基因工程重组蛋白的分离纯化 放映
重组蛋白质的表达与纯化
重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。
这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。
下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。
一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。
常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。
不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。
例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。
2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。
常用的表达载体有质粒、病毒载体等。
质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。
3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。
转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。
转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。
4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。
常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。
二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。
细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。
分离方法包括离心、电泳、柱层析等。
2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。
常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。
3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。
例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。
这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。
三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。
例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。
使用基因工程技术进行蛋白质工程的基本步骤
使用基因工程技术进行蛋白质工程的基本步骤蛋白质工程是一种广泛应用于生物技术领域的技术手段，通过对蛋白质的结构和功能进行改造和优化，从而实现对蛋白质的改良。
基因工程技术在蛋白质工程中发挥着重要的作用，为我们提供了一种有效的手段来进行蛋白质的改造。
基因工程技术通常依赖于重组DNA技术，通过将特定的基因片段插入到宿主细胞的染色体中，使得宿主细胞能够产生目标蛋白质。
下面将介绍使用基因工程技术进行蛋白质工程的基本步骤。
第一步是蛋白质工程的目标确定。
在蛋白质工程中，我们需要明确要改造的目标蛋白质。
这包括选择合适的蛋白质基因、确定改造的目的以及预期的效果。
目标蛋白质可以是从天然来源中获取的，也可以是人工设计的。
第二步是基因克隆。
基因工程技术中的基因克隆是一项关键步骤，它涉及到从天然来源中提取目标基因，并将其插入到适当的载体中。
常用的载体包括质粒和病毒。
一旦目标基因被插入载体中，它们可以被引入宿主细胞。
第三步是转染和表达。
转染是将重组DNA传递到宿主细胞中的过程，常用的方法包括电穿孔、化学转化和病毒介导的转染。
一旦目标基因被成功转入宿主细胞，我们可以通过诱导宿主细胞表达目标蛋白质。
第四步是蛋白质纯化和分析。
一旦目标蛋白质被宿主细胞表达，我们需要对其进行纯化和分析。
蛋白质纯化是将目标蛋白质从其他细胞组分中提取出来的过程，常用的方法包括柱层析、电泳和过滤。
纯化后，目标蛋白质可以通过质谱、动态光散射和圆二色光谱等方法进行分析。
第五步是蛋白质改造和优化。
蛋白质工程的关键目标是改造和优化蛋白质的结构和功能。
这可以通过点突变、插入、缺失或循环重排等方法来实现。
改造后的蛋白质可以进一步进行表达和分析。
最后一步是功能验证和应用。
改造后的蛋白质需要进行进一步的功能验证和应用。
