分子光谱分析法
仪器分析-光谱分析法概论(第十章)
三个主要过程：（1）能源提供能量；（2）能量与被测物
质相互作用；（3）产生被检测信号。
第一节
电磁辐射及其物质的相互作用
一、电磁辐射和电磁波谱
1. 波动性（干涉、衍射、反射和折射） 用波长(nm)、波数(cm-1)和频率(Hz)表示。 =c/ = 1 / = /c
波长是在波的传播路线上具有相同振动相位的相邻两点间的线性距
光学分析法光谱分析法非光谱分析法原子光谱分析法分子光谱分析法原子吸收光谱原子发射光谱原子荧光光谱x射线荧光光谱折射法圆二色性法x射线衍射法干涉法旋光法紫外光谱法红外光谱法分子荧光光谱法分子磷光光谱法核磁共振波谱法光谱分析法吸收光谱法发射光谱法原子光谱法分子光谱法原子发射原子吸收原子荧光x射线荧光原子吸收紫外可见红外可见核磁共振紫外可见红外可见分子荧光分子磷光核磁共振化学发光原子发射原子荧光分子荧光分子磷光x射线荧光化学发光第三节光谱分析仪器光学分析法三个基本过程
原 子 发 射
原 子 吸 收
原 子 荧 光
X 射 线 荧 光
紫 外 可 见
红 外 可 见
分 子 荧 光
分 子 磷 光
核 磁 共 振
化 学 发 光
原子光谱法 光谱分析法 吸收光谱法 原 子 吸 收 紫 外 可 见 红 外 可 见 核 磁 共 振
分子光谱法
发射光谱法
原 子 发 射
原 子 荧 光
分 子 荧 光
离；波数是每厘米长度中波的数目； 频率是每秒内的波动次数。
※ 频率与波长成反比, 即波长越长, 频率越低, 波数越小
2. 微粒性（光电效应、光的吸收和发射） 用每个光子具有的能量E作为表征。 E = h =h c / = h c h (普朗克常数) ， h=6.6262×10-34J•s ※ 光量子的能量(E)与波长成反比, 而与频率（或波数） 成正比.
分子发光光谱法
内转换
内转换：同多重度电子能级中，等能级间的无辐 射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子 跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换 外转换：激发分子与溶剂或其他 分子之间产生相互作用而转移能 量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“ 猝灭”。
系间跨越 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非 辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道 耦合进行。
荧光强度对温度变化敏感。
一般地，随温度降低，溶液中荧光物质的量子效率和荧光强
度将增大，并伴随光谱的蓝移。温度增加，碰撞频率增加， 使外转换的去激发几率增加。
(3) pH的影响
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 如苯胺：在pH 5-12溶液中，以分子形式存在，有荧光。
pH< 5时以苯胺阳离子形式存在，无荧光
ex em
（3）可变波长同步扫描荧光法：使两单色器在扫描过程中以 不同的速率同时进行扫描，即波长可变。
同步扫描荧光法的特点：
优点：
（1）使光谱简化； （2）使谱带窄化；
（3）减小光谱的重叠现象；
（4）减小散射光的影响。
例如：采用同步扫描技 术检测如图萘、蒽、菲 、芘混合物，可简化光 谱，减少光谱重叠，提 高分辨率。 缺点： 因为同步扫描荧光损失了 其它光谱带所含的信息， 对光谱学的研究不利。
比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，直接
比较。
三、荧光分析法的应用
可采用直接测定法或间接测定（荧光猝灭）法
1、无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
分子荧光光谱法
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象.
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低 振动能级回到基态所发出的辐射。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。
1~3 ;
荧光分析法的特点
★★★
因应能试
为用提样
有范供用
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
☆振动驰豫 (Vibrational relaxation)
☆荧光发射(Fluorescence)
荧光分析法的应用
无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多 无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量 测定.
生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多 重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用 于生物化学分析,生理医学和临床分析.
药物分析
目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱 和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵 敏度,高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混 合物.
