基因工程重组蛋白的分离纯化 放映

化
电泳技术作为分离纯化蛋白质的手段之一，可 分为变性电泳、常规电泳、等电聚焦电泳和毛 细管电泳。
无分论离是度单都向是凝极胶高电的泳。还是双向凝胶电泳，毛所细吸管附电，泳且中一蛋次白只质能易测被一石个英试毛样细。管表面
获得分离的蛋白质，均可用电洗脱或电转 印到硝酸纤维素膜上直接进行序列分析
亲和层析是一种以样品的生物活性为依据的分 离技术；当蛋白质溶液通过层析柱时，其中可只需要一步处理即可使某种待分离的蛋 与亲和载体配基相互作用的受体被吸附剂结合，白 质 从 复 杂 的 蛋 白如果目的蛋白作为药品，处理后的产品中 亲和层析技术是基于蛋白质可与另一种称 不被吸附的无关成分则可随流出液通过柱体，质混合物中分离出来,达到千倍以上的纯存在微量染料或金属都会对机体造成损害做 配 体 的 分 子 能 发 生 特 异 的 可 逆 结 合 从而将吸附蛋白与其他蛋白质分开，而后利用化 , 并 保 持 较 高 的 活 性 高浓度的底物溶液或亲和力更强的底物衍生溶 液洗脱目标蛋白，即可脱离层析柱上的载体
指胶团内可溶解少量水而形成微型水池，利用 具有选择性高、萃取过程简单，正萃、 普通离子型表面活性剂可能对产品产生污 浓度、离子强度、助表面活性剂、水相 pH
胶团对外界有机溶剂的屏蔽作用，实现生物物 反萃同时进行，能有效防止大分子失活、染; 常用的离子型表面活性剂容易造成蛋白 和温度等。
反胶团萃取法还可提
特点
常用在纯化的最后一步，与其他分离方法 ( 如离子交换) 组合使用
在超滤过程中，所用超滤膜的孔径约为1 ～ 100 nm，截留相对分子质量( molecular weight 为 3×105～ 1×106，能用于蛋白质、细菌、 胶体、病毒、热原、多糖等的分离
透析 等电点法 溶剂法
基于溶解度差异 双水相萃取法 的分离纯化技术
二．建立蛋白质纯化工艺的依据
2.1目标蛋白的各种性质
• ①分子量大小，大的蛋白质先过凝胶柱； • ②分子形状，球蛋白易扩散人凝胶过滤柱填料颗粒的小孔内，较迟洗脱出来； • ③电荷与电荷分布，与离子交换紧密相关； • ④疏水性，与疏水层析、反相高压色谱有关； • ⑤.溶解度，影响因素有pH值、离子强度、离子的性质、湿度和溶剂极性等，
基因工程重组蛋白的分离纯化
生物工程下游技术 第七组 马夕尧
•
仍 有 很 大 差 距 。
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目录
• 一．获得基因工程产品的特点 • 二．建立蛋白质纯化工艺的依据 • 三．蛋白质分离纯化应遵顺的原则 • 四．分离纯化的基本过程 • 五．几种主要蛋白质分离纯化的方法优缺
疏水色谱(hydrophobic interaction
便于自动化控制和分离过程中无发
chromatography,HIC)
热等有害效应。
• 层析纯化方法设计应根据目的蛋白 和杂蛋白的物理、化学和生物学方 面性质的差异，尤其重要的是表面 性质差异，例如表面电荷密度、对 一些配基的生物学特异性、表面疏 水性、表面金属离子、糖含量、自 由疏基数目、分子大小和形状(相对 分子质量)，pl，和稳定性等。选用 的方法应能充分利用目的蛋白和杂 蛋白间上述差异
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一，
常用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵 等中性盐。硫酸钠具有化学性质稳定、 溶解度大等优点，现在所指的盐析法实
该法受蛋白质浓度、离子强度、盐的性质、上述两种方法分离纯化蛋白质后，都要采
pH 及温度等因素影响
用凝胶过滤或透析除盐
际上多为硫酸铵盐析法
离子交换层析以纤维素或交联葡聚糖凝胶等物
2. 3初始物料的特点
①菌种类型及其代谢特性，包括菌种表达方式(是否以包含体形 式)、副产物种类、产物类似毒素、蛋白酶种类、原材料和培养 基的来源及其质量；
②生产工艺和条件，包括灭菌方法和条件、生产方式(连续、批 式、半连续)、生产周期、生产能力、工艺控制条件、因素及方 式等；
③初始物料的各种性质，包括产物浓度、杂质种类、浓度变化、 盐的种类、浓度、溶解度、pH值、粘度等。
该法上样量有限
缺点
基于分子大小差 超滤 异的分离技术
利用加压膜分离技术，在一定的压力下，使小 超滤技术作为一种典型的膜分离技术，
分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜，大 则具有高效率、低能耗、无相变、无需
