第二章基因工程制药part
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第二章基因工程制药新版3
第二章基因工程制药新版3
（3）化学合成法的实例
讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产 物的基因。主要有以下种类：
细菌酪氨酸t-RNA 人生长激素 α干扰素 γ干扰素 血管紧张素 人胰岛素 人生长激素抑制释放因子 溶菌酶 组织血纤维蛋白溶酶原激活剂
第二章基因工程制药新版3
3、逆转录法
（1）逆转录法的理由 （2）逆转录法的理论依据 （3）逆转录所产生的DNA的特性 （4）逆转录法的具体步骤 （5）逆转录法的实例
表达型----是指重组后插入的cDNA能够经过转录、翻译，最 终合成蛋白质。
非表达型----是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译， 合成蛋白质。
表达型 非表达型
质粒 PUC pBR322
噬菌体 λgt11 λgt10
第二章基因工程制药新版3
•（D2）、cDNA的片段与载体的连 接
（1）借助同型多聚体尾巴的连接方法----用3-末端脱氧核 苷酸转移酶催化，在cDNA的3’末端加上polyG（或者 polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者 polyA） 的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。
经过2-3次寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素柱 之后，就可得到较高纯度的mRNA。
第二章基因工程制药新版3
• mRNA的分 离
•Oligo-dT纤维素柱
•O第二li章g基o因-工d程制T药磁新版珠3 法
•B、cDNA第一链的合成
由于mRNA的3’端常含polyA，所以可用寡聚 脱氧胸腺苷酸Oligo dT做引物，在逆转录酶催 化下，合成cDNA。
第二章基因工程制药新版3
•（2）逆转录法的理论依据
逆转录法就是从 mRNA→cDNA→DNA→mRNA→Protein的方 法。
（3）化学合成法的实例
讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产 物的基因。主要有以下种类：
细菌酪氨酸t-RNA 人生长激素 α干扰素 γ干扰素 血管紧张素 人胰岛素 人生长激素抑制释放因子 溶菌酶 组织血纤维蛋白溶酶原激活剂
第二章基因工程制药新版3
3、逆转录法
（1）逆转录法的理由 （2）逆转录法的理论依据 （3）逆转录所产生的DNA的特性 （4）逆转录法的具体步骤 （5）逆转录法的实例
表达型----是指重组后插入的cDNA能够经过转录、翻译，最 终合成蛋白质。
非表达型----是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译， 合成蛋白质。
表达型 非表达型
质粒 PUC pBR322
噬菌体 λgt11 λgt10
第二章基因工程制药新版3
•（D2）、cDNA的片段与载体的连 接
（1）借助同型多聚体尾巴的连接方法----用3-末端脱氧核 苷酸转移酶催化，在cDNA的3’末端加上polyG（或者 polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者 polyA） 的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。
经过2-3次寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素柱 之后，就可得到较高纯度的mRNA。
第二章基因工程制药新版3
• mRNA的分 离
•Oligo-dT纤维素柱
•O第二li章g基o因-工d程制T药磁新版珠3 法
•B、cDNA第一链的合成
由于mRNA的3’端常含polyA，所以可用寡聚 脱氧胸腺苷酸Oligo dT做引物，在逆转录酶催 化下，合成cDNA。
第二章基因工程制药新版3
•（2）逆转录法的理论依据
逆转录法就是从 mRNA→cDNA→DNA→mRNA→Protein的方 法。
《基因工程制药》PPT课件
医学PPT
21
一、反转录法
反转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的 克隆表达。
cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内 含子。
cDNA:真核基因经过转录后,经过剪切、拼 接、修饰形成的成熟的mRNA，mRNA反转录的 结果为cDNA。
医学PPT
22
第一个合成蛋白质的国家。
医学PPT
10
基因工程药物种类
基因工程技术可生产的药物和制剂包括: (1)免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体; (2)细胞因子,如各种干扰素,白细胞介素,集
落刺激生长因子,表皮生长因子,凝血因子; (3)激素,如胰岛素,生长激素,心素纳; (4)酶类,如尿激酶,链激酶,葡激酶,组织型纤
50%!
医学PPT
8
20世纪70年代基因工程诞生最先应 用在医药科学领域。
1982年第一个基因工程产品--人胰 岛素在美国问世。
优点:大量生产、应用临床、深入研 究、扩大应用。
医学PPT
9
结晶牛胰岛素：1965年9月17日，中国首次人 工合成结晶牛胰岛素。这是当时人工合成的具有 生物活力的最大的天然有机化合物，使中国成为
维蛋白溶酶原激活剂,超氧化物歧化酶.