荧光与环境因素的关系
★温度降低会使荧光强度增大； ★PH 带有酸性或碱性取代基的芳 香化合物的荧光与pH有关； ★溶剂 溶剂极性增加有时 会使荧光强度增加，荧光波长红移； 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧 光物质电离状态改变，会使荧光强度 、荧光波长改变；含重原子的溶剂 （碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 ★溶解氧的存在往往使荧光强度 降低。 ★激发光的照射
第二章 光谱分析法导论
26
分子发射
分子发射与分子外层的电子能级、振动能级和转动能 级相关。因此分子发射光谱较原子发射光谱复杂。 为了保持分子的形态，分子的激发不能采用电、热等 极端方式，而采用光激发或化学能激发。 分子发射的电磁辐射基本处于紫外、可见和红外光区 。因此分子主要发射紫外、可见电磁辐射，据此建立 了荧光光谱法、磷光光谱法和化学发光光谱法。 与分子吸收光谱一样，由于相邻两个转动能级之间的 能量差很小，因此由相邻两个转动能级跃迁回同一较 低能级的两个跃迁的能量差也很小，故发射过程所发 射的两个辐射的频率或波长很接近，通常的检测系统 很难分辨出来。而分子能量相近的振动能级又很多， 因此表观上分子发射表现为对特定波长段电磁辐射的27 发射，光谱上表现为连续光谱。
E=（n+1）hv
hv
E=nhv
能量降低
发射(Emission)
物质受到激发而跃迁
到激发态后，由激发态跃迁回到基态时以辐
射的方式释放能量。
能量：光、电、热、化学能等
M → M
M→ M+h
24
发射跃迁可以理解为吸收跃迁相反的过程。由于原子 、分子和离子的基态最稳定，，所以发射跃迁涉及的 是从较高能态向基态的跃迁。 可以通过实验得到发射强度对波长或频率的函数图， 即发射光谱图。 通常情况下，分子、原子和离子处于基态，因此要产 生发射，必须使分子、原子和离子处于激发态，这个 过程称为激发。 激发可以通过提供不同不同形式的能量来实现。包括 三种：1.热能。将试样置于高压交流火花、电弧、火 焰、高温炉体之中，物质以原子、离子形式存在，可 获取热能而处于激发态，并产生紫外、可见或红外辐 射；2.电磁辐射。即用光辐射作用于分子或原子，使 之产生吸收跃迁，并发射分子荧光、分子磷光或原子 荧光；3.化学能。即通过放热的化学反应是反应物或 产物获取化学能而被激发，并产生化学发光。
分子光谱法
2、
跃迁
处于成键轨道上的 电子跃迁到 反键轨道上，称
为
跃迁。
跃迁吸收峰的波长在20nm附近，其特征是吸 收强度大（ ＞104）。
不饱和有机物，如具有
或
、
等基
团的有机化合物都会产生
跃迁。
第八章 分子光谱法
3、
跃迁
含有杂原子的不饱和基团，如C=O、C=S、N=N等化
合物，其未成键轨道中的n电子吸收能量后，向 反
第八章 分子光谱法
三、分子吸收光谱的基本原理 由光吸收定律及光与物质的相互作用可知，任何一种 物质对不同波长的光的吸收程度都是不相同的。
以溶液为例，将各种不同波长的单色光依次通过一定 浓度和液层厚度的某有色溶液，测量每一波长下该有 色溶液对光的吸收程度（即吸光度），然后以波长为 横坐标，以吸光度为纵坐标作图，即可得一曲线。该 曲线称为吸收曲线或吸收光谱。
分子光谱法分为吸收光谱法（如红外吸收光谱法、紫 外及可见吸收光谱法等）、发射光谱法（如荧光光谱 法）及散射光谱法（如拉曼光谱）三种基本类型。
在一般情况下，分子处于基态，当光与物质发生相互作用时，分子 吸收光能，从低能级跃迁到高能级产生吸收光谱。若分子从高能级 回复到低能级则释放出光能，形成发射光谱。散射光谱是光被物质 散射时，分子内能级的跃迁改变散射光频率而产生的。
第八章 分子光谱法
二、分子吸收光谱中的跃迁类型 化合物分子中主要还有三种类型的价电子，即形成单 键的 电子、形成双键或三键的 电子及未成键的n电子 （也称为p电子）。根据分子轨道理论，分子中这三 种电子的成键和反键分子轨道能级高低顺序为：
分子中不同轨道的价电子具有不同的能量，处于较低能级 的价电子吸收一定能量后，可跃迁到较高能级。在紫外可见光区，吸收光谱主要由 跃迁产生。
分子荧光光谱法
荧光光谱 磷光光谱
辐射跃迁只使激发态分子衰变到基态的不同振动 能级，然后通过振动松弛进一步损失能量。
图2 萘的激发光谱I、荧光II和 磷光光谱III
荧光与分子结构的关系
具有大的共轭π键的结构 化合物
ϕF
λex/nm
λem/nm
含有π→π＊跃迁能级的芳 苯
0.11
205
278
香族化合物的荧光最强芳环 蒽
0.29
286
321
越大其荧光峰越移向长波长 萘
0.46
365
400
方向，且荧光长度往往比较
丁省
0.60
390
