分析化学第八章吸光光度法

第八章吸光光度法
基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法。

包括比色法、可见及紫外分光光度法等。

本章主要讨论可见光区的吸光光度法。

利用可见光进行吸光光度法分析时，通常将被测组分通过化学反应转变成有色化合物，然后进行吸光度的测量。

例如：测量钢样中Mn的
含量，在酸性溶液中将Mn氧化为MnO
4-，然后进行吸光
度的测量。

与化学分析法比较它具有如下特点：
（一）灵敏度高
吸光光度法常用于测定试样中1－0.001%的微量组分。

对固体试样一般可测至10-4 %。

（二）分析微量组分的准确度高
例如：含铁量为0.001%的试样，如果用滴定法测定，称量1g试样，仅含铁0.01mg，无法用滴定分析法测定。

如果用显色剂1，10-邻二氮菲与亚铁离子生成橙红色的1，10-邻
二氮菲亚铁配合物，就可用吸光光度法来测定。

Fe2++ 3(1,10-phen) → [ Fe(1,10-phen)3] 2+（三）操作简便，测定快速
（四）应用广泛
几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可直接或间接地用分光光度法测定。

可用来研究化学反应的机理、溶液中配合物的组成、测定一些酸碱的离解常数等。

§8-1 吸光光度法基本原理
一、物质对光的选择吸收
当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，产生了反射、散射、吸收或透射（p238, 图9-1）。

若被照射的是
均匀的溶液，则光在溶液中的散射损失可以忽略。

当一束由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色的光复合而成的白光通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过。

当透射光波长在400-700nm
范围时，人眼可觉察到颜色的存在，这部分光被称为可见光。

透射光和吸收光呈互补色，即物质呈现的颜色是与其吸收光呈互补色的透射光的颜色。

溶液由于吸收了580-600 nm的黄色光，呈例如：CuSO
4
现的是与黄色呈互补色的蓝色。

不同波长的光具有不同的颜色，见P238，表9-1。

物质吸收了光子的能量由基态跃迁到较高能态（激发态），这个过程叫做物质对光的吸收。

M（基态）+hυ → M*(激发态)
当照射光光子的能量hυ与物质的基态与激发态能量之差相等时，即ΔE= hυ，才能发生吸收。

不同的物质由于结构不同而具有不同的能级差，所以吸收不同波长的光。

物质对不同波长光吸收能力的分布情况，称为吸收曲线，也称为吸收光谱。

吸收曲线以波长为横坐标，吸光度为纵坐标。

每种物质的吸收曲线，一般都有一个最大吸收峰，最大吸收峰所对应的波长叫做最大吸收波长λ。

max
由P239，图9-3可以看出：不同浓度的1，10-邻二氮杂菲亚铁溶液对不同波长的光吸收情况不同，其最大吸收波长位于510nm，即吸收的是绿光，呈现的是相应的互补色橙红色。

当溶液浓度增大时，吸光度增大，但最大吸收波
长λ
max 不变。

在吸光光度法分析中，一般都在最大吸收波
长处测量吸光度。

二、光吸收的基本定律
１、朗伯-比耳定律
1729年波格（Bouguer）建立了吸光度与吸收介质厚度之间的关系。

1760年朗伯（Lambert）用更准确的数学方法表达了这一关系。

1852年比耳（Beer）确定了吸光度与溶液浓度及液层厚度之间的关系，建立了光吸收的基本定律，称为朗伯-比耳定律。

当一束平行单色光通过液层厚度为b、吸光物质的浓度
为c的单一均匀的，非散射的有色溶液时, 溶液的吸光度与
溶液浓度和液层厚度成正比。

A = lgI0/I = abc
A：吸光度，A =lgI0/I ；T：透光度，T＝I /I0；I0: 入射
光强度；I: 透射光强度；a 称为吸光系数；b：液层厚度
（光程长度），b的单位为cm ；c为吸光物质的浓度，若c
的单位为g /L，则a的单位为L·g-1·cm-1。