这包括通过生物学活性测定、结构分析和生物学特性评估等方法来验证改造后蛋白质的功能以及适用性。
总的来说，使用基因工程技术进行蛋白质工程的基本步骤包括目标确定、基因克隆、转染和表达、蛋白质纯化和分析、蛋白质改造和优化，以及功能验证和应用。
重组蛋白实验报告
一、实验目的本实验旨在通过基因工程手段，构建表达重组蛋白的载体，并在宿主细胞中进行表达，随后对表达的重组蛋白进行纯化，以获得高纯度的目标蛋白。
二、实验材料1. 实验试剂：- pET-28a载体- 目的基因片段- restriction enzymes (EcoRI, BamHI)- T4 DNA连接酶- DNA聚合酶- 限制性内切酶缓冲液- DNA分子量标准- 质粒提取试剂盒- 诱导剂 (IPTG)- 细胞培养试剂（DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等）- 纯化柱（Ni柱）2. 实验仪器：- PCR仪- 紫外分光光度计- 凝胶电泳仪- Western Blot系统- 离心机- 流式细胞仪三、实验方法1. 基因克隆：- 使用PCR技术扩增目的基因片段，并使用EcoRI和BamHI进行酶切。
- 将酶切后的目的基因片段与pET-28a载体连接，并转化大肠杆菌感受态细胞。
- 对转化后的细胞进行PCR检测，筛选出含有目的基因的阳性克隆。
2. 重组蛋白表达：- 将阳性克隆接种于含抗生素的培养基中，培养至对数生长期。
- 加入IPTG诱导剂，调节IPTG浓度至0.1 mM，诱导表达重组蛋白。
- 收集细胞裂解物，进行SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达情况。
3. 重组蛋白纯化：- 使用Ni柱对细胞裂解物进行亲和纯化。
- 通过梯度洗脱，收集含有重组蛋白的洗脱液。
- 使用Western Blot检测纯化蛋白的纯度。
4. 重组蛋白活性检测：- 使用流式细胞仪检测重组蛋白的活性，以验证其功能。
四、实验结果1. 基因克隆：- 成功构建了含有目的基因的重组质粒，经PCR和酶切验证无误。
2. 重组蛋白表达：- 在IPTG诱导下，成功表达出重组蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白条带清晰。
3. 重组蛋白纯化：- 使用Ni柱纯化后，重组蛋白的纯度达到90%以上。
4. 重组蛋白活性检测：- 通过流式细胞仪检测，重组蛋白具有良好的活性。
3种进行基因工程表达目的蛋白质的分离纯化方法
3种进行基因工程表达目的蛋白质的分离纯化方法在基因工程研究中，蛋白质分离纯化是非常重要的一环。
下面将介绍三种常用的基因工程表达目的蛋白质分离纯化方法。
1. 亲和层析法：亲和层析法是一种常用的蛋白质纯化方法，基于特定配体与目标蛋白质之间的选择性结合。
通常，可以在目标蛋白质中引入一个标签序列，如融合标签或标签标记，使其与固定在纯化层析柱上的配体相互作用。
配体可以是金属离子、抗体、亲和剂或其他具有与目标蛋白质选择性相互作用的分子。
利用这种亲和层析柱进行分离纯化时，可以通过洗脱缓冲液中高浓度的竞争性配体或特定的环境条件来实现目标蛋白质的高效纯化。
2. 凝胶电泳法：凝胶电泳法是一种常用的蛋白质分离技术，根据蛋白质在电场中的迁移速率差异进行分离纯化。
通常，首先将表达目的蛋白质从细胞裂解物或培养基中提取出来，并用浓缩技术进行初步富集。
然后，将蛋白质样品加载到凝胶（如SDS-PAGE凝胶）中，通过应用电场分离蛋白质。
根据蛋白质的大小和电荷来进行分离，并用染色或质谱等方法进行检测和分析。
3. 逆流层析法：逆流层析法是一种有效的分离纯化方法，根据蛋白质在逆流梯度中的亲和性差异进行分离。
该方法可通过将纯化柱分为若干区域，每个区域都包含不同浓度的缓冲液，从而形成逆流梯度。
蛋白质溶液经过逆流层析柱时，蛋白质会在不同条件下与纯化柱表面相互作用，并在梯度中发生多次吸附和洗脱过程。
通过逆流层析的多次循环，可以逐步富集并纯化目标蛋白质。
综上所述，亲和层析法、凝胶电泳法和逆流层析法是基因工程表达目的蛋白质常用的分离纯化方法。
这些方法各具优势，可以根据目标蛋白质的性质和实验要求选择适合的方法，以获得高纯度的表达目的蛋白质。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
重组胶原蛋白纯化内容介绍
重组胶原蛋白纯化内容介绍
重组胶原蛋白的纯化主要包括以下步骤：
1. 发酵：通过基因工程技术将编码所需胶原蛋白的基因克隆进入适当的宿主细胞中，在培养基中进行发酵。
2. 细胞破碎：发酵完成后，对细胞进行破碎，使细胞壁破裂，释放出细胞内的胶原蛋白。
3. 初步分离：将破碎后的细胞和培养基中的其他成分进行初步分离，常用的方法有离心、过滤等。
4. 纯化：采用各种纯化技术，如凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等，将胶原蛋白与其他杂质进行分离。