医学PPT
11
基因工程药物：采用基因工程技术研制的， 能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以 用传统方法制取的特殊药物。
医学PPT
12
第二节 基因工程药物生产的基本过程
基因工程技术是将重组对象的目的 基因插入载体，拼接后转入新的宿主细 胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗 传物质的重新组合，并使目的基因在工 程菌内进行复制和表达的技术。
除菌过滤
第二章基因工程制药part2
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•大肠杆菌表面表达技术的建立 •膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点 •领域，膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面技术的 •建立。 •外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于 •制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程 •度上能与噬菌体展示系统相媲美。
• ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
mRNA翻译效率较高。
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
• 核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。 • 尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。 •
采用较弱的启动子或部分诱导强启动子的方法可降 低蛋白质合成的速率，从而达到增加正确折叠重组蛋白质 的目的。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
改造信号肽的序列和结构，提高分泌效率
• 比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酯酶基因phoA信 •号肽的疏水区置换为多聚Leu残基能明显提高分泌效率。 表 •明信号肽核心部位疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互 作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好 参考依据。
•
大肠杆菌高密度发酵时大规模制备蛋白质过程中
不
• 可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因
的
• 表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数
量
• 的成倍增加来实现总表达量的提高。
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•大肠杆菌表面表达技术的建立 •膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点 •领域，膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面技术的 •建立。 •外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于 •制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程 •度上能与噬菌体展示系统相媲美。
• ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
mRNA翻译效率较高。
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
• 核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。 • 尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。 •
采用较弱的启动子或部分诱导强启动子的方法可降 低蛋白质合成的速率，从而达到增加正确折叠重组蛋白质 的目的。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
改造信号肽的序列和结构，提高分泌效率
• 比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酯酶基因phoA信 •号肽的疏水区置换为多聚Leu残基能明显提高分泌效率。 表 •明信号肽核心部位疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互 作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好 参考依据。
•
大肠杆菌高密度发酵时大规模制备蛋白质过程中
不
• 可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因
的
• 表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数
量
• 的成倍增加来实现总表达量的提高。
第二章 基因工程制药.ppt
2019-10-13
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五、重组蛋白质的分离纯化
1. 离子交换层析：
是以离子交换剂为固定相， 依据流动相中的组分离子与交换 剂上的平衡离子进行可逆交换时 的结合力大小的差别而进行分离 的一种层析方法。
6. 降低成本，提高产品质量。
2019-10-13
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二、基因工程药物生产的基本过程
1. 目的基因的获得 2. 构建DNA重组体 上游技术 3. 构建工程菌 4. 工程菌的发酵 5. 外源基因表达产物的分离纯化 6.产品的检验
2019-10-13
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2019-10-13
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1．小分子量的蛋白或多肽 2．已知核苷酸顺序或氨基酸顺序 3．费用较高
2019-10-13
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V第it三a节m基in因表B达2
基因表达的成败，直接影响药品的质量、成本。基因表达是外 源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程，是外源基因异源转录 翻译利用宿主功能的过程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞 进攻，保护自身的过程。
2019-10-13
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Vitamin A
2019-10-13
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第二节 目的基因的获得
一、 反转录法 二、化学合成法
2019-10-13
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一、反转录法
1．mRNA的纯化
（1）选择表达目的蛋白质丰度高的 mRNA的生物材料。
（2）分离总RNA。 （3）分离mRNA（多聚T纤维素）
三、国内外基因工程药物研究进展
