免疫组织化学
(整理)免疫组化知识
免疫组织化免疫组织化学免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。
它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
1．发展简史——1941年Coons首先用荧光素标记抗体一检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代Nakane建立酶标抗体技术铁蛋白标记Ab技术。
——70年代Stemberger改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
——80年代Hsu等建立了抗生物素一生素（ABC）法之后，免疫金一银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。
——90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。
——2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。
其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。
2．免疫组织化学的技术分类（1）根据染色方式分成：①贴片染色；②漂浮染色。
（2）根据Ag—Ab结合方式分成：①直接法；②间接法；③多层法。
（3）按标记物的性质分成：①免疫荧光技术（免疫荧光法）；②免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）；③免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）。
3．标记物（1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。
（2）常用标记物①荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）荧光显微镜下呈绿色荧光四乙基罗达明（rho—damineRB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光；②酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
③生物素：（Biotin）④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。
其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）4．应用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
免疫组织化学
免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法：简便、快速，用特异性标记荧光 的一抗与组织细胞内抗原结合。 操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗； 石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上， 湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。 (3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min，蒸馏水洗2次，除去NaCl结晶。 (4)pH9.0甘油缓冲液〔磷酸盐〕封片。 〔必需无自发荧光，无色透亮 〕
▪ 2、扛酶抗体：抗体与酶的结合为抗原抗体 反响，避开了共价结合，爱护了酶和抗体 的活性。
标记酶选择标准：
★ 该酶用细胞化学易于被检出，能被 光镜或电镜观看。
★ 酶反响产物须稳定，不集中，具有 良好定位。
★ 酶易于纯化，获得纯制品。 ★ 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 ★ 酶在PH中性液内较稳定。 ★ 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。
标本的固定与保存
好的固定剂除能满足一般组织学固定目 的外，还需要： 〔1〕能快速固定抗原 〔2〕防止抗原物质集中 〔3〕固定后的抗原能被抗体识别，不影响 抗原抗体反响
▪ 常用：10%福尔马林〔酸性〕、乙醇、丙酮、 甲醛、中性缓冲多聚甲醛、戊二醛
▪ 混合固定液：Bouin液，Zamboni液、过碘 酸-赖氨酸-多聚甲醛〔PLP〕固定液
免疫组织化学
把握内容
▪ 免疫组化的根本原理 ▪ 免疫组化的根本过程 ▪ 免疫组化的染色技术分类 ▪ 常用的免疫组化的染色原理和方法 ▪ 留意事项
免疫组织化学的根本概念 Immunohistochemistry 又称免疫细胞化学。它是组织化 学的分支，它是用免疫学原理〔特 异的抗原抗体反响〕来对组织内抗 原〔或抗体〕的分布进展原位检测
免疫组织化学、免疫荧光染色
免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）和免疫荧光染色（Immunofluorescence，简称IF）是两种常用的免疫细胞化学技术，用于在组织切片或细胞涂片上检测特定蛋白质或抗原的存在和分布。
这两种技术都依赖于抗体与抗原之间的特异性结合反应。