当c的单位为mol/L，则此时吸光系数称为摩尔吸光系数，用ε表示，单位为L·mol-1·cm-1，它表示1mol/L吸光物质，溶液的厚度为1cm时溶液对光的吸收能力。

A= εbcε= M a
在分光光度分析的实际工作中，不能直接取1mol/L这样高的浓度测定摩尔吸光系数ε值，而是在适宜的低浓度下
测量吸光度A，然后通过计算求出ε值。

例：铁（II）浓度为5.0×10-4g /L，与1，10-邻二氮菲反应生成橙红色的配合物，该配合物在波长508nm，比色皿厚度为2cm时，测得A=0.19，计算该配合物的a及ε。

解：a=A/bc=0.19/(2×5.0×10-4)=190L·g-1·cm-1
ε=A/bc=0.19/(2×5.0×10-4/55.85) =1.1×104L·moL-1cm-1或ε= M a＝55.85×190=1.1×104L·moL-1cm-1
通常认为ε>104的显色反应是灵敏的，ε<103则是不灵敏的。

吸光度具有加合性，即体系总的吸光度等于各组份吸光度之和（设各吸光物质之间没有互相作用）。

A总=A1+A2+……..A n
= ε1bc1+ ε2bc2+……. εn bc n
在吸光度的测量中，有时也用透光率或透光度表示物质对光
的吸收程度。

透光率以T表示: T=I/I
0, 则吸光度与透光率之
间的关系为A=lgI
/I=lg1/T 。

2、偏离朗伯-比耳定律的原因
根据朗伯-比耳定律，当吸收池厚度保持不变，以吸光度对浓度作图时，应得到一条通过坐标原点的直线，该直线称为标准曲线或工作曲线。

在相同条件下测得试液的吸光度，从工作曲线上就可以查得试液的浓度。

但在实际工作中，常常遇到偏离线性关系的现象，特别是在溶液浓度较高时，常会出现标准曲线向上或向下弯曲产生正偏离或负偏离（P241,图9-4）。

偏离朗伯-比耳定律的因素可分为物理因素和化学因素两大类。

（一）物理因素
（1）单色光不纯
朗伯-比耳定律的基本假设是入射光为单色光，但目前
光度分析仪器中，用单色器分光，用狭逢控制光谱带的宽度，因而投射到吸收溶液的入射光，常常是一个有限宽度的光谱带，而不是真正的单色光。

由于物质对不同波长光的吸收程
度不同，因而引起了对朗伯-比耳定律的偏离。

见P241，图9-5。

详细推导见P241-242。

(2)非平行光或入射光被散射
若入射光不垂直通过吸收池，就使通过溶液的实际光程大于吸收池厚度。

此外，入射光发生散射，实测吸光度增大，导致偏离朗伯-比耳定律。

（二）化学因素
(1) 粒子间相互作用
朗伯-比耳定律的基本假设，除要求入射光是单色光
外，还假设吸收粒子之间无相互作用，即彼此是独立的，因
此稀溶液能很好地符合定律。

随浓度增大，粒子之间的相互
作用增大，因此高浓度时吸光度与浓度间的关系就偏离线性
关系。

(2) 平衡效应、酸效应、溶剂效应
溶液中有色化合物的平衡移动会使最大吸收波长发生变化，使工作曲线产生弯曲。

溶液的酸度、溶剂会对有色化合物的形成、分解等产生影响，而使吸收光谱的形状和最大吸收波长发生变化，从而导致偏离。

§8-2目视比色法及光度计的基本部件
一、目视比色法
用眼睛比较溶液颜色的深浅以测定物质含量的方法称为目视比色法。

常用的目视比色法是标准系列法。

这种方法就是使用一套由同种材料制成的、大小形状相同的平底玻璃管（称为比色管），于管中分别加入一系列不同量的标准溶液和待测液，在实验条件相同的情况下，再加入等量的显色剂，稀释至一定刻度，然后从管口垂直向下观察，比较待测液与标准溶液颜色深浅。