5. 浓缩：对纯化后的胶原蛋白进行浓缩，使其浓度更高。
6. 干燥：采用真空干燥或冷冻干燥等方法，将胶原蛋白从液态变为固态，便于保存和运输。
在纯化过程中，需要注意保持胶原蛋白的生物活性和天然结构，避免对其造成破坏。
同时，还需要对胶原蛋白进行质量检测，确保其纯度和稳定性符合要求。
重组蛋白转染实验步骤
重组蛋白转染实验步骤
重组蛋白转染实验的步骤包括以下几个部分：
1.重组蛋白的表达和纯化：首先，通过基因工程技术将目的基因克
隆到表达载体中，并在适当的宿主细胞中进行表达。
表达出的重组蛋白需要进行纯化，通常采用亲和层析、离子交换层析等方法进行分离纯化。
2.重组蛋白的转染：将纯化后的重组蛋白导入到细胞中，常用的转
染方法包括磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法等。
转染时需要优化转染条件，如蛋白质浓度、转染时间、转染温度等，以提高转染效率和细胞存活率。
3.细胞培养和观察：将转染后的细胞放置在适当的培养条件下进行
培养，观察细胞的生长和形态变化。
可以通过荧光显微镜、免疫荧光等技术检测重组蛋白在细胞内的表达和定位。
4.数据分析：对实验数据进行统计分析，比较不同处理组之间的差
异，并评估重组蛋白对细胞生长、凋亡等生物学过程的影响。
需要注意的是，重组蛋白转染实验需要遵循相关的实验室安全规定，如穿戴防护服、手套等个人防护措施，以避免实验操作过程中可能产生的危险。
同时，实验前需要进行充分的文献调研和实验设计，确保实验的科学性和可行性。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
大肠杆菌中重组GNA蛋白的分离纯化_cropped
mar) 质粒,用无血清和无双抗的DME M 稀释至100μl ;另一支离心管加入10μl Lipofectamine R eag ent (脂质体) ,用无血清和无双抗的DME M 稀释至100μl 。
(2) 将上述DNA 稀释液和lipofectamine 稀释液混合, 室温下放臵40min ,使DNA 和脂质体作用,形成DNA - 脂质体复合物。
(3) 在上述DNA - 脂质体复合物转染液中加入800μl 无血清和无双抗的DMEM ,轻轻混合,将其覆盖在用无血清和无双抗的DME M 洗过的S H - SY5 Y细胞上,将6 孔板臵于37 ℃、5 %C O2 条件下培养4 - 6h 。
(4) 移去原来的转染液, 换新的生长培养基继续培养, 分别于转染后48h 、72h 和96h 在荧光显微镜下检查绿色荧光蛋白的表达情况并拍照。
转染方式如图1 。
2 结果转染后48h 、72h 和96h 在荧光显微镜下观察发现,转染过的细胞均有荧光出现。
在接种细胞密度为3. 0 ×105 cellsΠml 时,绿色荧光的表达比细胞密度为 3. 0 ×106 cellsΠml 时绿色荧光的表达要高,转染72h 的表达量高于转染48h 的表达,但与转染96h 的表达没有明显差别。
而且,在同样的接种密度及转染时间下转染p g fpΠmar 细胞的G FP 的表达要比转染pcmvΠg fp 的细胞表达高。
没有转染的细胞(对照组) 则不表达。
如图2 、3 、4 、5 、6 。
3 讨论自1984 年Mirkov itch 等在研究果蝇组蛋白基因结构时发现MAR 以来的10 年,人们已克隆和分析了多种生物许多基因的MAR 序列,如人的β- 干扰素基因、载脂蛋白B 基因、鸡的溶菌酶基因、卵清蛋白基因和球蛋白基因,兔的免疫球蛋白K 轻链基因、果蝇热休克基因等序列。
鸡α-珠蛋白基因5’端MAR 长1737b p ,含多种转录因子结合位点及大量的A - b ox 和T -b ox ,这些结构均利于基质与MAR 的结合。
基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析
基因工程的下游技术是实现基因功能研究和基因产品开发的关键环节，对于生 命科学研究、生物医药、农业、工业等领域具有重要意义。
基因工程下游技术的分类与流程
01
02
03
04
05
分类
1. 目的基因的克 2. 重组载体转化 3. 表达产物的分 4. 表达产物的分
隆和…
宿主…
离和…
析
基因工程下游技术主要包 括重组蛋白的表达、纯化 和分析等技术。
根据宿主细胞的偏好性， 对重组蛋白基因的密码子 进行优化，以提高重组蛋 白的表达水平。
载体优化
通过改造载体，增加重组 蛋白的表达量和稳定性， 如使用分泌型载体、融合 标签等。
培养条件优化
通过调整培养基成分、温 度、pH等培养条件，提高 重组蛋白的表达水平。
03 重组蛋白的纯化
重组蛋白的分离与纯化方法
详细描述
纯化是重组蛋白制备的关键步骤，通常采用多种分离纯化技术，如离心、过滤、沉淀、离子交换、亲和层析等， 以去除杂质并获得高纯度的目的蛋白。
案例二：重组蛋白的结构与功能分析
• 总结词：重组蛋白的结构与功能分析是了解蛋白性质和功能的重要手段，通过 X射线晶体学、核磁共振等技术，可以解析蛋白质的三维结构，进一步揭示其 生物学功能。