480
强。
戊省
0.52
580
640
取代基的影响
给电子基团，如-0H、-OR、 -NH2、-CN、-NR2等，使 荧光增强。
分子荧光光谱法
molecular fluorescence analysis
CONTENTS
01 概述/ 02 荧பைடு நூலகம்分析基本原理/ 03 荧光分析仪器 /
04 检测结果与分析/ 05 对比与发展 /
Part 01
概述
overview
原子光谱法 分子光谱法
主要研究内容
The Main Contents Of The Research
系间窜越 isc
03 不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁过 程（例如S1---T1，T1---S0）
内转换
振动弛豫
S2
系间跨越
S1
能
量
光学分析法---分子光谱分析法光学分析法---概述
激光光源
激光光源具有单色性好，方向性强，高亮度及 相干性好等特点。可以大大提高光谱分析的灵 敏度和分辨率。常用的激光器有气体激光器、 固体激光器、染料激光器及半导体激光器。 作为一种新型光源应用于Raman光谱、荧光光 谱、发射光谱、Fourier变换红外光谱等领域。 气体激光器：如氦氖激光器(632.8nm)和氩离 子激光器(514.5nm,488.0nm) 固体激光器：红宝石（掺Cr3+的Al2O3）激光器 (694.3nm)和Nd:YAG(掺钕的钇铝石榴石)激光 器(1064nm)
26
棱镜单色器
棱镜单色器使用棱镜为分光元件。棱镜的作用是把 复合光分解为单色光。由于不同波长的光在同一介 质中具有不同的折射率，波长短的光折射率大，波 长长的光折射率小。因此，平行光经色散后按波长 顺序分解为不同波长的光，经聚焦后在焦面的不同 位置成像，得到按波长展开的光谱。 在400nm ~ 800nm波长范围内，玻璃棱镜比石英棱 镜的色散率大。使用玻璃棱镜更合适。但在200nm ~ 400nm的波长范围内，由于玻璃强烈地吸收紫外 光，无法采用，故只能采用石英棱镜。 由于介质材料的折射率n与入射光的波长有关，因 此棱镜给出的光谱与波长有关，是非均排光谱。
3
原子能级和分子能级
2p 分子的电子能级 2s 分子振动
1s
原子能级
分子能级
分子转动
4
光谱分析法分类
吸收光谱、发射光谱和荧光光谱 电磁波谱与跃迁能量 原子光谱和分子光谱 常用的光学分析法
5
发射光谱法和吸收光谱法
物质通过电致激发、热致激发或光致激发等激发 过程获得能量，变为激发态原子或分子M* ，当从 激发态过渡到低能态或基态时产生发射光谱。 M* M + hv 通过测量物质的发射光谱的波长和强度进行定性 和定量分析的方法叫做发射光谱分析法。 当物质所吸收的电磁辐射能与该物质的原子核、 原子或分子的两个能级间跃迁所需的能量满足△E = hv的关系时，将产生吸收光谱。 M + hv M* 通过测量物质的吸收光谱的波长和强度进行定性 和定量分析的方法叫做吸收光谱分析法。
分子荧光光谱法
菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激
简述光谱分析法的基本原理及应用
简述光谱分析法的基本原理及应用1. 光谱分析法的基本原理光谱分析法是一种利用物质与光的相互作用关系进行分析的方法。
它基于光的波长、频率和强度等特性，通过测量光在物质中的吸收、散射、发射等现象，来推测物质的组成和性质。
光谱分析法的基本原理可以归纳为以下几点：1.1 离散能级原理原子或分子的能级是离散的，当它们受到光的激发时，电子会从低能级跃迁到高能级，吸收了与跃迁能量相等的光的波长或频率。
这种能级跃迁导致了物质对特定波长或频率的光的吸收现象。
1.2 荧光原理某些物质在受到激发后会发出比激发光波长更长的荧光。
这是因为它们的能级结构使得电子从高能级跃迁到低能级时，释放出了能量，产生了荧光现象。
通过测量荧光的强度和波长，可以得到物质的信息。
1.3 散射原理当光通过物质时，会与物质的粒子发生散射现象。
散射光中包含有关物质的信息，通过测量散射光的波长、强度等参数，可以推断物质的成分、粒径等特性。
2. 光谱分析法的应用光谱分析法广泛应用于各个领域，包括但不限于以下几个方面：2.1 化学分析光谱法在化学分析中的应用是最为广泛的。
例如，红外光谱法可以用于物质的结构鉴定、分子振动信息的获取；紫外-可见吸收光谱法可以用于测定物质的浓度、反应动力学等；拉曼光谱法可以分析物质的化学键信息等。
2.2 材料科学光谱分析法在材料科学中也具有重要的应用价值。
例如，X射线衍射技术可以用于材料的晶体结构表征；质谱法可以用于分析材料中的元素含量及其分布情况；光电子能谱技术可以研究材料表面的电子状态等。