免疫组织化学是一种使用酶标记抗体来检测抗原的方法。
在这个过程中，首先将组织切片与特定的初级抗体（针对目标抗原的抗体）孵育，然后洗涤以去除未结合的抗体。
接下来，将切片与带有酶标记的次级抗体（针对初级抗体的抗体）孵育。
再次洗涤后，加入酶的底物，它会在酶的作用下产生颜色沉淀，使得抗原的位置在显微镜下可见。
常用的酶包括过氧化物酶和碱性磷酸酶。
这种方法的优点是可以产生永久性的记录，因为颜色沉淀是稳定的。
免疫荧光染色则涉及使用荧光染料标记的抗体来检测抗原。
在这个过程中，初级抗体和次级抗体都带有荧光标记。
当这些抗体与抗原结合时，它们发出的荧光可以在荧光显微镜下观察到。
这种方法的优点是可以同时使用多种颜色的荧光染料来检测多个不同的抗原，而且荧光信号通常比免疫组织化学的颜色反应更强。
两种技术都有其应用范围。
免疫组织化学常用于病理学诊断，因为它可以用于存档的组织样本，并且结果可以用常规显微镜观察。
而免疫荧光染色则更适合于研究目的，特别是在活细胞成像和多标记实验中，因为它可以提供更丰富的信息和更高的灵敏度。
总之，免疫组织化学和免疫荧光染色都是强大的工具，它们使得科学家能够在细胞和组织水平上可视化蛋白质的表达和定位。
选择哪种技术取决于实验的具体需求和可用的设备。
免疫组织化学技术的特点
免疫组织化学技术的特点免疫组织化学技术是一种在生物学和医学领域中广泛应用的重要方法，它能够在细胞和组织水平上对特定蛋白质、抗原等生物分子进行定位、定性和定量分析。
这项技术具有许多独特的特点，为疾病的诊断、治疗和科学研究提供了有力的支持。
一、高特异性免疫组织化学技术的核心在于抗体与抗原的特异性结合。
所使用的抗体是针对特定抗原表位设计和制备的，因此能够高度特异性地识别和结合目标抗原。
这意味着在复杂的细胞和组织环境中，该技术可以准确地检测到我们感兴趣的特定分子，而不会与其他相似或无关的分子发生交叉反应。
这种特异性使得免疫组织化学能够在细胞和组织中精准地定位特定的蛋白质、激素、受体等生物标志物，为疾病的诊断和研究提供准确的信息。
例如，在肿瘤诊断中，通过使用针对肿瘤特异性抗原的抗体，可以明确肿瘤细胞的来源和类型，区分良性和恶性肿瘤，以及确定肿瘤的分化程度和侵袭性。
对于神经退行性疾病，如阿尔茨海默病，特定的抗体可以检测到大脑组织中异常积累的蛋白质，如β淀粉样蛋白和tau 蛋白，为疾病的诊断和研究提供重要依据。
二、高灵敏度免疫组织化学技术具有很高的检测灵敏度。
即使目标抗原在样本中的含量很低，通过适当的抗体标记和检测方法，也能够被检测到。
这对于检测微量的生物分子，尤其是在疾病早期或病理变化轻微的情况下，具有重要意义。
现代免疫组织化学技术不断发展和改进，采用了更加灵敏的检测系统，如增强化学发光法、荧光染料标记等，能够进一步提高检测的灵敏度。
同时，优化的样本处理和抗原修复方法也有助于充分暴露抗原，提高检测的准确性和灵敏度。
在临床实践中，高灵敏度的免疫组织化学技术可以帮助早期发现肿瘤的微小转移灶，监测疾病的进展和治疗效果。
在科研领域，它能够检测到细胞内低丰度的蛋白质表达变化，揭示生命活动中的细微调节机制。
三、定位准确免疫组织化学技术能够在细胞和组织的微观结构中准确地定位目标抗原。
通过将抗体与显色剂或荧光标记物结合，可以直观地观察到抗原在细胞内的分布位置，如细胞核、细胞质、细胞膜等。
免疫组织化学技术名词解释
免疫组织化学技术名词解释免疫组织化学技术是一种应用于组织学研究和病理诊断中的实验技术，用于检测和定位特定抗原在组织中的表达和分布。
免疫组织化学技术结合了免疫学和组织学的原理和方法，使得我们能够在组织切片中检测到特定抗原，并通过染色的方式将其可视化。
1. 免疫染色：免疫组织化学技术的核心是免疫染色。
免疫染色是通过将特异性的抗体与待检测物质结合，并标记上染色物质，从而实现对抗原的检测和定位。
常用的染色物质包括标记着色剂如酶、荧光物质和金颗粒等。
2. 抗原：抗原是一类能够诱导机体产生抗体的物质。
在免疫组织化学技术中，抗原可以是蛋白质、多肽或者是其他小分子化合物。
通过特异性的抗体和抗原的结合来实现对抗原的检测和定位。
3. 抗体：抗体是机体特异性免疫应答产生的一类蛋白质分子。
抗体能够与特定抗原结合，并通过诱导免疫反应来清除抗原。
在免疫组织化学技术中，通过标记抗体对待检测抗原进行检测和定位。
4. 免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是一种检测并定位抗原的方法。
根据标记抗体的不同，可以分为酶标法、免疫荧光染色法和免疫金染色法等。
其中，酶标法是最常用的方法之一，通过将酶标记的抗体与待检测抗原结合，然后通过酶的催化作用使染色物质可视化。
5. 免疫组织化学实验步骤：免疫组织化学技术包括多个实验步骤，一般包括组织固定、切片、抗原恢复、阻断、一抗和二抗结合、洗涤、染色和显微镜观察等。
每个步骤都需要严格的操作和控制条件，以保证实验的可靠性和准确性。
6. 免疫组织化学应用：免疫组织化学技术广泛应用于医学研究和病理诊断中。
在医学研究领域，免疫组织化学技术可以用于研究疾病的发生和发展机制、寻找新的生物标志物以及评估药物的疗效等。
在病理诊断中，免疫组织化学技术可以用于帮助确定肿瘤类型、检测特定蛋白的异常表达以及判断预后等。
7. 免疫组织化学技术的优点和局限性：免疫组织化学技术具有高度的特异性和灵敏度，可以实现对细胞和组织水平上抗原的定量和定位。
免疫组化的定义
第四篇免疫组织化学一、免疫组织化学的定义：（一）什么叫免疫组织化学？简单地说，用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体，根据其结合后经一系列方法的处理，呈色反应，在光镜下确定组织的来源属性和部位。