重组蛋白纯化的优化策略
选择合适的亲和配基
针对目的蛋白的特性选择特异性结合的配基，提高亲和 色谱的纯度。
结合多种分离方法
综合运用多种分离技术，如凝胶过滤色谱和反相色谱等 ，提高目的蛋白的纯度和回收率。
ABCD
优化离子交换色谱条件
通过调整离子强度、pH等参数，提高分辨率和纯度。
优化缓冲液和添加剂
选择合适的缓冲液和添加剂，如稳定剂、还原剂等，保 持目的蛋白的稳定性和活性。
重组蛋白药物制备上游技术
重组蛋白药物制备上游技术
重组蛋白药物制备上游技术包括细胞培养、基因表达、分离纯化等多个步骤。
以下是一些常见的上游技术：
1. 细胞培养：将重组蛋白表达在细胞中，通过培养细胞来获得大量的重组蛋白。
常用的细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、中国仓鼠睾丸细胞(CHO-K1)、人类293细胞(HEK293)等。
2. 基因表达：通过基因工程技术将目的基因导入到合适的细胞系中，使其产生相应的重组蛋白。
常用的基因表达系统包括酵母表达系统、大肠杆菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。
3. 分离纯化：将产生的重组蛋白从细胞培养液中分离纯化出来。
常用的分离纯化方法包括凝胶过滤、离子交换、疏水相互作用、亲和色谱等。
4. 制剂配方：根据重组蛋白的性质和用途，选择合适的配方和添加剂，制备成适合临床应用的药物制剂。
5. 质量控制：对重组蛋白药物进行全面的质量控制，包括蛋白质含量、纯度、分子量、电荷、稳定性等方面的检测，确保药物的安全性和有效性。
这些上游技术相互作用，共同决定了重组蛋白药物的质量
和产量。
随着技术的不断进步，重组蛋白药物的制备工艺还在不断优化和改进。
基因工程制药名词解释
基因工程制药名词解释基因工程制药是指利用基因工程技术生产药物的过程。
以下是基因工程制药常见名词的解释：1. 基因工程：基因工程是一种利用生物技术改变生物体遗传物质的方法。
通过人为选择和转移与特定功能相关的基因，可以改良生物体的性状或让其产生特定的产物。
2. 表达载体：表达载体是指一种DNA分子，用于传递外源基因到宿主细胞中，并使外源基因能够表达出目标蛋白质。
表达载体通常包括启动子、转录终止信号、选择性标记基因等元素。
3. 重组蛋白质：重组蛋白质是通过基因工程技术在外源表达系统中合成的蛋白质。
这些蛋白质通常是具有特定功能或药理学活性的，例如抗体、生长因子和酶等。
4. 重组DNA技术：重组DNA技术是指将不同来源的DNA片段组装到一起，形成新的DNA序列。
这项技术是进行基因工程研究和制药生产的关键步骤之一。
5. 基因转导：基因转导是将外源基因转移到宿主细胞中的过程。
通常通过病毒载体或非病毒载体传递外源基因到宿主细胞中，从而使宿主细胞表达目标蛋白质。
6. 选择标记基因：选择标记基因是用于筛选宿主细胞是否成功转导外源基因的标志性基因。
常见的选择标记基因包括抗生素抗性基因或含有发光标记的基因。
7. 纯化：纯化是将合成的重组蛋白质从杂质中分离出来的过程。
常见的纯化方法包括亲和纯化、离子交换层析和凝胶过滤。
8. 质量控制：质量控制是对基因工程制药产品的开发、生产和分析过程进行监控，以确保产品的质量符合国际质量标准。
质量控制包括产品的物理、化学和生物学测试等。
9. 免疫学制剂：免疫学制剂是一种通过基因工程技术生产的用于治疗疾病的药物。
免疫学制剂包括疫苗、单克隆抗体等，可通过调节和加强免疫系统来预防和治疗疾病。
10. 基因治疗：基因治疗是一种利用基因工程技术修复或替代患者缺陷基因的治疗方法。
通过将正常的基因导入患者体内，可修复或恢复患者体内缺少或异常的基因功能，从而治疗疾病。
基因工程目的蛋白的分离、纯化
1. 简述从基因工程菌发酵液中分离纯化目标蛋白的 主要步骤。
2.细胞破碎的方法有哪些？ 3.简述从细胞初提物中分离纯化目标蛋白的基本原理 和主要方法。
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--
+- -
+ +
-+ -+
++-++++-+++-++-++++++-+-+++
（2）电泳:纯度分析、分子质量测定、分离纯化
样品胶 浓缩胶 分离胶
普通电泳的胶体
b
制备型电泳的胶体
6 功能专一性不同
（1）亲和层析
抗体与抗原、受体与激素、 酶与底物、或抑制剂、凝集素 与糖类、染料与蛋白质、核酸 与蛋白等。
蛋白质
低 pH
高
2 形状和大小不同
H2O
Protein can be separated from small molecules by dialysis through a semipermeable membrane(半透膜) which has pores that allow small molecules to pass through but not proteins.