目前研制的基因工程药物主要包括: 1. 免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体; 2. 细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子
生物技术制药-第二章-基因工程制药(201309-201401-2)
7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
cDNA克隆示意图
mRNA
逆转录酶
ss-DNA
DNA聚合酶I Klenow片段
ds-cDNA 核酸酶S1
ds-cDNA
二、逆转录－聚合酶链反应法（RT-PCR）
1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。
特异引物 mRNA 逆转录酶 ss-DNA PCR 目的cDNA链
优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养 液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。 缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费 用高，培养液浓度稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 表达载体必须具备的条件
（1）载体能独立地进行复制 (复制起点，ori)
（2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记
核酸酶S1
第三节 目的基因的获得
克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合 成法。（不能直接分离？）
一、逆转录法
逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再 反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。
逆转录法的步骤
1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆
利用基因工程技术生产药品的优点：
（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋 白和多肽； （2）可以提供足够数量的生理活性物质；
（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的
内源性生理活性物质；
（4）基因工程和蛋白质工程进行改造和去除 内源性生理活性物质的不足之处。 （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，
又分为普通表达载体和精确表达载体
第二章基因工程制药新版2
（三）基因工程载体的种类
1、细菌质粒 2、真核基因病毒DNA 3、λ噬菌体DNA 4、单链DNA噬菌体M13载体 5、人工质粒载体----科斯质粒 6、酵母人工染色体 7、其他载体
1、细菌质粒
（1）质粒的定义 （2）质粒的特性 （3）质粒的分类 （4）质粒载体的具备条件 （5）常用的细菌质粒
（1）质粒的定义
质粒载体(plasmid)
存在于天然细菌体内 的一种独立于细菌 染色体之外的双链 环状DNA，具有独 立复制的能力，常 带有细菌的抗药基 因。也存在于某些 真核细胞（酵母的 2μ环状质粒）
（2）质粒的特性
独立于细菌染色体之外的环状DNA或RNA。 其遗传特性属于非染色体控制。 能够进行自我复制。 容易在宿主体内进行转移和迁移。
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
（3）质粒的分类
F质粒----可使宿主A的部分基因随着F质粒一起 转移到不存在该质粒的另一宿主B的体内。
R质粒----可编码宿主A的一种或者数种抗生素抗 性基因，并能够将它们带到不存在该质粒的另 一宿主B的体内，使得宿主B也获得同样的抗性。
（A2）、SV40病毒DNA的基因 组
（A3）、SV40病毒DNA载体的 构建
（A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法
[G]、腺病毒
（G1）、腺病毒DNA载体 （G2）、腺病毒DNA载体的特
点
3、λ噬菌体DNA
（1） λ噬菌体DNA的特性 （2） λ噬菌体DNA的改造 （3） λ噬菌体DNA的体外包装 （4） λ噬菌体载体的构建 （5） λ噬菌体载体的使用 （6） λ噬菌体载体的优点
基因工程制药技术 基因工程常用工具
Part2 基因工程操作工具
三、基因载体2、载体选择标准能自主复制具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定有克隆位点（外源DNA插入点）即多个单一酶切位点分子量小，以容纳较大的外源DNA3、常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA
Part2 基因工程操作工具
三、基因载体（1）质粒DNA存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子具有自我复制功能（松弛、严紧）带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点
Part2 基因工程操作工具
二、DNA连接酶2、不同的DNA连接酶对比
连接酶
底物
辅助因子和激活因子
温度
巯基试剂
黏性末端
平末端
DNA-RNA杂合体
RNA-RNA杂合体
大肠杆菌DNA连接酶
可行
可行
不行
不行
NAD+，Mg2+（1~3mmol/L）
黏性末端：10~15 ℃补平缺口：37 ℃
无
T4DNA连接酶
生化制药工艺
项目五 基因工程制药
1
基因工程的概念
2
基因工程操作工具
3
基因工程操作流程
目ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ录
CONTENTS
基因工程常用工具
02
Part2 基因工程操作工具
一、基因工程操作工具1、基因工程操作要求基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是无法进行的。2、基因工程操作工具“分子手术刀”----限制性核酸内切酶 “分子缝合针” ---- DNA连接酶 “分子运输车” ----载体
Part2 基因工程操作工具
二、限制性内切酶1、工具酶
工 具 酶
功 能
三、基因载体2、载体选择标准能自主复制具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定有克隆位点（外源DNA插入点）即多个单一酶切位点分子量小，以容纳较大的外源DNA3、常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA
Part2 基因工程操作工具
三、基因载体（1）质粒DNA存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子具有自我复制功能（松弛、严紧）带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点
Part2 基因工程操作工具
二、DNA连接酶2、不同的DNA连接酶对比
连接酶
底物
辅助因子和激活因子
温度
巯基试剂
黏性末端
平末端
DNA-RNA杂合体
RNA-RNA杂合体
大肠杆菌DNA连接酶
可行
可行
不行
不行
NAD+，Mg2+（1~3mmol/L）
黏性末端：10~15 ℃补平缺口：37 ℃
无
T4DNA连接酶
生化制药工艺
项目五 基因工程制药
1
基因工程的概念
2
基因工程操作工具
3
基因工程操作流程
目ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ录
CONTENTS
基因工程常用工具
02
Part2 基因工程操作工具