2.3 生物医学光谱分析法在生物医学领域的应用也非常丰富。
例如，核磁共振技术（NMR）可以用于研究生物大分子的结构和功能；荧光光谱和红外光谱可以用于检测和鉴定生物标志物；激光诱导击穿光谱（LIBS）可以用于体内光学诊断等。
2.4 环境监测光谱分析法在环境监测中也发挥着重要作用。
例如，光谱法可以用于水质监测，测定水样中的污染物浓度；大气光谱法可以用于探测大气中的悬浮颗粒物和气体成分。
分子光谱分析法资料讲解
强带
有机化合物的紫外与可见吸收光谱中，凡摩尔吸光系数值大于104的 吸收带称为强带。
这种电子跃迁往往是几率很大的允许跃迁。
弱带
有机化合物的紫外与可见吸收光谱中，凡摩尔吸光系数最大值小于 104的吸收带称为弱带。
这类跃迁很可能是不符合允许跃迁选律的禁阻跃迁。
吸收带位置移动的术语说明
无机盐阴离子的n-*跃迁
在许多固体中引起这样一个跃 迁所需要的能量是极高的，但 在另一些固体中，尤其是在包 含重元素的固体中，跃迁发生 在可见／紫外区，材料成为光 电导性的，例如，某些硫族化 合物的玻璃是光电导性的。
类型iV
（iV）一个电子从一个能带(价 带)激发到另一个较高能量的能 带(导带)上。
在半导体(Si，Ge等)中带隙的 数值可以用光谱方法测定；一 种典型的半导体有1eV， 96kJmol-1的带隙，处于可见 区和紫外区间。
（1）含、和n电子的吸收谱带
有机化合物在紫外和可见光区域内电子跃迁的方式一般为-*、n*、n-*和-*这4种类型 。
图12-1 有机分子电子(能级)跃迁类型
-*跃迁
吸收波长在真空紫外区。 饱和烃无一例外地都含有电子，它们的电子光谱都在远紫外区。
n-*跃迁
吸收波长在150~250nm范围，绝大多数吸收峰出现在200nm左右。 含有未共享电子对杂原子(O、N、S和卤素等)的饱和烃衍生物可发生
某些无机盐阴离子由于可以发生n-*跃迁而有紫外光谱吸收峰。 例如，硝酸盐(313nm)、碳酸盐(217nm)、亚硝酸盐(360nm和
280nm)、迭氮盐(230nm)，以及三硫代碳酸盐(500nm)离子等。
(2)含d和f电子的吸收谱带（配位场跃迁）
配位场跃迁包括d-d和f-f两种跃迁。 过渡金属离子吸收光能后可以产生d-d跃迁，而镧系和锕系元素离子
生物化学常用技术与分析方法
生物化学常用技术与分析方法生物化学作为一门研究生命科学的交叉学科，涉及到许多常用的技术和分析方法。
这些方法不仅可以帮助科研人员深入了解生物大分子的结构与功能，还可以在医学、农业、环境科学等领域中发挥重要作用。
本文将介绍一些常用的生物化学技术与分析方法。
一、光谱分析法光谱分析法是生物化学领域常用的一种分析手段，通过测量物质在不同波长或能量下的吸收、发射或散射光的特性来研究其结构和性质。
在生物化学中，常用的光谱分析技术有紫外-可见光谱、红外光谱和质谱等。
其中，紫外-可见光谱广泛应用于核酸、蛋白质、酶等分析中，红外光谱则常用于研究有机分子的结构与功能。
二、电泳技术电泳技术是一种利用电场对带电物质进行分离的方法。
生物化学中常用的电泳技术有凝胶电泳和毛细管电泳。
凝胶电泳主要用于核酸和蛋白质的分析与纯化，通过凝胶的孔隙大小和电泳过程中的分子迁移速度差异来实现分离。
毛细管电泳则利用毛细管内壁带有负电荷的特性，通过电场作用将带电物质分离。
三、质谱技术质谱技术是一种用于确定物质的化学结构和分子量（质量）的方法，主要包括质谱仪测定和质谱分析。
质谱仪是一种用于测定物质组成和量的高分辨率仪器，常见的有质谱仪、飞行时间质谱仪和离子阱质谱仪等。
质谱分析则是通过将样品原子、分子等离子化，并加速和分离离子，然后对离子进行检测和分析，从而获得物质的质谱图谱。
四、核磁共振技术核磁共振技术（NMR）是一种通过测量样品中原子核所发射或吸收的特定频率的方法，常用于研究有机化合物的结构与性质。
核磁共振仪是一种用于检测和分析核磁共振信号的仪器，利用磁场和射频脉冲来激发样品中的核自旋，然后通过测量核自旋的共振频率来获取样品的信息。
五、质量光谱法质谱法是一种通过测量物质中离子的质量和相对丰度来研究其结构和性质的技术。
生物化学中常用的质谱法有气相色谱质谱联用技术（GC-MS）和液相色谱质谱联用技术（LC-MS）。
这些联用技术将色谱和质谱相结合，既能分离物质的组分，又能对其进行分析和鉴定。
分子荧光光谱法的定量依据
分子荧光光谱法的定量依据
分子荧光光谱法是一种常用的分析方法，其定量依据主要是基于荧光强度与物质浓度之间的线性关系。
在实际应用中，我们可以通过测量样品的荧光强度，来推算出样品中所含物质的浓度。
在分子荧光光谱法中，我们通常会使用荧光素（Fluorescein）等荧光染料作为指示剂。
这些染料在受到激发后，会发出特定的荧光信号。
而这些信号的强度与染料所处环境中的物理化学性质以及染料自身的性质均有关系。