重组蛋白的提取纯化原理
重组蛋白的提取纯化原理重组蛋白是指通过基因工程技术将外源基因导入到宿主细胞中，使其表达出目标蛋白。
重组蛋白具有广泛的应用价值，如药物研发、生物制药、农业生产等领域。
然而，重组蛋白的提取纯化是制约其应用的关键环节之一。
本文将从不同的角度介绍重组蛋白的提取纯化原理。
一、基于物理性质的提取纯化原理1. 离子交换层析离子交换层析是一种基于蛋白质表面电荷的分离技术。
其原理是利用离子交换树脂的静电吸附作用，将带有相反电荷的蛋白质分离出来。
离子交换层析适用于分离电荷差异较大的蛋白质，但对于电荷差异较小的蛋白质分离效果较差。
2. 凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种基于蛋白质分子大小的分离技术。
其原理是利用不同孔径大小的凝胶过滤树脂，将分子大小不同的蛋白质分离出来。
凝胶过滤层析适用于分离分子大小差异较大的蛋白质，但对于分子大小相近的蛋白质分离效果较差。
3. 亲和层析亲和层析是一种基于蛋白质与配体之间的特异性结合作用的分离技术。
其原理是利用亲和树脂上的配体与目标蛋白之间的特异性结合作用，将目标蛋白分离出来。
亲和层析适用于分离具有特异性结合能力的蛋白质，但对于没有特异性结合能力的蛋白质分离效果较差。
二、基于化学性质的提取纯化原理1. 氢氧化铝沉淀法氢氧化铝沉淀法是一种基于蛋白质表面亲水性的分离技术。
其原理是利用氢氧化铝与蛋白质表面的羧基和氨基之间的静电吸附作用，将蛋白质分离出来。
氢氧化铝沉淀法适用于分离亲水性较强的蛋白质，但对于亲水性较弱的蛋白质分离效果较差。
2. 盐析法盐析法是一种基于蛋白质表面电荷和溶液离子强度的分离技术。
其原理是利用盐对蛋白质表面电荷的影响，使蛋白质在高盐浓度下发生沉淀，从而分离出来。
盐析法适用于分离电荷差异较大的蛋白质，但对于电荷差异较小的蛋白质分离效果较差。
三、基于生物学性质的提取纯化原理1. 亲和纯化法亲和纯化法是一种基于蛋白质与其特异性结合分子之间的亲和性分离技术。
其原理是利用特异性结合分子与目标蛋白之间的亲和性结合作用，将目标蛋白分离出来。
重组蛋白的表达与分离纯化
基因工程重组蛋白的表达与分离纯化实验目的：1.了解基因工程重组表达载体的构建和筛选方法；2.掌握重组蛋白诱导表达的机理；3.掌握蛋白的分离纯化方法，并学会使用SDS-蛋白质凝胶电泳；实验原理：将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30表达载体中，让其在E.coli中表达。
先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。
然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。
表达蛋白可经SDS-PAGE检测。
实验器材：1.仪器：高速冷冻离心机、恒温培养箱、高压灭菌锅、SDS-凝胶电泳仪、水浴锅、抽滤装置、AKTA液相色谱仪等；2.材料：LB培养基、溶菌酶、缓冲液A和B、氨苄青霉素、IPTG诱导剂、10%SDS等；实验内容：1.灭菌：①配置LB培养基20 ml*2 +100 ml*6(配方：酵母粉 0.5%，NaCl 1%，胰蛋白胨1%)；②黄、蓝枪头各一盒；2.菌体活化及扩培：①每瓶20 ml LB培养基中加入20 ul Amp后，再加入30~40 ul DH5α菌液，置于37℃恒温箱内，培养12~16 h；②活化后，在六瓶100 ml LB培养基中分别加入100 ul Amp后，再从20 ml活化后的菌液中取2 ml，置于37℃恒温箱内扩大培养，至少培养2.5 h以后加入IPTG 200ul，37℃，培养14~16h；3.细胞破碎及蛋白分离：①将菌液用大离心管收集，配平后，4000r/min，离心15 min，收集菌体；②用20 ml BufferA重悬菌体，4000r/min，再离心15 min，收集菌体；③用4 ml BufferA重悬菌体，加入溶菌酶40 ul混匀，静置15min；④再加入4 ml BufferB，混匀，75℃水浴保温1 h；⑤用高速冷冻离心机在4℃的条件下，8000r/min，离心20 min，收集上清液；⑥将上清液分装入几个浓缩管中，4℃，3000r/min浓缩一段时间至终体积为5-10ml，做好标记，备用；⑦实验过程中，配置五种AKTA液相色谱仪所需液体，并抽滤2遍；4.AKTA液相色谱分析及SDS凝胶电泳：①首先学习AKTA仪器的相关使用方法和注意事项，对仪器进行排气，平衡缓冲液冲洗等操作(该部分由老师操作演示)；②取5 ml浓缩后的液体过滤后上样，观察屏幕上紫外吸收曲线的变化，适时用离心管收集每个峰的样品，做好标号，备用。