一、基因工程操作工具1、基因工程操作要求基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是无法进行的。2、基因工程操作工具“分子手术刀”----限制性核酸内切酶 “分子缝合针” ---- DNA连接酶 “分子运输车” ----载体
Part2 基因工程操作工具
二、限制性内切酶1、工具酶
工 具 酶
功 能
第二章基因工程制药part1
2019/9/16
9
一、概 述
基因工程技术的特点
1. 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床 使用提供有效的保障；
2. 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结 构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；
3. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物 质；
白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因分离、纯
化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最
后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖，
并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白
质，通过这种方法生产的新型药物。
2019/9/16
3
一、概 述---几个概念
基因工程药物上游阶段？
主要是分离目的基因、构建工程菌（细胞）目的 基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基 因表达主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次 是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在 实验室内完成。
2019/9化/16 控制等。
5
一、概 述
制备基因工程药物的一般程序
获得目的基因 组建重组质粒
构建基因工程菌（或细菌）
培养工程菌
除菌过滤
半成品检定
2019/9/16
包装
6
一、概 述
传统制药存在的问题
1. 许多在疾病诊断、预防和治疗中有重要价值的内
源性活性物质（如激素、细胞因子、神经多肽、调
节蛋白、酶类等人体活性多肽）以及某些疫苗，由
2019/9/16
4
一、概 述---几个概念
基因工程药物下游阶段？
从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质
量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，
基因工程制药2课件
（4）大肠杆菌中不存在翻译后的修饰系统，不能对 蛋白质产物进行糖基化. （5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白质造成破坏。 （6）大肠杆菌会产生内毒素，难以除去。
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
生物制药--基因工程制药--ppt课件可编辑全文
组建重组质粒 构建基因工程菌或细胞
前5个步骤是上游过程
培养工程菌
后4个步骤是下游过程
产物分离纯化
除菌过滤
半成品和成品鉴定
包装
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
• 从真核细胞中提取产生该蛋白质的 mRNA 并纯化 （oligo-dT 亲和层析法）
• 借助于逆转录酶，以 mRNA 为模板，以 oligo-dT 为引物， 进行第一链 cDNA 的合成
• 酶解除去 mRNA 链； • 通常在合成 cDNA 第一链后直接 PCR 扩增，即“逆转录
－PCR法”
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
从基因组中直接分离
• 随机断裂法：将基因组 DNA 用内切酶切成多个片段，然 后将这些片段混合物随机重组入适当载体、转化、扩增， 再筛选出所需的基因片段
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
质粒载体 —— pET-32a(+)
E. coli 中表达的优良载 体。
pET-32a(+) 具有 Ampr 抗性，酶切位点丰富。含 T7lac 启动子；含有 T7.Tag 和 His-Tag 融合标签，便于 检测和纯化目标蛋白。
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
Escherichia coli Rye13
Hae III G GCC
Haemophilus aegyptius
Hind III A AGCTT
Haemophilus influenzae
Hpa I GTT AAC（平末端）
Haemophilus parainfluenzae
生物制药技术-第二章-基因工程制药(1,2,3,4小节)
Richard Young和Ronald Davis设计的λgtl0和 λgtDNA便十 分有效地产生许多克隆，每纳克cDNA可产生 5000个克隆，另方面可容纳较大相对分子质量 的外源DNA片段。由于噬菌斑的筛选和操作较 筛选细菌主中，λgtl0载体对于未携带cDNA的噬菌体的 裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA 插 入到λgtl0可使噬菌体阻遏物基因(c 1)失活。
1. MRNA的纯化
反转录法的前提是必须首先得到该目的基因的mRNA，而要 分离纯化目的基因的mRNA，其难度几乎不亚于分离目的基 因。细胞内含有3种以上RNA，mRNA占细胞内RNA总量的 2%~5%，相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个核苷 酸组成。在真核细胞中mRNA的3'末端常含有一多聚腺苷酸 （polyA)组 成的末端，长达20~250个腺苷酸，足以吸附于寡 聚脱氧腺苷酸Oligo(dt)-纤维素上，可以用亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。利用mRNA的3'末端含有polyA的 特点，在RNA流经寡聚（dt）纤维素柱时，在高盐缓冲液的 作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度 洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被i洗脱下来， 经过两次寡聚(dt)纤维素往后，可得到较高纯度的mRNA。
我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差。 20 世纪70年代末以来，开始应用 DNA重组技术、淋 巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开 发新产品和改造传统制药工艺。几十年来，在国家 汁划，特别是国家"863"高技术计划的优先支持下， 使这一领域迅速发展，缩短了我国与世界先进国家 的差距。"863"高技术计划在生物技术领域内研究的 三个主题之一是新型药物、疫苗与基因治疗，重点 是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生 产的医药产品，如肝炎、肿瘤、传染病和心脑血管 疾病预防、诊断和治疗的生物技术医药产品。
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高效表达目标基因的战略和技术
表达质粒的优化和设计 共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA基因 提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性 高密度发酵和工程化宿主细胞