当我们将染料加入待测样品中时，染料的荧光信号会受到样品中其他分子的影响而发生变化。
通过测量这些变化，我们就可以推算出样品中其他分子的浓度。
这种方法通常被称为“内标法”或“标准曲线法”。
在使用分子荧光光谱法进行定量分析时，我们需要先制备一系列不同浓度的标准溶液。
然后，我们可以分别将这些标准溶液与染料混合，并测量它们的荧光强度。
通过将荧光强度与溶液浓度绘制成一条标准曲线，我们就可以得到一个浓度与荧光强度之间的线性关系。
当我们需要分析未知样品时，我们可以将该样品与染料混合，并测量它们的荧光强度。
然后，我们可以利用标准曲线来推算出该样品中所含物质的浓度。
需要注意的是，在使用分子荧光光谱法进行定量分析时，我们需要保证样品中其他分子对染料荧光信号的影响尽可能小。
因此，在实际应用中，我们通常会对样品进行预处理，以去除对荧光信号产生干扰的因素。
总之，分子荧光光谱法是一种简单、快速、灵敏的定量分析方法。
通过建立标准曲线和内标法等手段，我们可以在实际应用中对各种样品进行定量分析。
现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法
第二节 荧光分析的原理
（一）荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射， 被激发至激发态，在返回基态时，产生 波长与入射光相同或较长的荧光。 通过测定物质分子产生的荧光强度进行
分 析 的 方 法 称 为 荧 光 分 析 (fluorescence analysis)。
1、分子的激发态
荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同， 可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区 别： 对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光 过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿 命fluorescence life time ）。 磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。
荧光分析法发展简史
2、分子荧光和磷光的产生
分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸 收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃 迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根 据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的 各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射 跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多 余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条 途径。
世界上第一次记录荧光现象是16世纪 西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的 水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。
1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的 荧光时，用分光光度计观察到其荧光的 波长比入射光的波长稍微长些，从而导 入了荧光是光发射的概念。 18工作。应用铝—桑色素配 合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行 的，直到1928年，才由Jette和West完成 了第一台荧光计。
激发单重态与激发三重态的性质不同
仪器分析-第2章 光学分析法导论
·电子能级变化时，必然伴随着振动能级的变化，振 动能级的变化又伴随转动能级的变化，因此，分子光谱 不是线状光谱，而是带状光谱。
λ =1 / σ
c：光速 (2.9979×1010 cm ·s-1)；λ：波长(cm)； ν：频率(Hz或s-1)；σ：波数(cm-1) ； E ：能量(ev或J)； h：普朗克常数6.6256 ×10-34J ·s或４.136 ×10-15ev.s
二、电磁波谱
电磁辐射按照波长(或频率、波数、能量)大小的顺序排列.