若待测液与某一标准溶液颜色深度一致，则说明两者浓度相等，若待测液介于两标准溶液之间，则取两标准液平均值为待测液浓度。

目视法的主要缺点是准确度不高，受主观观察影响较大。

对于颜色不稳定的有色溶液，标准系列不能久存，需在测定时配制，比较麻烦。

但其设备简单，操作简便，对于准确度要求不高的常规分析很方便实用。

二、分光光度法、光电比色法
光度法与目视比色法相比，具有下列优点：
(a)用仪器代替人眼测量，消除主观误差，提高准确度。

(b)当溶液中有其它有色物质干扰时，目视比色法无法进
行而光度法可选择适当的单色器和参比溶液消除干扰。

(c)分析大批试样方便。

光度计的基本组成：光源→单色器→吸收池→检测器
光源：可见区测量一般用钨丝灯，可发出波长为320nm-
2500nm的连续光谱作为光源。

在近紫外区测量时采用氢灯或氘灯产生180-375nm的连续光谱作为光源。

单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。

单色器分为棱镜或光栅（分光光度法）以及滤光片（光电比色法）等色散元件。

棱镜及光栅色散能力较强，可以获得纯度较高的单色光，且可方便地改变测定波长，所以分光光度法的灵敏性、选择性和准确度都较光电比色法高。

吸收池：亦称比色皿，用于盛吸收试液，能透过所需光谱范围的光线，可见区测定可使用玻璃比色皿。

紫外区测定须选用石英比色皿（玻璃会吸收紫外光）。

检测器：测量吸光度时，并非直接测量透过吸收池的光强度，而是将光强度转为电流进行测量。

这种光电转换器件称为检测器。

有光电池和光电管两种。

检测器要对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，且所产生的光电流与照射到检测器上的光强度成正比。

§8-3显色反应和显色条件选择
一、显色反应和显色剂
在光度分析中，将试样中被测组分转变成有色化合物的化学反应叫显色反应。

显色反应可分为两大类，即配位反应和氧化还原反应，而配位反应是最主要的显色反应。

与被测组分生成有色物质的试剂称为显色剂。

同一被测组分常可与若干种显色剂反应，生成多种有机化合物。

选择显色反应的一般标准：
（一）灵敏度高
灵敏度高的显色反应有利于微量组分的测定。

摩尔吸光系数ε的大小是显色反应灵敏度高低的重要标志。

一般来说，当ε值为104-105时，可认为该反应灵敏度较高。

P247，从
Cu2+与三种显色剂反应的ε值判断，除氨外，其它两个显色反应的灵敏度都较高。

（二）选择性好
一种显色剂最好只与一种被测组分起显色反应，但这种试剂实际上非常少，可以通过掩蔽干扰离子或选择显色剂与被测组分和干扰离子生成的有色化合物的吸收峰相隔较远而获得好的选择性。

