分子杂交与印迹技术的原理复性课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子杂交与印迹技术的原理复性
原位杂交 in situ hybridization
▪ 即组织原位杂交，指组织切片或细胞 涂片直接用于杂交分析。先经适当处 理，使细胞通透性增加，让探针进入 细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位 杂交可以确定探针的互补序列在胞内 的空间位置，这一点具有重要的生物 学和病理学意义。
分子杂交与印迹技术的原理复性
第二节 聚合酶链反应
Polymerase Chain Reaction
分子杂交与印迹技术的原理复性
PCR技术 polymerase chain reaction
▪ PCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热 DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板 扩增数百万倍的一种操作技术。
分子杂交与印迹技术的原理复性
复性
RNA
DNA
分子杂交与印迹技术的原理复性
（一）印渍技术 Blotting
▪ 首先由Edwen Southern在1975年提出。 ▪ Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大
分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检测 分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和 蛋白质的检测
▪ 应用：用于检测样品中特异性蛋白质 的存在、细胞中特异蛋白质的半定量 分析以及蛋白质分子的相互作用研究 等。
分子杂交与印迹技术的原理复性
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
分子杂交与印迹技术的原理复性
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的 分析。
▪ 主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的 同一基因的表达情况。
分子杂交与印迹技术的原理复性
（三）蛋白质印渍技术 Western blotting
▪ 又称为Western杂交，或免疫印渍技术， 即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝 酸纤维素膜上的特异性蛋白质。
▪ 理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增 到106-109倍，从而大大提高对其进行分析 研究的速度。
分子杂交与印迹技术的原理复性
一、基本工作原理
Template 5 DNA
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
分子杂交与印迹技术的原理复性
5 5
5 5
5 5
Cycle 3
5
5
5
5ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
分子杂交与印迹技术的原理复性
二、PCR体系基本组成成分
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
分子杂交与印迹技术的原理复性
三、PCR的基本反应步骤
▪ 又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交 分析。是研究DNA图谱的基本技术，主 要用于基因组DNA的分析，如在基因组 中特异基因的定位及检测等，亦可用于 分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断 DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有 重要价值。
分子杂交与印迹技术的原理复性
基本方法
• 将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶 解片段；
▪ RNA印迹技术 Northern blotting
▪ 蛋白质印迹技术 Western blotting
▪ 斑点印迹 Dot blotting
▪ 原位杂交 in situ hybridization
▪ DNA点阵
DNA array
▪ DNA芯片技术 DNA chip
分子杂交与印迹技术的原理复性
（一）DNA印迹技术 Southern blotting
分子杂交与印迹技术的原理复性
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成杂化双链(heteroduplex) 。
第二十二章
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and Application
分子杂交与印迹技术的原理复性
第一节 分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology
分子杂交与印迹技术的原理复性
探针技术 probe
▪ 将一小段已知序列的核酸片段用放射性 同位素、生物素或荧光染料对它的末端 或全链进行进行标记，称为“探针”然后 用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、 荧光检测或显色技术，使杂交区带显现 出来
分子杂交与印迹技术的原理复性
二、印渍技术的类别及应用
▪ DNA印迹技术 Southern blotting
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
分子杂交与印迹技术的原理复性
斑点印迹 Dot blotting
▪ 斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标 本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。 这种方法耗时短，可做半定量分析，一 张膜上可同时检测多个样品。
变性
95˚C
分子杂交与印迹技术的原理复性
Southern Blotting
无水乙醇
酚/氯仿
蛋白酶K
SDS
离心
tissue
Paper Towels
分子杂交与印迹技术的原理复性
（二）RNA印渍技术 Northern blotting
▪ 又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。 是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维 素膜上的方法。
• 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中 转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位 置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。
• 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确 定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一 特定序列的DNA片段的位置和大小。
原位杂交 in situ hybridization
▪ 即组织原位杂交，指组织切片或细胞 涂片直接用于杂交分析。先经适当处 理，使细胞通透性增加，让探针进入 细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位 杂交可以确定探针的互补序列在胞内 的空间位置，这一点具有重要的生物 学和病理学意义。
分子杂交与印迹技术的原理复性
第二节 聚合酶链反应
Polymerase Chain Reaction
分子杂交与印迹技术的原理复性
PCR技术 polymerase chain reaction
▪ PCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热 DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板 扩增数百万倍的一种操作技术。
分子杂交与印迹技术的原理复性
复性
RNA
DNA
分子杂交与印迹技术的原理复性
（一）印渍技术 Blotting
▪ 首先由Edwen Southern在1975年提出。 ▪ Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大
分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检测 分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和 蛋白质的检测
▪ 应用：用于检测样品中特异性蛋白质 的存在、细胞中特异蛋白质的半定量 分析以及蛋白质分子的相互作用研究 等。
分子杂交与印迹技术的原理复性
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
分子杂交与印迹技术的原理复性
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的 分析。
▪ 主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的 同一基因的表达情况。
分子杂交与印迹技术的原理复性
（三）蛋白质印渍技术 Western blotting
▪ 又称为Western杂交，或免疫印渍技术， 即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝 酸纤维素膜上的特异性蛋白质。
▪ 理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增 到106-109倍，从而大大提高对其进行分析 研究的速度。
分子杂交与印迹技术的原理复性
一、基本工作原理
Template 5 DNA
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
分子杂交与印迹技术的原理复性
5 5
5 5
5 5
Cycle 3
5
5
5
5ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
分子杂交与印迹技术的原理复性
二、PCR体系基本组成成分
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
分子杂交与印迹技术的原理复性
三、PCR的基本反应步骤
▪ 又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交 分析。是研究DNA图谱的基本技术，主 要用于基因组DNA的分析，如在基因组 中特异基因的定位及检测等，亦可用于 分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断 DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有 重要价值。
分子杂交与印迹技术的原理复性
基本方法
• 将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶 解片段；
▪ RNA印迹技术 Northern blotting
▪ 蛋白质印迹技术 Western blotting
▪ 斑点印迹 Dot blotting
▪ 原位杂交 in situ hybridization
▪ DNA点阵
DNA array
▪ DNA芯片技术 DNA chip
分子杂交与印迹技术的原理复性
（一）DNA印迹技术 Southern blotting
分子杂交与印迹技术的原理复性
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成杂化双链(heteroduplex) 。
第二十二章
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and Application
分子杂交与印迹技术的原理复性
第一节 分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology
分子杂交与印迹技术的原理复性
探针技术 probe
▪ 将一小段已知序列的核酸片段用放射性 同位素、生物素或荧光染料对它的末端 或全链进行进行标记，称为“探针”然后 用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、 荧光检测或显色技术，使杂交区带显现 出来
分子杂交与印迹技术的原理复性
二、印渍技术的类别及应用
▪ DNA印迹技术 Southern blotting
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
分子杂交与印迹技术的原理复性
斑点印迹 Dot blotting
▪ 斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标 本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。 这种方法耗时短，可做半定量分析，一 张膜上可同时检测多个样品。
变性
95˚C
分子杂交与印迹技术的原理复性
Southern Blotting
无水乙醇
酚/氯仿
蛋白酶K
SDS
离心
tissue
Paper Towels
分子杂交与印迹技术的原理复性
（二）RNA印渍技术 Northern blotting
▪ 又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。 是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维 素膜上的方法。
• 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中 转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位 置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。
• 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确 定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一 特定序列的DNA片段的位置和大小。