如： 钠原子的光谱项符号 32S1/2；
表示钠原子的电子处于n=3，M =2(S = 1/2)，L =0，
J = 1/2 的能级状态（基态能级）；
接下一页
电子的多重态
h +
单重态 （自旋配对）
电子跃迁
激发单重态 （自旋 配对）
h +
单重态
电子跃迁 和 自旋翻转
（自旋配对）
三重态 （自旋 平行）
返回
3. △J = 0、±1 但当J=0时，△J =0跃迁是禁戒的。 4. △S = 0 即单重态只跃迁到单重态，三重态只跃迁到三重
态。不同多重态之间的跃迁是禁阻的。
符合以上条件的跃迁，跃迁概率大，谱线较强．不符合 光谱选择定则的跃迁叫禁戒跃迁，禁阻跃迁强度很弱。 若两光谱项之间为禁戒跃迁，处于较高能级的原子具有较长 的寿命，原子的这种状态称为亚稳态。
吸收光谱法
原紫红核 子外外磁 吸可可共 收见见振
光谱分析法
分子光谱法
发射光谱法
原原分分 X 化
子
子
分子荧光光谱法
单色器： 第一单色器——选择激发光波长λ1 （＞250nm的紫外 光），称为激发单色器。 第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2 ， 与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。
样品池： 采用低荧光材料，通常为石英池。 检测器： 光电倍增管。
Ⅳ、荧光法的应用
荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量 分析，但是能产生荧光的物质较少，使其 应用范围较小。
（2）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长 差值。 荧光的波长总是大于激发光的波长。这是由于发 射荧光之前的振动驰豫和内转换过程损失了一定的能 量。
（3）荧光光谱的形状与激发光波长无关 电子跃迁到不同激发态，吸收不同波长的能 量，产生不同的吸收带，但荧光均是激发态电子 回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到 基态而产生的，这与荧光物质分子被激发至哪一 能级无关。因此，荧光光谱的形状和激发光的波 长λ1无关。
溶液浓度较低时：
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc 即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质 的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
分子荧光产生机理
1.光谱类型
荧光光谱是物质分子 吸收紫外光后产生的分子 发射光谱。 2.跃迁类型
分子中原子的电子能 级跃迁，伴随振动能级的 跃迁。
3.分子的激发与失活
（1）分子的激发
基态→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定 频率的辐射，跃迁一次到位。 激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态 寿命最短的占优势。
气相分子吸收光谱法测定 氨氮
气相分子吸收光谱法测定氨氮氨氮测定是环境监测和水质分析领域中常用的分析方法之一。
其中，气相分子吸收光谱法测定氨氮的方法被广泛应用于水质分析领域，成为目前氨氮测定的最为成熟和有效的方法之一。
本文将简要介绍气相分子吸收光谱法测定氨氮的原理、特点、应用及其优缺点。
一、气相分子吸收光谱法测定氨氮的原理气相分子吸收光谱法是一种原位分析法，它通过气相分子吸收光谱的变化来测定气体成分浓度的方法。
当光线穿过样品时，被样品中的分子吸收，光线强度随之减弱，这种反应被称为分子吸收。
气相分子吸收光谱法是应用分子吸收法原理的一种常用的分析方法。
它基于分子吸收的物性原理来确定分子的组分和浓度，通常采用世纪波长分析仪来测量样品产生的光谱图。
氨氮的测定是利用氨氮在氯仿、己醇等有机溶剂中的颜色反应或直接用钠或锑锌锂等试剂进行化合反应，然后以UV-Vis分光光度法、亚甲蓝法、Nessler法、均相化学发光法、电化学法等进行测定氨氮的含量。
其中，气相分子吸收光谱法是利用氨氮与质子结合后形成氨气体，以及基于氮气和氨气体在可见光区的分子吸收效应来测定氨氮的含量的一种分析方法。
二、气相分子吸收光谱法测定氨氮的特点1. 灵敏度高：与其它测量方法相比，气相分子吸收光谱法可以测量更小的样品量，具有更高的检测灵敏度，因此能够有效地检测更低浓度的氨氮含量。
2. 操作简便：气相分子吸收光谱法省去了煩琐的提取和分解样品等步骤，分析过程简便快捷，具有极大的操作便捷性。
3. 分析速度快：气相分子吸收光谱法测定氨氮速度快，可以快速测定氨氮含量，提高实验效率。
4.高精确度：气相分子吸收光谱法分析的精度高，分析结果可靠、准确，相较于传统的分析方法，更具有可重复性和稳定性。
三、气相分子吸收光谱法测定氨氮的应用气相分子吸收光谱法测定氨氮的适用范围比较广泛，可用于环境保护、饮用水安全、工业废水处理等领域的水质分析和监测。
其在SPME/GC-MS、MTBE-GCMS和气相色谱-质谱联用等领域也有着广泛的应用，可用于检测食品、药物、生化等领域中的相关成分。
光分析法的分类
线光源：提供特定波 长的光源，金属蒸气灯( 汞灯、钠蒸气灯)、空心 阴极灯、激光等；
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2.单色器
单色器：获得高光谱纯度辐射束的装置，而辐射束的波长 可在很宽范围内任意改变；
主要部件： （1）进口狭缝； （2）准直装置(透镜或反射镜)：使辐射束成为平行光线； （3）色散装置(棱镜、光栅)：使不同波长的辐射以不同的 角度进行传播；