基因工程药物蛋白的分离纯化与质量控制
应首先选择能除去含量最多杂质的方法
应尽量选择高效的分离方法
应将最费时、成本最高的分离纯化方法安 排在最后阶段
合适分离纯化介质的选择
常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和 Sepharose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：
对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定，重复性好 价格低廉
(3) 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对
pH、温度、金属离子、 有机溶剂、剪切力、表
面张力等十分敏感，容易是其失活、变性；
(4) 种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或
(5)
复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各
异
(6)
的生物活性物质；
(5) 应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求
(6)
（2）原材料和培养基的来源及其质量；
（3）生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式 （连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工 艺控制条件因素几方式等；
（4）初始物料的物理、化学和生物学特性：包括产物浓 度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解 度、pH、黏度、流体力学性质和热力学性质。
发酵液 细胞分离
胞内产 物 细胞破碎 固液分离
包涵体 变性 复性
细胞碎片分离
胞外产 物
浓 缩 初步分离 高度纯化 制 剂
产品
基因工程药物分离纯化的一般流程
A 重组基因工程药物分离纯化方法选择 的基因原则
针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择 分离纯化过程的规模化
（2）病毒的去除：成品中必须检查是否含有病毒。 病毒最大的来源是由宿主细胞带入。经过色谱分离， 一般能将病毒除去，必要时也可以用紫外线照射使 病毒失活，或用过滤法将病毒去除。
基因工程制药的基本过程
基因工程制药的基本过程
基因工程制药的基本过程包括：
1.选择目标基因：首先要从所有存在的基因中根据需要选择目
标基因。
2.克隆目标基因：将目标基因克隆到适当的载体中。
在这个过
程中，需要使用不同的限制性内切酶和连接酶对DNA进行操作，将目标基因插入到载体中。
3.转化目标细胞：利用转化技术将重组的载体带有目标基因的DNA转化到目标生物体的细胞中。
4.筛选获得重组生物体：利用适当的筛选技术，筛选出带有目
标基因并且表达该基因的细胞。
筛选的方法可以是选择性培养基、DNA杂交、荧光染色等。
5.表达目标蛋白：在获得重组生物体后，利用适当的生产条件（例如温度、pH值、培养基等）刺激目标基因表达目标蛋白。
6.纯化目标蛋白：利用各种生物化学纯化技术对目标蛋白进行
分离和纯化。
7.制剂和药物研发：将纯化的目标蛋白进行制剂开发和药物研发，包括剂型设计、剂量确定、毒理学和临床试验等。
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该法上样量有限
缺点
基于分子大小差 超滤 异的分离技术
利用加压膜分离技术，在一定的压力下，使小 超滤技术作为一种典型的膜分离技术，
分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜，大 则具有高效率、低能耗、无相变、无需
分子溶质滞留，从而使大分子物质得到部分的 添加任何化学试剂、操作简便、条件温
纯化
和等诸多优点
超滤膜缺乏选择性以及在超滤过程中易 产生浓差极化与膜污染
2.4产品质量的要求
• 产品质量标准和用途对产品纯度、生物活 性、比活的要求。
• 包括允许杂质种类和最大允许含量，特殊 杂质种类和最大允许量。
• 以及杂质对使用的影响、产品剂型、贮存 稳定性等。
三．蛋白质分离纯化应遵顺的原则