目前免疫组织化学作为病理诊断，鉴别特殊病例，是不可缺少的最重要的手段，国内在免疫组织化学的应用方面已经普遍地展开并扩展至基层单位，为病理事业做出应有的贡献。
抗原（抗原，AG）它是一类可以刺激机体的免疫系统并促进其发生免疫应答，与免疫应答产物即抗体和效应细胞，在体内或体外发生特异性结合的物质。
1）抗原的性质①异物性。
它是抗原所具有的特性，机体对进入体内的某些异物，异体大分子物质可产生免疫应答。
目前生物制剂公司利用这一原理生产出许多适合于临床诊断的抗体。
但是，并非所有的异物都是抗原。
例如矽尘等一些生物性高分子聚合物，它们不会刺激机体的免疫系统产生相应的抗体物质，而只是肺对吸入的矿物性和有机粉尘的非肿瘤性反应[1]。
矽肺是肺吸入矽颗粒沉积的结果，也是机体对另一种外来物反应的结果。
②理化性状。
凡具有抗原性的物质，其分子越大，它的免疫原性就越强。
具有抗原性的物质，其分子量都较大，起码在一万以上，抗原分子量越大，其相应的表面积也越大，接触、碰撞免疫细胞的机会就增多，这犹如一颗大树，根深叶茂，占据着大片空间，不易被风刮跑。
抗原性物质由于分子量大，盘踞着较大地方，在体内存留着一定的时间，时间越长，其对机体的刺激作用就越强。
③特异性。
各类抗原物质结构繁琐，组成的化学结构也很复杂，但是能够刺激机体并与抗体发生结合反应的化学组成，仅仅是抗原物质表面的一些具有活性的化学基团，化学结构及空间构型，称为抗原决定簇。
即一种抗体只能与相应的抗原起反应而不能与其它的抗原起反应[2]，这就是抗原的特异性，称之为特异性抗原。
虽然如此，特异性抗原也只是相对的，因为人们希望这种特异性抗原只存在于某种细胞及结构而不存在于其它细胞及结构的特有抗原[3]，但至今为止，仅发现较为狭小范围的特异性抗原，如前列腺特异抗原（Prostatespecific 抗原,PSA）,它是由前列腺上皮细胞合成的一种糖蛋白，目前认为是具有特异性的肿瘤标记物之一，它可以用于前列腺癌和转移性前列腺癌的诊断，但不能用于同源的前列腺肿瘤的良恶性诊断，因为它还不是非常特异性的抗原，前列腺增生的上皮也可以呈阳性反应。
免疫组织化学
免疫组织化学免疫组织学是研究细胞、组织和器官在发生免疫反应时所发生的化学变化的科学。
通过采用组织化学和免疫组织化学技术可以观察和研究免疫系统中各个细胞分子、细胞膜和细胞内物质在免疫反应中的变化情况，从而了解和诊断疾病。
一、组织化学技术1.石蜡切片技术石蜡切片技术是通过对组织进行处理后包埋在石蜡中，再将石蜡切片来观察组织状态的技术。
这种技术可以非常清晰地显示细胞和细胞膜，同时被用于对组织进行染色和特定化学分析。
2.冻切片技术冻切片技术是将组织冷冻并且快速切片来观察组织状态的一种技术。
这种技术用于光镜下检测细胞活性和免疫反应时的病理学变化以及细胞的病态化变化。
3.光镜检查光镜检查是针对石蜡切片和冻切片进行的检查，对病理学变化等细节进行更加细致的观察。
二、免疫组织化学技术1.免疫荧光技术免疫荧光技术是通过对组织中某些成分进行标记，利用特定的荧光染料来显示出细胞、分子及其他细节结构的技术。
这种技术主要用于开展多种体外免疫试验。
2.酶标记技术酶标记技术也称为酶免疫分析技术或酶联免疫试验技术，利用酶或其他分子标记的抗体来对组织进行特定分析的技术。
这种技术可以应用于抗体定性、半定量和全定量测定。
三、应用通过免疫组织化学技术，可以对各种组织进行检查。
例如，可以用来检查肿瘤细胞，对具体癌细胞和癌细胞分子进行定位和识别。
除此之外，免疫组织化学技术还可以用于疾病的诊断和治疗。
例如，对于免疫性关节炎，可以通过对炎症反应区域进行研究发现疾病过程中先后发生的变化，从而掌握疾病过程，为提高治疗效果提供依据。
同时，通过免疫组织化学技术可以对新的治疗方法进行评估。
例如，对药物的抑制和消灭癌细胞和癌细胞分子进行研究，有助于设计合适的治疗方案。
总之，免疫组织化学技术是一种非常强大的工具，能够帮助人们更好地理解生物学、医学等领域的疾病过程，并且有助于评估治疗方案和开发新药物。
免疫组织化学
免疫组织化学简介免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
主要过程免疫组织化学的全过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的相关操作免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
免疫组化技术近年来得到迅速发展。
50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。
仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。
b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术
免疫组织化学(immunohistochemistry)，也称免疫细胞化学(immunocytochemistry)，是由免疫学和传统的组织化学方法相结合发展形成的研究方法，能定位、定性或定量检测组织切片上的特殊蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体、病原体等。
利用抗原与抗体能特异性结合的原理，用标记的抗体(或抗原)与组织或细胞中的特定抗原(或抗体)结合，形成带有标记物的抗原抗体复合物。