4. 交叉
电致发光分析；光导纤维电化学传感器
5. 检测器的发展
电荷耦合阵列检测器光谱范围宽、量子效率高、线性范 围宽、多道同时数据采集、三维谱图，将取代光电倍增管；
光二极激光器代替空心阴极灯，使原子吸收可进行多元素 同时测定；
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三种光分析 法测量过程 示意图
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四、光分析法仪器的分析法
光分析法 光谱分析法
折 射 法
圆 二 色 性 法
X 射 线 衍 射 法
干 涉 法
旋 光 法
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原子光谱分析法 分子光谱分析法
原 子 吸 收 光 谱
原 子 发 射 光 谱
原 子 荧 光 光 谱
X 射 线 荧 光 光 谱
分分核 紫红子子磁 外外荧磷共 光光光光振 谱谱光光波 法法谱谱谱
a brief introduction of optical analysis
1.原子发射光谱分析法
以火焰、电弧、等离子炬等作为光源，使气态原子的外 层电子受激发射出特征光谱进行定量分析的方法。
2.原子吸收光谱分析法
利用特殊光源发射出待测元素的共振线，并将溶液中离 子转变成气态原子后，测定气态原子对共振线吸收而进行的 定量分析方法。
分子荧光光谱法
分子荧光光谱法又称分子发光光谱法或荧光分光光度法，即通常所谓的荧光分析法。
法。
该法是一种利用某一波长的光线照射试样，该法是一种利用某一波长的光线照射试样，该法是一种利用某一波长的光线照射试样，使试样吸收这一辐射，使试样吸收这一辐射，使试样吸收这一辐射，然后在发然后在发射出波长相同或波长较长的光线的化学分析方法。
如果这种再发射约在 s 内发生，则称为荧光；若能在生，则称为荧光；若能在 s 或更长的时间后发生，则称磷光。
分子荧光光谱法就是利用这种再发射的荧光的特性和强度来对荧光物质进行定性和定量分析的。
荧光分析法的突出优点是灵敏度高，其测定下限比一般分光光度法低二至四数量级。
级。
选择性也比分光光度法好，选择性也比分光光度法好，选择性也比分光光度法好，但其应用不如分光光度广泛，但其应用不如分光光度广泛，但其应用不如分光光度广泛，因为只有有限数量因为只有有限数量的化合物才能产生荧光。
的化合物才能产生荧光。
一、基本原理一、基本原理（一）（一） 荧光光谱的产生荧光光谱的产生荧光物质分子吸收了特定频率辐射后，荧光物质分子吸收了特定频率辐射后，由基态跃迁至第一电子激发态由基态跃迁至第一电子激发态由基态跃迁至第一电子激发态（或更（或更高激发态）高激发态）的任一振动能级，的任一振动能级，的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以以热的形式损失部分能量后，而回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。
然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。
便产生荧光。
由于无辐射跃迁的几率大，因此分子荧光波长常常比激发光长。
因此分子荧光波长常常比激发光长。
激发光源的波长通常是激发光源的波长通常是在紫外区，在紫外区，荧光也可能在紫外区，荧光也可能在紫外区，荧光也可能在紫外区，但更多是在可见区。
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过渡元素水合离子的颜色
配位体对d-d跃迁最大吸收波长的影响
• 常见配位体按配位体场强度增加的顺序排列为：I＜Br-＜Cl-＜F-＜OH-＜C2H42-~H2O＜SCN-＜NH3 ＜乙二胺＜邻二氮杂菲＜NO2-＜CN-。
•[Cu(NH3)4]2+深蓝色 [Cu(H2O)4]2+为蓝色 [CuCl4]2+为绿色
n-σ*跃迁
• 含有未共享电子对杂原子 (O、N、S和卤素等)的饱 和烃衍生物。 • 吸收波长：150~250nm范 围，大多数在200nm左 右。 • 摩尔吸收系数(ε)比较低， 即吸收峰强度比较小，很 少在近紫外区观察到。 • n→σ*跃迁 一氯甲烷：173nm 甲醇：183nm。
n-π*和π-π*跃迁
第十二章 分子光谱分析法
主要内容
一、基本原理※ 1．有机、无机化合物的电子光谱 1) 含π、σ和n电子的吸收谱带 2) 含d和f电子的吸收谱带（配位场跃迁） 3) 电荷转移（迁移）吸收谱带 2．吸收定律 二、分光光度计 三、样品制备及操作 四、应用※
一、基本原理 1.有机、无机化合物的电子光谱 主要类型有： （1）含π、σ和n电子的吸收谱带（有 机化合物） （2）含d和f电子的吸收谱带 （3）电荷转次序如下：大多是吸电 子基团（蓝移）λ
－NH3＋<－SO2NH2<－COO－<－CN< －COOH<－COOCH3< －COCH3 <－CHO
几个术语
红移； 蓝移(或紫移)； 增色效应：吸收强度即摩尔吸 光系数ε增大的现象； 减色效应：吸收强度即摩尔吸 光系数ε减小的现象； 强带：摩尔吸光系数值ε大于 104的吸收带； 弱带：摩尔吸光系数ε最大值 小于104的吸收带。
n-π*和π-π*跃迁
n-π*：较低，10~100
• 峰位移动受溶剂影响
¾ 随溶剂极性的增加， ¾ n-π*：峰位置蓝移； ¾ π-π*：峰位置红移。
π-π共轭效应
• α，β-不饱和醛、酮中羰基双键和碳-碳双键 π-π共扼也有类似的效应. • R带：α，β-不饱和醛、酮中由π-π*跃迁产生 的弱吸收峰红移40nm左右.
