第07章 痘病毒科(Poxviridae)

第七章痘病毒科(Poxviridae)

一、概述三、早、晚期转录

二、痘病毒基因组结构四、痘病毒的繁殖

（一）DNA末端的发夹结构五、重组痘苗病毒

（二）DNA末端的倒置重复序列（一）重组痘苗病毒的基本原理（三）痘病毒基因组的保守区与变异区（二）进行重组痘苗病毒必要条件（四）我国痘苗病毒天坛株DNA结构的基本特征（三）几种可能的重组痘苗病毒活疫苗

（五）痘病毒基因变异株（四）重组痘苗病毒表达活性多肽（六）痘病毒基因组的多肽编码区主要参考文献

（七）痘苗病毒基因组表达调节的特点

一、概述

痘病毒科是一大群长方形或卵圆形病毒，长方形粒子长220～450nm，宽140～260nm，厚140～260nm。卵圆形粒子长250～300nm，直径160～190nm。病毒粒子由1个核心、2个侧体和2层脂质外膜组成，是动物病毒中体积最大、结构最复杂的病毒。痘病毒在宿主细胞的胞浆内增殖，这在DNA病毒是独特的。根据病毒的特征、自然宿主和特异性抗原，痘病毒分为两个亚科，即脊索动物痘病毒亚科和昆虫痘病毒亚科。脊索动物痘病毒亚科包括正痘病毒属、禽痘病毒属、羊痘病毒属、兔痘病毒属(粘液纤维瘤病毒属)、猪痘病毒属、副痘病毒属、软疣痘病毒属和牙塔病毒属等8个属。昆虫痘病毒亚科则只含昆虫痘病毒A、B、C 3个亚属。各属内的成员可发生遗传性重组，各属间的成员则可发生非遗传性复活。目前仍有一些未定属的痘病毒(表7-1)。

表7-1 痘病毒科分类

一、脊索动物痘病毒亚科(Chordopoxrinae)

1.正痘病毒属(Orthopoxvirus)

牛痘病毒(Cowpox virus) 天花病毒(Variola virus)

痘苗病毒(Vaccinia virus) 兔痘病毒(Rabbitpox virus)

小鼠传染性脱脚病病毒(Infectious ectromelia virus)

水牛痘病毒(Buffalopox virus) 骆驼痘病毒(Camelpox virus)

马痘病毒(Horsepox virus) 猴痘病毒(Monkeypox virus)

2.禽痘病毒属(Avipoxvirus)

鸡痘病毒(Fowlpox virus) 鸽痘病毒(Pigeonpoxvirus)

火鸡痘病毒(Turkeypox virus) 金丝雀痘病毒(Canarypox virus)

麻雀痘病毒(Sparrowpox virus) 燕八哥痘病毒(Starlingpox virus)

鹌鹑痘病毒(Quailpox virus) 雪鸡痘病毒(Juncopox virus)

3.羊痘病毒属(Capripoxvirus)

绵羊痘病毒(Sheeppox virus) 山羊痘病毒(Goatpox virus)

疙瘩皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus)

4.兔痘病毒属(Leporipoxvirus)

粘液瘤病毒(Myxoma virus) 兔纤维瘤病毒(Rabbit fibroma virus)

野兔纤维瘤病毒(Hare fibroma virus) 松鼠纤维瘤病毒(Squirrel fibroma virus)

5.猪痘病毒属(Suipoxvirus) 猪痘病毒(Swinepox virus)

6.副痘病毒属(Parapoxvirus)

羊接触传染性脓疱性皮炎病毒(Orfvirus) 假牛痘病毒(Pseudo cowpox virus)

牛脓疱性口炎病毒(Bovine pustular stomatitis virus)

新西兰红鹿副痘病毒(Parapox virus of red deer in New Zealand)

7.软疣痘病毒属(Molluscipoxvirus)

人传染性软疣病毒(Malluscum contagiosum virus)

8.牙塔痘病毒属

牙巴猴肿瘤痘病毒(Yaba monkey tumor virus)塔那痘病毒(Tanapox virus)

二、昆虫痘病毒亚科(Entomopoxvirinae)

昆虫痘病毒A属蛴螬(鞘翅目)昆虫痘病毒等昆虫痘病毒

昆虫痘病毒B属摩氏蛾(鳞翅目)昆虫痘病毒等昆虫痘病毒

昆虫痘病毒C属淡黄摇蚊(双翅目)昆虫痘病毒等昆虫痘病毒

痘病毒引起人与多种动物包括禽类的疾病——由持续较长时间的轻症感染，至严重的致死性感染。除犬和猫不发生痘病毒感染外。几乎各种哺乳动物都有其各自的痘病毒，但某些痘病毒可以感染几种不同的动物。

1.形态结构

痘病毒具有独特的形态结构，电镜下为大型长方形(如正痘病毒)或卵圆形(如副痘病毒)颗粒。中央为一个两面凹陷的核心，两个侧体分别位于凹陷内。核心是由DNA和蛋白质组成的核蛋白复合体。紧帖于核心周围的是一层栅栏状的核心膜。核心和侧体一起，由脂蛋白性表面膜包围，其间充填着可溶性蛋白。正痘病毒等的表面膜显示许多小杆状或小球状单位；副痘病毒等的表面膜上则有规律性缠绕的螺旋丝(直径为10～20nm)。细胞外的病毒粒子，外面还有一层来自细胞的囊膜，囊膜内含有病毒特异的蛋白质，见图7-1。