通过普通显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察标记物，从而证明这些抗体或抗原物质在组织细胞内的分布。
根据标记物的不同，免疫组织化学染色可分为免疫荧光组织化学技术、免疫酶组织化学技术、亲和免疫组织化学技术、免疫金银及铁蛋白标记技术等。
免疫组织化学方法将形态学改变与功能和代谢结合起来，既保持了传统形态学对组织和细胞的客观、细致形态观察的优点，又克服了生物化学、免疫学反应只能定性和定量不能定位的缺点，已成为生物医学各学科领域的重要研究手段。
在生物学、医学等领域的研究和诊断中日以显出巨大的实用价值，尤其在肿瘤病理学中已成为常规的诊断方法。
标记在抗体上的荧光素
荧光素标记的羊抗兔IgG (间接荧光抗体)
兔抗人角蛋白的IgG(特异性抗体)
人组织细胞中的抗原(如角蛋白)
直接法间接法
免疫荧光组织化学方法示意图
组织切片的免疫酶组织化学染色培养细胞的亲和免疫组织化学染色
免疫荧光染色免疫荧光染色
(兰色为细胞核，红色为角蛋白) (兰色为细胞核，绿色为上皮膜抗原)。
免疫组织化学技术的特点
免疫组织化学技术的特点免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究方法。
这一技术在生物学、医学等领域发挥着重要作用，具有诸多显著的特点。
首先，免疫组织化学技术具有高度的特异性。
这是因为抗体与抗原的结合是高度特异性的，就像一把钥匙开一把锁。
每种抗体只会与特定的抗原结合，从而能够准确地识别和定位目标分子。
例如，在肿瘤诊断中，针对特定肿瘤标志物的抗体能够精确地识别肿瘤细胞中相应的抗原，帮助医生判断肿瘤的类型和分期。
这种特异性使得免疫组织化学技术能够在复杂的组织环境中准确地检测到目标分子，减少了假阳性和假阴性结果的出现。
其次，免疫组织化学技术具有较高的敏感性。
即使目标抗原在组织中的含量很低，通过使用高亲和力的抗体和灵敏的检测系统，也能够被检测到。
这对于早期疾病的诊断和微量生物标志物的检测尤为重要。
例如，在某些神经退行性疾病的早期阶段，相关蛋白的表达水平可能仅有轻微的变化，但免疫组织化学技术能够敏锐地捕捉到这些细微的变化，为疾病的早期诊断提供依据。
再者，免疫组织化学技术能够实现原位检测。
这意味着可以在组织细胞的原有位置上观察抗原的分布和定位。
相比于其他一些检测方法需要将组织细胞破碎提取成分进行分析，原位检测能够更好地保留组织的形态结构和细胞之间的关系。
这对于研究细胞的功能、细胞之间的相互作用以及疾病的病理机制具有重要意义。
比如，在研究肾脏疾病时，可以通过免疫组织化学技术观察特定蛋白在肾小球、肾小管等部位的分布情况，从而深入了解疾病对肾脏结构和功能的影响。
此外，免疫组织化学技术还具有多标记能力。
可以同时使用多种不同的抗体标记不同的抗原，从而在同一张切片上同时检测多个目标分子。
这有助于更全面地了解组织细胞的生理和病理状态。
例如，在研究肿瘤微环境时，可以同时标记肿瘤细胞标志物、免疫细胞标志物以及细胞外基质成分，从而综合分析肿瘤与周围微环境的相互作用。
免疫组化医学知识专题讲座
形态、功能和代谢三结合
缺陷：干扰多，易出现假阳性
四、免疫组织化学染色操作环节
（一） 组织处理与切片选择 （二）免疫染色旳前处理
试剂准备（示踪，放大，标识） 消化 阻断 *（三）免疫组化染色 原理、优缺陷、流程 （四）免疫染色旳后处理 增强、衬染、封固
*（五）成果判断与对照设置 措施众多 敏感不同 程序雷同 按需选用
关键环节：特异抗体-----桥联抗体----标识抗体种系必需匹配
（第一抗体）（第二抗体）（第三抗体）
第一节 抗原和抗体
一、抗原：
凡能刺激机体产生特异性免疫应答（免 疫原性），并能与相应免疫应答物（抗
体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特
免 疫 试 剂 ， 自 1975 年 Kohler 和
Milstein发明了单克隆抗体制备旳杂交瘤 技术后，已从采用多克隆抗体转入了广泛 应用单克隆抗体时代。目前商品供给旳特 异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多数 都为单克隆抗体。
三、技术特点（优点）
1.特异性强 2.敏感性高 3.定位精确 量
4.三位一体
远离半抗原旳抗原决定簇； 高结合率（结合半抗原数目至少20个以上）
抗原决定簇(表位)：抗原分子中决
定抗原特异性旳活性化学基团，其性
质、数量、空间构型决定抗原旳特异性。
---免疫组化旳精确性、特异性
交叉反应：抗原（或抗体）除与其
相应抗体（或抗原）特异结合外， 有时可与其他抗体（或抗原）发生 反应。
免疫组化医学知识专 题讲座
学习本章节旳总体要求
*1. 熟悉免疫组织化学技术特点及其原理 *2.掌握免疫组织化学染色旳操作流 程 *3.熟悉免疫化学反应有关术语及其所用免疫试 剂旳起源和质量控制 4.了解多克隆抗体制备程序与操作要求 5.了解单克隆抗体制备原理和环节
免疫组织化学技术
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L）,就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
免疫组织化学
内室温孵育15～25min，然后吸去孵育液，
不冲洗。（封闭）
5）滴加PBS适当稀释的第一抗体，湿
盒内孵育，或4℃过夜，或室温2～4h。 6）PBS充分冲洗，3次，2min
7）滴加适当稀释的酶标第二抗体， 湿盒内孵育45～60min（室温或37℃）。
8）PBS漂洗，3次，2min。漂洗后，
冰冻切片可用福尔马林固定，固定后再