（三）显色剂在测定波长处无明显吸收
这样可使试剂空白一般较小。

（四）有色化合物的组成要恒定，化学性质要稳定这样可以保证在测定过程中吸光度基本不变。

二、显色条件的选择
显色反应能否满足光度法的要求，除了主要与显色剂的性质有关系外，控制好显色反应的条件也是十分重要的。

显色条件包括显色剂用量、酸度、显色温度、显色时间及干扰的消除。

（一）显色剂的用量
M(被测组分)+R（显色剂）= MR（有色化合物）为了使显色反应尽可能进行完全，加入适当过量的显色剂是必要的。

但也不能过量太多，否则会引起副反应，对测定反而不利。

在实际工作中，显色剂的适宜用量是通过实验求得的。

固定被测组分的浓度和其它条件，分别加入不同量的显色剂，测量吸光度，做吸光度–显色剂用量曲线。

一般有三种情况，见P248，图9-14，其中（a）最为常见。

在a-b范围内曲线平直，吸光度出现稳定值，因此可在a-b间选择合适的显色剂用量。

（二）溶液的酸度
溶液酸度对显色反应的影响可从金属离子、显色剂及有色配合物三方面考虑。

大部分高价金属离子都易水解，显然，金属离子的水解，对于显色反应的进行是不利的，故溶液的酸度不能太低。

显色剂多是有机弱酸，溶液的酸度影响着显色剂的离解，并影响显色反应的完全程度。

此外，许多显色剂本身就是酸碱指示剂，溶液的酸度对显色剂本身的颜色会产生改变。

溶液的酸度对有色配合物的组成及稳定性也有影响。

因此，某一显色反应最适宜的酸度可通过实验来确定。

固定待测组分及显色剂浓度，改变溶液pH，测定其吸光度，做吸光度-pH关系曲线，曲线平坦部分对应的pH为适宜的酸度范围。

（三）显色温度
合适的显色温度也必须通过实验确定，做A-T曲线。

（四）显色时间
有些显色反应较慢，需放置使其显色完全。

有些显色配合物不够稳定，放置后会产生部分分解，导致吸光度降低，因此适宜的显色时间必须通过实验来确定。

从加入显色剂计算时间，每隔几分钟测定一次吸光度，绘制A-t曲线，来确定适宜的时间。

（五）干扰的消除
主要有三种：利用掩蔽反应、控制酸度、分离干扰离子。

三、显色剂
显色剂主要分为无机显色剂和有机显色剂两大类，其中有机显色剂由于大多与金属离子生成极其稳定的鳌合物，显色反应的选择性和灵敏性都较无机显色反应高，因而广泛地应用于吸光光度分析中。

这部分内容可参考P249－251。

四、三元配合物
由于三元配合物具有独特的分析特性，因而在
分析化学中得到了广泛的应用。

§8-4吸光度测量条件的选择
上节主要介绍了显色反应和显色条件的选择和控制对吸光光度法的影响，为使光度法有较高的灵敏度和准确性，还必须控制适当的吸光度测量条件。

选择合适的测量条件，可从下面几个方面考虑：
一、入射光波长
入射光波长一般选择溶液具有最大吸收时的波长，以便获得较高的灵敏度。

如果在最大波长处有干扰物质的强烈吸收，则可选择次强吸收峰，见P252，图9-15。

二、参比溶液
为了使测得的吸光度能真实反映待测物质对光的吸收，必须校正比色皿、溶剂等对光的吸收造成的透射光强度的减弱。

采用光学性质相同、厚度相同的比色皿储存参比溶液，调节仪器使透过参比皿的吸光度为零。

也就是说，实际上是以通过参比皿的光强度作为入射光强度。

这样得到的吸光度才真实反映了待测物质对光的吸收。

A = lgI0/I = lgI参比/I试液
参比溶液若选择不适当，对测量的准确度影响较大。

一
般选择参比溶液的原则是：
（１）如果仅待测物与显色剂的反应产物有吸收，可用蒸馏水做参比溶液。

（２）如果显色剂或其它试剂略有吸收，用空白溶液（不加待测物溶液）作参比溶液。

（３）如果试剂和显色剂均无色，试液中其它离子有色时，采用不加显色剂的试样溶液作参比溶液。

当显色剂有色，加掩蔽剂使待测组分掩蔽，再加入试剂和显色剂，以此溶液为参比溶液。

三、吸光度读数范围
A= lg1/T = -lgT = εbc
对朗伯-比耳定律微分，
将两式相除，整理后得以有限值表示bdc T
dT T d T d ε=-=-=-4343.0ln 4343.0lg dT T
T c dc lg 4343.0=T T
T c c ∆=∆lg 4343.0
可以求出当透光率T=0.368（A=0.434）时，浓度相对误差最小。

一般测量吸光度控制在0.2-0.8范围内，测量的准确度高。

可以改变吸收池厚度b或待测液浓度c使吸光度读数处于适宜范围内。