①具有良好的稳定性和重复性。尽量不变或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响， 使产品规格统一。必须明确严格控制的步骤和技术，以及允许的变化范围。 ②步骤之间尽量能衔接，减少工艺的步骤，同时工艺与设备也要相互适应，一般分离 原理相同的技术在工艺中不要重复使用，既可减少周期，又能提高纯度和得率。 ③技术条件要温和，温度低，PH值适中，能保持目的产物的生物活性。 ④工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤或干扰产品质盆。 ⑤周期尽量短，因稳定性差的产物随工艺时间增加，收率、质量会下降。 ⑥目的蛋白质选择性好，能从复杂的混合物中将目的产物有效地分离出来，达到较高 纯化倍数。 ⑦工艺和技术必须快速高效、收率高、易操作、对设备条件要求低、能耗低。 ⑧具有较高的安全性。在选择处理技术，工艺和操作条件时，要确保去除有危险的杂 质，保证产品质量和作用安全以及生产过程的安全，药品生产必须保证安全、无菌、 病毒、热原。
可用于沉淀分离； • ⑥密度，磷蛋白等密度大，可用密度梯度法分离； • ⑦配体结合能力，用于亲和层析； • ⑧金属结合能力，用于鳌合有金属离子的亲和柱； • ⑨翻译后修饰，如连有糖基的蛋白可用于含有外源凝集的亲和柱，磷蛋白质
在某些糖基下能与鳌合有FeZ'的柱子结合。
2. 2物料中杂质的种类和性质
• 包括杂质的种类和含 量、化学性质、分子 结构、相对分子量、 电荷性及数量、生物 学特性、稳定性(对于 热、pH值、盐、有机 溶剂等)、溶解度、吸 附性能等。
质的衍生物为载体，在某一 pH 条件下，这些 载体带有正电荷或负电荷，当待分离蛋白质分 子通过载体时，离子交换使蛋白质分子分离纯
机械强度大、柱效高、孔径和颗粒大小 易于控制，但应用范围窄
不能进行快速淋洗，且分离时间长，易造 成生物 分子的变性、失活
离子交换层析是发展最早的层析技术之一， 目前已成为蛋白质分离纯化最常用的手段
质等电点不同的特点进行分离的方法
优点，提取率有时可达80%以上
不能必少会须蛋发注白生意质偏调与移整金，pH属故值离溶。子液结中合含后有，金等属电离点子可时，为蛋白了的沉等淀电目点的即蛋可白，把溶液的pH调到目的
溶剂提取法包括水溶液提取法和有机溶剂提取 乙醇提取法溶解性能较好、溶出的水溶
法，其中缓冲溶液对蛋白质的溶解度大、稳定 性杂质少、可回收反复利用。丁醇在一 性好，最为常用; 而乙醇、丁醇和丙酮等有机溶 些与脂质结合紧密的蛋白质和酶提取中 剂具有一定的亲水性和较强的亲脂性，主要用 更加优越，溶解脂的能力强，兼具亲水
基因工程重组蛋白的分离纯化
生物工程下游技术 第七组 马夕尧
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目录
• 一．获得基因工程产品的特点 • 二．建立蛋白质纯化工艺的依据 • 三．蛋白质分离纯化应遵顺的原则 • 四．分离纯化的基本过程 • 五．几种主要蛋白质分离纯化的方法优缺
• 亲和色谱(affinity chromatography, AC )。
• 凝胶过滤色谱
五.几种主要蛋白质分离纯化的方法 优缺点对比
方法
原理
优点
凝胶层析（又称凝胶过滤、分子筛层析或排阻 层析）
利用凝胶的网状结构，根据分子大小差异分离 混合物的方法。
条件温和、简便、分离范围广、回收率 高,对生化物质的分离十分适宜
由于聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间的 质的变性作用，在粗提过程中保持了生 分子量及浓度、溶液 pH、离子强度、盐类 双水相萃取技术是一种新型的分离技术
不溶性形成两相
物物质的活性及构象等优势。该技术现 型及浓度的影响
已成功地应用于分离蛋白质、抗生素微
生物离子、电泳分离氨基酸等
其影响因素主要包括表面活性剂种类以及
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一，
常用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵 等中性盐。硫酸钠具有化学性质稳定、 溶解度大等优点，现在所指的盐析法实
该法受蛋白质浓度、离子强度、盐的性质、上述两种方法分离纯化蛋白质后，都要采
pH 及温度等因素影响
用凝胶过滤或透析除盐
际上多为硫酸铵盐析法
离子交换层析以纤维素或交联葡聚糖凝胶等物
四．分离纯化的基本过程
• 样品的固液分离与预处理 基因工程药物多为胞内产物，分离提取这类物质时， 需要经细胞收集细胞破碎细胞碎片分离等步骤
细胞收集
• 层析纯化
细胞破碎
细胞碎片 收集
细胞破碎
针对这种结构，细胞破碎方法有机械破碎法和非机械破碎法，可以 根据生产规模和活性蛋白在细胞中的位置，选择适当的方法。 • 机械破碎法是常用的方法，速度快，处理量较大，不会带人其他