0.1mol／L Tris－HCl缓冲液（pH8.3）,
用前加入坚牢红TR盐（1mg／ml）。切片
入此液，室温10～15min。取出后用Tris －HCl缓冲液洗净。
10）将切片置流水中终止呈色反应。
11）按需要可进行甲绿或苏木精复染
细胞核。
12）DAB显色标本可经脱水、透明、
树胶封固。其它显色反应用水溶性介质
为抗原制得，其分子量为 HRP的 2～3
倍，比较稳定，内源性 ALP较易清除，
常用于免疫组织化学染色。
2．胶体金标记
其标记就是蛋白质吸附并结合在金颗 粒表面的过程，是由于金颗粒表面带负电 荷和蛋白质表面所带正电荷有静电吸引， 这种吸附取决于pH值，pH值也与胶体金的
聚合状态有关。胶体金标记蛋白（抗体）
所谓抗体标记技术，即利用荧光素或酶或 重金属颗粒使之结合于抗体分子上。
利用双价或多价结合力的物质，如植 物血凝素、生物素－亲和素等，一方面与 标记物（如荧光素、酶等）结合，另一方 面又可与细胞组织内某种物质（如抗体） 结合，这种利用一种物质对组织内某一成 分亲和能力发展起来的技术，即称亲和免 疫组织化学（affinity immunohistochemistry）。
一、抗体的保存
①冷冻干燥；
②添加防腐剂或保护剂；
《免疫学》免疫组织化学的应用ppt课件
05
免疫组织化学的优缺点与展望
优点
高特异性
免疫组织化学技术能够针对特 定的抗原进行高特异性识别，
减少非特异性染色。
高灵敏度
通过使用酶或其他标记物，可 以检测到极低浓度的抗原，提 高检测灵敏度。
定位准确
通过标记特定抗体，可以精确 定位抗原在组织中的位置，有 助于疾病的诊断和病理研究。
多参数同时检测
《免疫学》免疫组织 化学的应用ppt课件
contents
目录
• 免疫组织化学概述 • 免疫组织化学的基本原理 • 免疫组织化学在病理诊断中的应用 • 免疫组织化学在研究中的应用 • 免疫组织化学的优缺点与展望
01
免疫组织化学概述
定义与特点
定义
免疫组织化学是一种利用抗原-抗体 反应原理，通过标记抗体来检测和定 位组织或细胞内特定抗原物质的技术 。
成本较高
需要针对不同的抗原制备特定的抗体 ，因此成本较高。
展望与未来发展方向
优化技术流程
多技术联合应用
通过改进实验流程和缩短实验时间，提高 实验效率和准确性。
将免疫组织化学与其他技术如基因测序、 蛋白质组学等相结合，以更全面地了解组 织样本中的分子表达情况。
自动化与标准化
临床应用拓展
开发自动化免疫组织化学分析系统，实现 标准化操作，减少人为误差。
20世纪80年代
建立了免疫酶标技术，提高了检测的灵敏度 和特异性。
20世纪70年代
建立了免疫荧光技术，成为最早的免疫组织 化学技术。
20世纪90年代至今
免疫组织化学技术不断改进和完善，应用范 围不断扩大。
02
免疫组织化学的基本原理
抗原-抗体反应
抗原和抗体结合的特异性
免疫组织化学的定义
免疫组织化学的定义
免疫组织化学，简称免疫组化，是病理诊断中的一种检测方法。
它应用免疫学的基本原理，即抗原抗体反应，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，来确定组织细胞内的抗原，并对这些抗原进行定位、定性及相对定量的研究。
免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确等优点，被广泛应用于临床病理诊断、法医学鉴定以及生物学和医学基础研究等领域。
在病理诊断中，免疫组织化学技术主要用于协助疾病的诊断和鉴别诊断。
例如，对于肺癌，通过免疫组化可以检测到癌细胞是否表达某些特定的肿瘤标志物，从而帮助医生判断肺癌的类型和恶性程度。
同时，免疫组化技术还可以用于判断肿瘤的来源，例如通过检测癌细胞表面的某些糖蛋白或糖脂来鉴别肿瘤是来自消化系统还是泌尿系统。
在法医学鉴定中，免疫组织化学技术常用于检测生物样本中的毒品、药物等物质，以协助司法机关进行犯罪调查和审判。
此外，免疫组织化学技术还被广泛应用于生物学和医学基础研究中，例如研究细胞生长、发育、分化等过程中的基因表达和调控机制，以及研究肿瘤发生、发展过程中的基因变异和信号转导机制等。
总之，免疫组织化学技术在医学领域中发挥着重要作用，为疾病诊断和治疗提供了重要的依据和支持。
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免疫组织化学的基本知识1 免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
2 免疫组化实验所用的抗体有哪些？免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
单克隆抗体是一个B 淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。
多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B 淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
3 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，细胞标本包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
4 石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC 染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