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
在各种表达载体中，启动子和SD序列的下游都设计了一 段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插 入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的 一部分，因此它对构建高效表达质粒是至关重要的。 由于每一个基因都具备各自独特的5‘端结构，最终构建成 的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。
菌细胞内稀有密码子tRNA的丰度。
第二章基因工程制药part
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
在所有的大肠杆菌稀有密码子tRNA中，tRNA Arg （AGG/AGA）含量最少，而AGG和AGA密码子在真核基 因中经常出现。
人尿激酶原 ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂NTA 等基因中都含有较多的 AGG 和 AGA 密码子，在大肠杆 菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达 tRNA Arg（AGG/AGA）基因argU后，这些基因的表达水平能 明显得到提高。
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征 和特点，注意引入翻译增强子序列
能提高mRNA翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻 译增强子。
第二章基因工程制药part
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因
现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有： 编码 Arg 的密码子 AGA、AGG、CGA、CGG 编码 Pro 的密码子 CCC、CCU、CCA 编码 Cys 的密码子 UGU、UGC 编码 Gly 的密码子 GGA、GGG 编码 Leu 的密码子 CUA、CUC 编码 IIe 的密码子 AUA 编码 Ser 的密码子 UCA、AUG、UCG、UCC 编码 Thr 的密码子 ACA
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
具体表现为： SD序列UAAGGAGG的翻译效率要比AAGGA高3~6
倍。 翻译起始密码ATG与UAAGGAGG的最适距离是6~8
个碱基长度，与AAGAA的最适距离是5~7个碱基长度。 ATG与UAAGGAGG至少相隔3~4个碱基，与
AAGAA至少相隔5个碱基mRNA的翻译才能进行。 ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
在细胞内有多肽碎片、突变的异常蛋白和外界物理 因素的刺激的条件下，大肠杆菌细胞内的蛋白质水解酶 活力往往能达到比较高的水平。
第二章基因工程制药part
提高目标蛋白的稳定性的措施
1. 利用蛋白转运系统把目标蛋白最终积累在周质空间， 或分泌到培养基
2. 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。 3. 对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
在必要的情况下，还可通过顶点突变，PCR等技术 改变个别关键的碱基来破坏mRNA 5‘端的“茎环”结构。
把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身 的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因， 一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因5’端 序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下。
第二章基因工程制药part
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在 是否确实会对翻译过程产生明显的不利影响。因为稀有 密码子存在的位置、分布的均匀性、mRNA的二级结构 的不同决定了它对翻译是有差别的。所有的结论要通过 实验才能得出。
由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌 中的核酸酶和蛋白质水解酶能够降解目标基因 mRNA 和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋 白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。
mRNA翻译效率较高。
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。
尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T碱 基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可能 性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。
第二章基因工程制药part
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度 有正比关系，稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在 翻译过程中发生中止和移码突变。
解决这一问题的办法： 通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率的同义密
码子。 在表达系统中共表达稀有密码子tRNA基因，以提高大肠杆
达。 4. 共表达能提高特定目标稳定性的辅助因子，如分子伴
侣基因。 5. 对蛋白质序列中的蛋白质水解酶敏感区域和识别位点
进行改造。 6. 在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。
第二章基因工程制药part
但必须指出的是，由于目标蛋白本身的性质和用途的 不同，上述几种方法在使用上是受到一定的限制的。主要 表现为： • 大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的转运和分泌效率
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始 密码ATG与SD序列之间的距离和碱基组成处于一个适当 的范围。
核糖体结合位点序列的变化对mRNA的翻译效率有 显著影响，
第二章基因工程制药part
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
蛋，目标蛋白在 细胞质中最容易受到蛋白水解酶的作用。
通过对已知大肠杆菌细胞内半衰期的蛋白质的统计 学分析，发现N末端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp 残基的蛋白质，含有Pro、Glu、Ser、Thr丰富区的蛋白 质降解，稳定性较差。
一般比较低，不能满足大规模制备的需要。 • 蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速度
表达质粒的优化和设计 共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA基因 提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性 高密度发酵和工程化宿主细胞