图7-1痘病毒的结构模式

早期研究表明，提纯痘苗病毒粒子时用2-巯基乙醇进行处理，可使囊膜结构疏松，这可能是由于蛋白质二硫键被破坏的结果。如再加入非离子化去垢剂，则外膜破坏，核心与其相连的侧体释出。如果再用蛋白酶(如胰蛋白酶)处理，更可使侧体从核心上脱落下来。加去氧胆酸钠、二硫苏糖醇和氯化钠于痘苗病毒的核心悬液中，可以使其破裂而释放出DNA和20%的蛋白质，以及包括许多溶解状态的酶类。

其它正痘病毒，如禽痘病毒和兔痘病毒等的大小和形态结构基本相同，但羊痘病毒较小。昆虫痘病毒的形态差异较大。从Melolontha幼虫分离的昆虫痘病毒较大，直径为400×250nm，其表面有直径为22nm的球形结构，核心呈偏心肾形，只有单一侧体。从Amsacta幼虫分离的痘病毒较小，具有珠状表面结构，核心致密，核心周围缠绕着层中等密度的物质，侧体不明显。

2.理化学特性

病毒粒子的S20w约5 000。在庶糖中的浮密度为1.25g/cm3，在氯化铯中约1.3g/cm3，痘苗病毒DNA的分子量为122×106，但鸡痘病毒的DNA分子量高达200×106。这样大分子量的DNA，可以编码几百种蛋白质。有关痘病毒的理化学特性的资料数据，主要来自痘苗病毒。该病毒的高度提纯制品含有92%蛋白质、3.2%DNA、1.2%胆固醇、2.1%磷脂、1.7%中性脂肪、0.2%非核酸碳水化合物以及微量的铜、核黄素和生物素。但鸡痘病毒的含脂量高达病毒粒子干重的34%。正痘病毒属和禽痘病毒属抗乙醚，副痘病毒属、羊痘病毒属和兔痘病毒属对乙醚敏感。痘病毒的耐乙醚程度看来取决于其所含脂类是否为必需的脂质。痘病毒的G+C含量甚低，只35%左右。

已知痘病毒含有70多种早期蛋白质和40多种晚期蛋白质，分子量由8kDa～250kDa不等，一部分为糖蛋白和磷蛋白。应用非离子去垢剂和还原剂处理痘苗病毒粒子，可以使其外膜释出十几种主要多肽，如210kDa、110kDa、85kDa、42kDa、37kDa、21.5kDa、21kDa和20kDa，其中7种是糖蛋白。37kDa为主要蛋白，非糖基化。85kDa蛋白是血凝素(hemagglutinin,HA),HA-的痘苗病毒，其毒力显著降低。42kDa蛋白为穿膜蛋白。37kDa蛋白与病毒细胞间感染有关。另外还有32kDa膜蛋白，此蛋白质能增强病毒对机体和宿主细胞的感染力；14kDa膜蛋白，则促进病毒与细胞以及细胞与细胞间的融合。糖蛋白对“胰蛋白酶消化”敏感，可能紧贴于病毒粒子表面之下，在用上述去垢剂和还原剂处理后，至少还有18种多肽不被释出，可能就是核心的结构蛋白，包括那些分子量和含量最多的多肽。在病毒粒子核心中74kDa、62kDa、25kDa和11kDa4种蛋白质，约占核心重量的70%，其中11kDa 和25kDa蛋白对RNA有很高的亲和性。在病毒粒子核心中还有与核心DNA呈高度亲合性的60kDa、43kDa、28kDa、18kDa和14.5kDa 5种蛋白质。痘病毒能在室温下耐受干燥几个月。于干燥条件下，可耐100℃5～10mins，但在潮湿条件下，60℃mins即可破坏之。对常用消毒剂具有较强抵抗力，但50%酒精和0.01% KMnO4可在1hrs内使其灭活。于-70℃，可以存活多年。保存于50%甘油中的痘病毒，可于0℃以下温度中存活3～4年。

3.增殖和培养

痘苗病毒粒子对细胞膜的吸附过程较快，50%以上的种入病毒可于接种后的15mins内吸附于细胞，且无方向性，可以发生横向或纵向吸附。痘病毒虽然是DNA病毒，但它的整个增殖过程，全部在胞浆内进行。并在20hrs内完成一个复制周期。第一阶段，痘病毒粒子与细胞表面接触后，被细胞吞饮到吞饮泡内，在其中被水解酶系酶解，进行第一阶段脱壳(脱去外膜)，使病毒的核心等释放入胞浆。病毒粒子中存在有一整套用于自身增殖的酶，病毒脱去外膜后，在病毒RNA合成酶系作用下，占全病毒基因组近一半的拷贝被转录成早期mRNA。在核心内由依赖于DNA的RNA聚合酶、早期转录因子(ETF)、帽加工酶、甲基化酶、终止因子、聚