二．建立蛋白质纯化工艺的依据
2.1目标蛋白的各种性质
• ①分子量大小，大的蛋白质先过凝胶柱； • ②分子形状，球蛋白易扩散人凝胶过滤柱填料颗粒的小孔内，较迟洗脱出来； • ③电荷与电荷分布，与离子交换紧密相关； • ④疏水性，与疏水层析、反相高压色谱有关； • ⑤.溶解度，影响因素有pH值、离子强度、离子的性质、湿度和溶剂极性等，
化学物质，但在处理过程中产生热量，必要时要采取冷却措施， 以防止目的产物失活。现常用方法有高压匀浆法、超声破碎法、 高速珠磨法、高压挤压法。 • 非机械破碎法包括酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击 法。酶溶法就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用 的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖昔酶、肤链内 切酶、壳多糖酶等。溶菌酶对细菌类作用效果好，其他酶对酵母 作用效果好。利用酶溶法处理细胞时必须根据细胞的结构和化学 组成选择合适的酶.并确定相应的使用次序，控制好温度、pH值和 酶量。化学渗透法利用一些有机溶剂(苯、甲苯)等可以改变细胞壁 或细胞膜的通透性，从而使内含目的产物有选择地渗透出来。
化
电泳技术作为分离纯化蛋白质的手段之一，可 分为变性电泳、常规电泳、等电聚焦电泳和毛 细管电泳。
无分论离是度单都向是凝极胶高电的泳。还是双向凝胶电泳，毛所细吸管附电，泳且中一蛋次白只质能易测被一石个英试毛样细。管表面
获得分离的蛋白质，均可用电洗脱或电转 印到硝酸纤维素膜上直接进行序列分析
亲和层析是一种以样品的生物活性为依据的分 离技术；当蛋白质溶液通过层析柱时，其中可只需要一步处理即可使某种待分离的蛋 与亲和载体配基相互作用的受体被吸附剂结合，白 质 从 复 杂 的 蛋 白如果目的蛋白作为药品，处理后的产品中 亲和层析技术是基于蛋白质可与另一种称 不被吸附的无关成分则可随流出液通过柱体，质混合物中分离出来,达到千倍以上的纯存在微量染料或金属都会对机体造成损害做 配 体 的 分 子 能 发 生 特 异 的 可 逆 结 合 从而将吸附蛋白与其他蛋白质分开，而后利用化 , 并 保 持 较 高 的 活 性 高浓度的底物溶液或亲和力更强的底物衍生溶 液洗脱目标蛋白，即可脱离层析柱上的载体
分离细胞碎片
分离细胞碎片是比较困难的，可以用离心、膜过滤或双水相分配的方 法，使细胞碎片分配在一相(通常为下相)而分离，同时也起部分纯化作 用；
以枯草杆菌、毕赤酵母等作 为基因工程菌的话，由于都 是外分泌，直接用离心、过 滤等方法进行分离，可以加 人一些助滤剂等利于分离。
得到的上清液可以通过硫酸氨分级沉淀、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、 超滤浓缩脱盐等进行预处理，有些可以进行特殊处理，如加热、三氯 乙酸处理等除去杂蛋白。
反胶团萃取
透析是利用小分子经过半透膜扩散到水( 或缓冲
液) 的原理，将无机盐等小分子与生物大分子分 透析结果表明，大的蛋白质 开的一种分离纯化技术，常和盐析、盐溶等方 分子和小的氨基酸分子得到初步分离。
必须利用不同型号透析袋，通用性不好
根据目的蛋白的分子大小来选 择透析袋的型号。
法联合使用
利用蛋白质在等电点时溶解度最低且各种蛋白 该法具有操作简单，提取率高产率高等
疏水色谱(hydrophobic interaction
便于自动化控制和分离过程中无发
chromatography,HIC)
热等有害效应。
• 层析纯化方法设计应根据目的蛋白 和杂蛋白的物理、化学和生物学方 面性质的差异，尤其重要的是表面 性质差异，例如表面电荷密度、对 一些配基的生物学特异性、表面疏 水性、表面金属离子、糖含量、自 由疏基数目、分子大小和形状(相对 分子质量)，pl，和稳定性等。选用 的方法应能充分利用目的蛋白和杂 蛋白间上述差异
质的溶解和分离
变性
质的变性和失活，虽然活性损失较少
取蛋白质、酶、核酸、氨基酸和多肽。
盐溶法及盐析法
离子交换层析 基于电荷不同的
分离技术
电泳技术
基于对配体亲和 力差异的分离技 亲和层析 术
基于选择性吸附 差异的分离方法
疏水层析
反相高效液相色谱法 分子印迹
其他方法
高效毛细管电泳 柱层析
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低， 若稍加一些无机盐则溶解度增加，该现象称为 盐溶，而当盐浓度继续增加时，蛋白质又会自 动析出，该现象称为盐析。盐溶和盐析主要是 通过影响蛋白质分子表面的电荷而分离、纯化 蛋白质