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
在各种表达载体中，启动子和SD序列的下游都设计了一 段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插 入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的 一部分，因此它对构建高效表达质粒是至关重要的。 由于每一个基因都具备各自独特的5‘端结构，最终构建成 的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。
菌细胞内稀有密码子tRNA的丰度。
第二章基因工程制药part
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
在所有的大肠杆菌稀有密码子tRNA中，tRNA Arg （AGG/AGA）含量最少，而AGG和AGA密码子在真核基 因中经常出现。
人尿激酶原 ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂NTA 等基因中都含有较多的 AGG 和 AGA 密码子，在大肠杆 菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达 tRNA Arg（AGG/AGA）基因argU后，这些基因的表达水平能 明显得到提高。
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征 和特点，注意引入翻译增强子序列
能提高mRNA翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻 译增强子。
第二章基因工程制药part
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因
现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有： 编码 Arg 的密码子 AGA、AGG、CGA、CGG 编码 Pro 的密码子 CCC、CCU、CCA 编码 Cys 的密码子 UGU、UGC 编码 Gly 的密码子 GGA、GGG 编码 Leu 的密码子 CUA、CUC 编码 IIe 的密码子 AUA 编码 Ser 的密码子 UCA、AUG、UCG、UCC 编码 Thr 的密码子 ACA
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
具体表现为： SD序列UAAGGAGG的翻译效率要比AAGGA高3~6
倍。 翻译起始密码ATG与UAAGGAGG的最适距离是6~8
个碱基长度，与AAGAA的最适距离是5~7个碱基长度。 ATG与UAAGGAGG至少相隔3~4个碱基，与
AAGAA至少相隔5个碱基mRNA的翻译才能进行。 ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
在细胞内有多肽碎片、突变的异常蛋白和外界物理 因素的刺激的条件下，大肠杆菌细胞内的蛋白质水解酶 活力往往能达到比较高的水平。
第二章基因工程制药part
提高目标蛋白的稳定性的措施
1. 利用蛋白转运系统把目标蛋白最终积累在周质空间， 或分泌到培养基
2. 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。 3. 对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
在必要的情况下，还可通过顶点突变，PCR等技术 改变个别关键的碱基来破坏mRNA 5‘端的“茎环”结构。
把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身 的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因， 一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因5’端 序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下。
第二章基因工程制药part
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在 是否确实会对翻译过程产生明显的不利影响。因为稀有 密码子存在的位置、分布的均匀性、mRNA的二级结构 的不同决定了它对翻译是有差别的。所有的结论要通过 实验才能得出。
由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌 中的核酸酶和蛋白质水解酶能够降解目标基因 mRNA 和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋 白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。
mRNA翻译效率较高。
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。
尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T碱 基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可能 性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。
第二章基因工程制药part
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度 有正比关系，稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在 翻译过程中发生中止和移码突变。
解决这一问题的办法： 通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率的同义密
码子。 在表达系统中共表达稀有密码子tRNA基因，以提高大肠杆
达。 4. 共表达能提高特定目标稳定性的辅助因子，如分子伴
侣基因。 5. 对蛋白质序列中的蛋白质水解酶敏感区域和识别位点
进行改造。 6. 在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。
第二章基因工程制药part
但必须指出的是，由于目标蛋白本身的性质和用途的 不同，上述几种方法在使用上是受到一定的限制的。主要 表现为： • 大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的转运和分泌效率
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
第二章基因工程制药part
表达质粒的优化和设计
构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始 密码ATG与SD序列之间的距离和碱基组成处于一个适当 的范围。
核糖体结合位点序列的变化对mRNA的翻译效率有 显著影响，
第二章基因工程制药part
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
蛋，目标蛋白在 细胞质中最容易受到蛋白水解酶的作用。
通过对已知大肠杆菌细胞内半衰期的蛋白质的统计 学分析，发现N末端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp 残基的蛋白质，含有Pro、Glu、Ser、Thr丰富区的蛋白 质降解，稳定性较差。
一般比较低，不能满足大规模制备的需要。 • 蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速度