• 起始阶段： 用具有合适pH、pI和极性的流动相A平衡反相层析 50 柱 30 • 吸附样品：加样至层析柱，洗去未结合的溶质 • 开始解吸：通过调节流动相极性等方式将反相介质上吸附的溶 2004 2005 2006 2007 质顺序解吸 • 完全解吸： 移除前一步未解吸的物质 Chart Title in here • 再生：介质从100%流动相B重新过渡到流动相A
50 30
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原理
亲硅醇基效应 • 一定条件下硅胶表面残余的硅醇基能与溶质发生相互作用 120 ，包括：静电作用和氢键作用，从而对溶质的保留行为起 决定作用; • 亲硅醇基效应常导致溶质保留值重复性差，洗脱峰脱尾等 70 不良层析行为 50 • 控制流动相pH，硅胶表面均匀覆盖非极性配基，屏蔽残 30 余硅醇基，可基本排除亲硅醇基效应的影响; • 新型反相层析介质聚苯乙烯等高分子聚合材料的开发可根 2004 2005 2006 2007 本消除亲硅醇基效应的影响。
LOGO 层析技术
反向层析和疏水层析
反相层析
概述
• 反相层析法的建立追述到 1950年，Howard和Martin用正辛烷 120 作为固定相，水作为流动相进行石蜡油的液-液层析分离， 并且把这种方法命名为反相层析
70
• 所谓“正相”或“反相”，主要是指固定相和流动相的相对 30 极性大小，反相层析因与传统分配层析刚好相反而得名，其 固定相非极性强而流动相极性相对较高，样品中组分被洗脱 的顺序是极性较高的组分先流出，极性较低的后被洗脱
5.2 流动相的选择和准备
• 生物分子RPC所用流动相常包含一种缓冲组分，一种修饰 剂，有时还含有一种离子对试剂 • 乙腈和甲醇是最常用的，条件摸索阶段以其中一种作为修 饰剂，溶质在固定相上吸附较为牢固时，可考虑更换洗脱 能力较强的修饰剂如异丙醇等 • 溶质分子，特别是蛋白质等生物大分子在所用溶剂中的稳 定性是须考虑的因素 • 分离样品性质不明的情况下，一般流动相A为水相，不含 修饰剂，而流动相B为100%有机相
5.3 样品的准备和加样操作
• 理想情况下应将样品溶于流动相A后加样，如样品在流动 相A中溶解不好，可考虑添加有机酸、盐类等试剂来增加 样品的溶解性，液体样品体积较小时可直接加样； • 样品在加样前应当通过10000 g离心10 min或用0.22μm微孔 滤膜过滤除去任何可能存在的颗粒物；
50
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原理
• 疏溶剂理论（solvophobic theory） 反相层析机理普遍被接受的是Horvath于1976年提出的疏 120 溶剂理论，假设反相层析介质是表面均匀密集的覆盖着非 极性配基的颗粒，溶质分子由于受到极性流动相的斥力而 以其疏水部分结合至固定相的非极性配基上，除此之外溶 70 质与固定相之间不存在其他任何相互作用
• 样品组分的种类
– 生物大分子虽然大多是亲水性，但稳定性较差，建议采用配基较 短（C8以下）的介质
层析柱的准备
一般过程： • 以低速或中等流速用3CV的流动相B清洗层析柱 • 以同样的流速在2~3CV内运行从100%流动相B到100%流动 相A的线性梯度 • 用至少5CV的流动相A平衡层析柱，直至所有信号达到稳定
反相层析技术
• • • • • • 反相介质的选择 流动相的选择和准备 120 样品的准备和加样操作 洗脱模式的选择和层析条件控制 70 样品的检测和收集 50 层析柱的再生、清洗和贮存
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Leabharlann Baidu
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反相介质的选择
层析介质的选择 选择依据： • 根据分离要求，包括规模和流动相条件 • 样品组分的分子量和尺寸 • 样品组分的疏水性 • 样品组分的种类
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Si
Si Si
OH
O
反相层析介质
配基与基质的偶联
• 用氯化三甲基硅烷或氯化三乙基硅烷封阻硅胶表面残留的 120 硅醇基 • 配基较大时，由于空间位阻效应，导致亲硅醇基效应存在
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反相层析介质
介质的构成 • 基质：硅胶、聚苯乙烯等 120 • 配基：正烷烃基团（n-烷基），常用的有辛基（C-8）和 十八烷基（C-18），其他还包括丙基、丁基、丙基苯基、 二苯基等 70
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反相层析介质
硅胶 120 • 优点：机械强度高，能承受高压、高流速，理 化稳定性好，多孔性结构 • 缺点：高pH 条件下会溶解，并且会产生负电荷 70 ，对分离造成不良影响，只能在酸性条件下使 50 用 聚苯乙烯 •2004 在强酸强碱性条件下稳定性好 2005 2006 2007 ，不产生亲硅醇基效应