生物测定法

生物测定法

一．卵泡刺激素（FSH）生物检定法——幼大鼠卵巢增重法

1.实验材料及用具

1.1天平精度0.01mg 供试品称量用

精度0.1 mg 卵巢称重用

精度0. 1g 大鼠称重用

1.2实验用具注射器（1ml，精度0.01ml），吸管、移液管、烧杯、有塞玻璃瓶、玻璃棒、量筒、滤纸。

1.3手术用器械手术板、手术剪、直镊、眼科剪、眼科直镊、眼科弯镊。

1.4试剂氯化钠、牛血清白蛋白、氢氧化钠、绒促性素（HCG）。

2.溶液配制

2.1生理盐水称取氯化钠适量，加水配成0.9%的溶液。

2.2氢氧化钠溶液称取氢氧化钠适量，加水配成1mol/L氢氧化钠溶液。

2.3牛血清白蛋白生理盐水称取牛血清白蛋白适量，加入到生理盐水中，配成1mg/ml的牛血清白蛋白溶液，并用1mol/L氢氧化钠溶液调节值至7.2±0.2。

2.4溶媒称取已知效价的HCG（粉末原料或粉针均可）加入到牛血请白蛋白生理盐水种，混匀，配成20u/ml的溶液。

2.5标准品溶液

2.5.1取尿促性素标准品，放置至室温。割开安瓿（注意勿使内容物损失）立即用溶媒将内容物洗出按FSH的标示效价配成10u/ml或20u/ml标准品溶液，亦可直接配成相当于高剂量d s3浓度的溶液。

2.6标准品溶液的稀释

2.6.1根均动物品系、来源、季节按中国药典附录卵泡刺激素生物鉴定法的要求，选择标准品高、中、低3组剂量。一般高剂量为2～4u/ml，剂距r不得大于1：0.5。

2.6.2分别精密量取10u/ml或20u/ml标准品溶液适量，各精密加入一定量溶媒，配制成高、中、低三组标准品稀释液。

2.6.3稀释液至4～8℃保存，供3日内使用。

2.7供试品溶液

2.7.1按供试品FSH的标示效价或估计效价，同标准品溶液的配制。

2.7.1.1粉末放置至室温，迅速精密称取适量。将称得的毫克数，乘以标示单位数或估计效价，得总单位数。用溶媒配成10u/ml 或20u/ml的供试品溶液，亦可直接配成相当于高剂量d T3浓度的溶液。

2.7.1.2注射用粉针按标准品溶液配制方法操作，供试品溶液的稀释同标准品溶液的稀释、保存、使用。

3.实验动物同一来源、品系、出生19～23日，体重36～50g 健康的雌幼大鼠，一次实验所用动物出生日期相差不得超过3日，体重相差不得超过10g。

4.检定法

4.1准备鼠盒，标明组别。

4.2实验当日按体重随机分组，每组不得少于8只动物，照常供给饲料和饮水，鼠盒应放置在通风、干燥、温度均匀的动物架上。

4.3将配好的标准品和供试品的稀释液在注射前，取出放置至室温。

4.4按组别分别给以标准品或供试品3种浓度稀释液，每鼠0.5ml，每天1次，连续3天，每天应安排在相同的时间内注射，或3次注射的间隔时间（约22小时）应相同。注射后将稀释液放回4～8℃保存。

4.5皮下注射勿使药液溢出，每次注射要调换部位，如第一次给药自一侧背部皮下进针，第二、第三次在另一侧或中央进针，将药液注入不同部位。

4.6最后一次注射后24小时，处死大鼠。

4.6.1按给药次序用适宜方法处死大鼠称体重，记录。

4.6.2将已死亡的大鼠仰卧固定手术板上，剪开腹肌，推开肠管暴露卵巢。，将二侧卵巢剪下取出，把卵巢置于用生理盐水湿润的滤纸上，剥离附着的脂肪组织，并去除输卵管，用滤纸片吸去附着的水分，立即称重，并记录在与体重相对应的栏中。

5.实验结果计算

5.1以卵巢重（mg）为反应值（y）按中国药典附录生物检定统计法列表的格式整理。

5.2按量反应平行线测定（3·3）法或（3·3·3）法随机设计处理结果。

5.2.1进行可靠性测验，实验结果成立者，进行以下计算。

5.2.2计算M、R、P T、S M 、FL 、FL%。

以上计算也可编制程序，用计算机计算。

5.3实验结果中出现的特大、特小等特异反应值，按中国药典规定判断其是否可以剔除，个别剂量组缺失的数据，如符合该附录要求，按所规定的方法补足。

6.结果判断

6.1FSH（3·3）或（3·3·3）法的可靠性测验应为剂间、回归变异非常显著，偏离平行、二次曲线、反向二次曲线不显著，否则实验结果不成立，对实验结果不成立者应做以下检查：

6.1.1检查实验操作包括溶液配制、注射、实验动物的饲养等是否符合本法的实验要求。

6.1.2剂间、回归不显著，S、T或U的反应不在对数剂量—反应直线范围内，应根据反应结果重新调整剂量复试。

6.2可靠性测验通过，实验结果成立。如试品间变异显著时，可根据S和T各剂量组的反应情况调整剂量以减小实验误差。

6.2.1 T或U各剂量组反应值明显低于高于S剂量组时，可调低T 或U的剂量，或提高T或U的估计效价。

6.2.2 T或U各剂量组反应值明显低于低于S剂量组时，可调高T 或U的剂量，或降低T或U的估计效价。

6.3实验误差（FL%）的判断按药典规定，FL%超过者，可做以下处理：

6.3.1检查动物来源、实验操作、对动物的照顾等是否符合本法的实验要求。

6.3.2重复实验

6.3.3按规定将几次实验结果合并计算，求得合并计算的效价及实验误差，应符合规定。

二．黄体生成素（LH）生物检定法——幼大鼠精囊增重法

1.实验材料及用具

1.1天平精度0.01mg 供试品称量用

精度0.1 mg 精囊称重用

精度0. 1g 大鼠称重用

1.2实验用具注射器（1ml，精度0.01ml），吸管、移液管、烧杯、有塞玻璃瓶、玻璃棒、量筒、滤纸。

1.3手术用器械手术板、手术剪、直镊、眼科剪眼科直镊、眼科弯镊。

1.4试剂氯化钠、牛血清白蛋白、氢氧化钠。

2.溶液配制

2.1生理盐水称取氯化钠适量，加水配成0.9%的溶液。

2.2氢氧化钠溶液称取氢氧化钠适量，加水配成1mol/L氢氧化钠溶液。

2.3溶媒的配制称取牛血清白蛋白适量，加入到生理盐水中，配成1mg/ml的牛血清白蛋白溶液，并用1mol/L氢氧化钠溶液调节值至7.2±0.2。