5 免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
6 抗体交叉反应的原因指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。
产生的原因有以下几个方面：1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。
任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。
2. 共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。
3. 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。
当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。
免疫细胞化学技术、免疫细胞化学技术的概述* 免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC） -是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定细胞内抗原的成分（主要是多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为〜。
（一）对抗原和抗体的要求*具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
-对抗体的要求：纯度高、比活性强；*高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。
-对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。
（二）抗原（antigen, Ag）*抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和（或）细胞免疫反应的物质，称为抗原。
抗原具有两个方面的特性：-免疫原性：引起机体产生抗体和（或）致敏淋细胞的特性；-免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
*根据抗原是否显示免疫原性分为：-完全抗原：分子量较大，一般在10kDa 以上，并具有较复杂的化学组成。
*免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
-半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。
例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
*半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载体*通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH) 、牛血清白蛋白(bovine Serum albumin, BSA)、卵白蛋白(OVaIbumin , OVA)等。
-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH 等将半抗原结合到载体上。
结合比例为5kDa结合5〜25个分子的小肽。
(三)抗体(antibody, Ab)1、抗体的概念：* 机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。
-抗体主要存在于血清内；-抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、IgD J gE、IgA、IgM。
2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。
*单克隆抗体：是一个B 淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的-特异性强、抗体产量高。
*多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B 淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
-特异性低，会产生抗体的交叉反应。
-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。
-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备*动物的选择* 佐剂(adjuvant)*免疫方法* 免疫剂量*抗体效价的测定*放血或定期抽血免疫组化常见问题及解决方法当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。
比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM 一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM (不是IgG)二抗。
④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
⑤检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8C条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
⑥检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
⑦检查色原/ 底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。
需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH 值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
⑨检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。
弱阳性如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：①标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
②不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
③抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/ 时间是否正确。
一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
④切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
⑤孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
非特异性染色①是否有效地去除了内源性酶和生物素。
应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。
处理的方法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg∕m1）加入底物液中，并保持pH 值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol∕L 的酒石酸抑制。
饱和处理内源性生物素：消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。
具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug∕ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。
②是否选择使用了正确的封闭血清。
电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。
有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。
另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。
最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。
③所选择的抗体是否符合试验要求。
因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
④一抗的使用浓度是否过高。
⑤清洗是否充分。
应严格操作规程。
因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol∕l Tris—HCl，0.15mol∕l NaCl 已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。
特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
⑥DBA 的使用是否正确。
DAB 的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB 试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH 值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB 溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。
另外，DAB 保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB 保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。
孵育时间过长也会造成背景染色。
⑦标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。
⑧检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
抗体的保存抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低( 10-100Mg/L )，就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4C -8C条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20C条件下，并避免反复冻融。