分子溶质滞留，从而使大分子物质得到部分的 添加任何化学试剂、操作简便、条件温
纯化
和等诸多优点
超滤膜缺乏选择性以及在超滤过Hale Waihona Puke Baidu中易 产生浓差极化与膜污染
质的衍生物为载体，在某一 pH 条件下，这些 载体带有正电荷或负电荷，当待分离蛋白质分 子通过载体时，离子交换使蛋白质分子分离纯
机械强度大、柱效高、孔径和颗粒大小 易于控制，但应用范围窄
不能进行快速淋洗，且分离时间长，易造 成生物 分子的变性、失活
离子交换层析是发展最早的层析技术之一， 目前已成为蛋白质分离纯化最常用的手段
反胶团萃取
透析是利用小分子经过半透膜扩散到水( 或缓冲
液) 的原理，将无机盐等小分子与生物大分子分 透析结果表明，大的蛋白质 开的一种分离纯化技术，常和盐析、盐溶等方 分子和小的氨基酸分子得到初步分离。
必须利用不同型号透析袋，通用性不好
根据目的蛋白的分子大小来选 择透析袋的型号。
法联合使用
利用蛋白质在等电点时溶解度最低且各种蛋白 该法具有操作简单，提取率高产率高等
可用于沉淀分离； • ⑥密度，磷蛋白等密度大，可用密度梯度法分离； • ⑦配体结合能力，用于亲和层析； • ⑧金属结合能力，用于鳌合有金属离子的亲和柱； • ⑨翻译后修饰，如连有糖基的蛋白可用于含有外源凝集的亲和柱，磷蛋白质
在某些糖基下能与鳌合有FeZ'的柱子结合。
2. 2物料中杂质的种类和性质
• 包括杂质的种类和含 量、化学性质、分子 结构、相对分子量、 电荷性及数量、生物 学特性、稳定性(对于 热、pH值、盐、有机 溶剂等)、溶解度、吸 附性能等。
质等电点不同的特点进行分离的方法
优点，提取率有时可达80%以上
不能必少会须蛋发注白生意质偏调与移整金，pH属故值离溶。子液结中合含后有，金等属电离点子可时，为蛋白了的沉等淀电目点的即蛋可白，把溶液的pH调到目的
溶剂提取法包括水溶液提取法和有机溶剂提取 乙醇提取法溶解性能较好、溶出的水溶
法，其中缓冲溶液对蛋白质的溶解度大、稳定 性杂质少、可回收反复利用。丁醇在一 性好，最为常用; 而乙醇、丁醇和丙酮等有机溶 些与脂质结合紧密的蛋白质和酶提取中 剂具有一定的亲水性和较强的亲脂性，主要用 更加优越，溶解脂的能力强，兼具亲水
化学物质，但在处理过程中产生热量，必要时要采取冷却措施， 以防止目的产物失活。现常用方法有高压匀浆法、超声破碎法、 高速珠磨法、高压挤压法。 • 非机械破碎法包括酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击 法。酶溶法就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用 的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖昔酶、肤链内 切酶、壳多糖酶等。溶菌酶对细菌类作用效果好，其他酶对酵母 作用效果好。利用酶溶法处理细胞时必须根据细胞的结构和化学 组成选择合适的酶.并确定相应的使用次序，控制好温度、pH值和 酶量。化学渗透法利用一些有机溶剂(苯、甲苯)等可以改变细胞壁 或细胞膜的通透性，从而使内含目的产物有选择地渗透出来。
四．分离纯化的基本过程
• 样品的固液分离与预处理 基因工程药物多为胞内产物，分离提取这类物质时， 需要经细胞收集细胞破碎细胞碎片分离等步骤
细胞收集
• 层析纯化
细胞破碎
细胞碎片 收集
细胞破碎
针对这种结构，细胞破碎方法有机械破碎法和非机械破碎法，可以 根据生产规模和活性蛋白在细胞中的位置，选择适当的方法。 • 机械破碎法是常用的方法，速度快，处理量较大，不会带人其他
2.4产品质量的要求
• 产品质量标准和用途对产品纯度、生物活 性、比活的要求。
• 包括允许杂质种类和最大允许含量，特殊 杂质种类和最大允许量。
• 以及杂质对使用的影响、产品剂型、贮存 稳定性等。
三．蛋白质分离纯化应遵顺的原则