无机盐阴离子的n-π*跃迁 • 某些无机盐阴离子由于可以发生 n-π*跃迁而有紫外光谱吸收峰。 • 如，硝酸盐(313nm)、碳酸盐 (217nm)、亚硝酸盐(360nm和 280nm)离子等。
思考： 为什么Cu2+的水溶液为蓝色，而Zn2+ 的水溶液无色？ 过渡金属离子溶液的颜色与紫外可见 吸收峰的关系？
(2)含d和f电子的吸收谱带（配位场跃迁） • d-d跃迁：过渡金属离子 • f-f跃迁：镧系和锕系元素离子
d-d跃迁
• d－d跃迁：在配位体的影响下，处于低能 态d轨道上的电子吸收光能后跃迁至高能 态的d轨道。 • 谱带位置：可见光区域 • 峰的强度：弱 • 谱带位置： d轨道包含的电子数目有关 配位场的强度
f-f跃迁
• f-f跃迁：在配位体的影响下，f电子吸收光 能后可以由低能态的f轨道跃迁至高能态的f 轨道，从而产生相应的吸收光谱。 • 特点：很窄的吸收峰 利用来校正分光光度 计的波长。
溶剂极性增大， π → π* 吸收红移 例：
溶剂 正己烷 氯仿 329 230 315 238 甲醇 309 237 水 305 243 极性增大 异亚丙 n → π* 基丙酮 π → π*
λmax蓝移 λmax红移
Δ E1
π
无溶剂效应
Δ E2
异亚丙基丙酮
π
溶剂效应
O
CH3 -C-CH=C(CH 3)2
&
ΔE2 < ΔE1 λmax红移
右下图为二苯酮的紫外光谱图 实线，在环己烷中；虚线，在乙醇中 π-π* • 从图中可以看到，从 非极性到极性时，ππ*吸收峰红移，n-π* 吸收峰紫移。 n-π* • 吸收光谱的这一性质 也可用来判断化合物 的跃迁类型及谱带的 归属。
区别： • 摩尔吸收系数
π-π*：较高， 1000~10000
生色团：羰基、硝基、双键或叁键、芳环
苯环B带λmax(nm) 256 261
CH3 Cl
264
助色团：
•含有n电子的基团(如-OH、-NH２、-NHR、-X) •本身没有生色功能，(不吸收λ>200nm的光) •与生色团相连时，会发生n-π共轭作用，增强 生色团的生色能力(吸收波长红移，强度增加)
Absorption band 吸收带
R带: 相当于n →π* 跃迁所吸收的能量产生的吸 收带。 含有杂原子的不饱和基团，如-C=O、 -N=N-、 -NO、-NO2等发色团的特征。 特点：1）吸收较弱； 2）波长较长，270-300nm K带: 共轭双键中π→π* 跃迁所产生的吸收带。 特点：1）吸收强度大，摩尔吸光系数大（104-105） 2）波长在217-280nm之间。 3）利用紫外吸收光谱是否有K吸收带， 作为判断共 轭体系的重要依据。
（1）含π、σ和n电子的吸收谱带
• 外层或价电子的跃迁产 生的光谱，价电子的形 式：σ、π、n、σ*、π* • 电子跃迁方式： σ-σ* n-σ* π-π* n-π*
有机分子电子(能级)跃迁类型
σ-σ*跃迁
¾ 所需能量最大，σ电 子只有吸收远紫外光 <200nm的能量才能发 生跃迁。 ¾ 饱和烷烃的分子吸收 光谱出现在远紫外区 ，只能被真空紫外分 光光度计检测到。 ¾ 如甲烷λmax为125nm, 乙烷λmax为135nm。
• 吸收波长在200~700nm 范围 • 绝大多数有机分子的吸 收光谱都是由n电子或 π电子向π*激发态跃迁 产生的。 • 要求分子中存在具有π 轨道的不饱和基团，这 种不饱和的吸收中心称 做生色基团（简称生色 团）。
什么是蓝移？
• 紫移或蓝移（或“向蓝”）：当有机化合物的结构发 生变化时，其吸收带的最大吸收峰波长或位置（λ最 大）向短波方向移动。 • 产生原因：未成键孤电子对的溶剂化效应，在这种 溶液体系中，溶剂的质子与n电子之间广泛形成氢 键，因此n轨道的能量降低大约相当氢键键能大小 的量，在电子光谱上可以产生30nm左右的紫移。 • 随着溶剂极性的增加，由n-π*产生的光谱峰位置一 般移向短波长。在像水或乙醇类的极性化溶剂体系 中看到。