①具有良好的稳定性和重复性。尽量不变或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响， 使产品规格统一。必须明确严格控制的步骤和技术，以及允许的变化范围。 ②步骤之间尽量能衔接，减少工艺的步骤，同时工艺与设备也要相互适应，一般分离 原理相同的技术在工艺中不要重复使用，既可减少周期，又能提高纯度和得率。 ③技术条件要温和，温度低，PH值适中，能保持目的产物的生物活性。 ④工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤或干扰产品质盆。 ⑤周期尽量短，因稳定性差的产物随工艺时间增加，收率、质量会下降。 ⑥目的蛋白质选择性好，能从复杂的混合物中将目的产物有效地分离出来，达到较高 纯化倍数。 ⑦工艺和技术必须快速高效、收率高、易操作、对设备条件要求低、能耗低。 ⑧具有较高的安全性。在选择处理技术，工艺和操作条件时，要确保去除有危险的杂 质，保证产品质量和作用安全以及生产过程的安全，药品生产必须保证安全、无菌、 病毒、热原。
质的溶解和分离
变性
质的变性和失活，虽然活性损失较少
取蛋白质、酶、核酸、氨基酸和多肽。
盐溶法及盐析法
离子交换层析 基于电荷不同的
分离技术
电泳技术
基于对配体亲和 力差异的分离技 亲和层析 术
基于选择性吸附 差异的分离方法
疏水层析
反相高效液相色谱法 分子印迹
其他方法
高效毛细管电泳 柱层析
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低， 若稍加一些无机盐则溶解度增加，该现象称为 盐溶，而当盐浓度继续增加时，蛋白质又会自 动析出，该现象称为盐析。盐溶和盐析主要是 通过影响蛋白质分子表面的电荷而分离、纯化 蛋白质
由于聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间的 质的变性作用，在粗提过程中保持了生 分子量及浓度、溶液 pH、离子强度、盐类 双水相萃取技术是一种新型的分离技术
不溶性形成两相
物物质的活性及构象等优势。该技术现 型及浓度的影响
已成功地应用于分离蛋白质、抗生素微
生物离子、电泳分离氨基酸等
其影响因素主要包括表面活性剂种类以及
分离细胞碎片
分离细胞碎片是比较困难的，可以用离心、膜过滤或双水相分配的方 法，使细胞碎片分配在一相(通常为下相)而分离，同时也起部分纯化作 用；
以枯草杆菌、毕赤酵母等作 为基因工程菌的话，由于都 是外分泌，直接用离心、过 滤等方法进行分离，可以加 人一些助滤剂等利于分离。
得到的上清液可以通过硫酸氨分级沉淀、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、 超滤浓缩脱盐等进行预处理，有些可以进行特殊处理，如加热、三氯 乙酸处理等除去杂蛋白。
缺点是对具有生物活性大分子易引起变性 失活，操作要求在低温下进行。
总体来说，蛋白质的有机溶剂沉淀法不如 盐析法普遍。
于一些脂质结合较牢固或分子中非极性侧链较 性，在溶解度范围内不会引起酶的变性
多的蛋白质和酶
失活。
与传统的分离技术相比，具有操作条件
温和、处理量大、易连续操作等优点，
它把两种聚合物与一种盐的水溶液混合在一起，同时克服了常规萃取有机溶剂对生物物 采用双水相系统浓缩目的蛋白，受聚合物
• 亲和色谱(affinity chromatography, AC )。
• 凝胶过滤色谱
五.几种主要蛋白质分离纯化的方法 优缺点对比
方法
原理
优点
凝胶层析（又称凝胶过滤、分子筛层析或排阻 层析）
利用凝胶的网状结构，根据分子大小差异分离 混合物的方法。
条件温和、简便、分离范围广、回收率 高,对生化物质的分离十分适宜
层析纯化
• 预处理的产物可能仍与大量的杂质 • 离子交换色谱(ion exchange
混合在一起，这类杂质可能有病毒、 chromatography , IEC )
热原质、氧化产物、核酸、多聚体、
杂蛋白、与目的物类似的异构体等。
进一步纯化主要依赖色谱分离方法， 其优点是具有多种多样的分离机制， •
点对比
一．获得基因工程产品的特点
⑴ 目的产物在初始物料中含量低，而且往往在细胞内。含目的产物 的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还含有大量的细胞、代谢 物、残留培养基、无机盐等，特别是产物降解酶、产物类似物等对 目的产物的分离影响很大。 ⑵.目的产物一般是大分子物质，稳定性差，具有生物活性的物质对 pH值、温度、金属离子、有机溶剂等十分敏感，容易失活、变性； ⑶.种类繁多，包括有大、中、小分子，结构简单或复杂的有机化合 物以及结构复杂又性质各异的生物活性物质。对这些大分子基因工 程产品的纯化缺乏必要的数据，似乎每种蛋白都有其独自的纯化方 案，放大也往往凭经验，不像抗生素等小分子物质有很多数据可指 导放大。⑷.应用面广，往往是注射用，对其质量、纯度要求高，无 菌、无病毒、无热原。