Caspase 3活性检测
Caspase活性检测说明书
Caspase活性检测（基于p NA标记底物的比色法）在caspase 的底物多肽上标记发色团如：p NA，可用于检测凋亡细胞中的caspase活性及筛选caspases的激活剂或抑制剂。
本操作步骤主要针对使用酶标仪进行读数而设计。
其中使用的细胞抽提物、底物、抑制剂及p NA的用量为每个样本140ul。
若您希望设计针对分光光度计读数的实验，建议对每种溶液体积进行进一步优化。
所需溶液、试剂及设备• Caspase底物• Caspase抑制剂• 细胞裂解缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 1mM DTT, 100uM EDTA • 检测缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 10mM DTT, 100uM EDTA, 10%Glycerol• PBS：将8g NaCl、200mg KCl和1.44g Na2HPO4溶于800ml蒸馏水；用HCl调至pH7.4；定容至1L• 酶标板和酶标仪其它试剂(推荐)• 纯化的Caspase（阳性对照）• p NA细胞抽提物的制备以适合的凋亡诱导剂对细胞进行诱导（参考前述操作方法），同时做阴性对照，包括未处理细胞、用诱导剂的无诱导活性类似物处理细胞（若可得到），或一个凋亡诱导处理“零时间”样品。
应保证有足够细胞进行重复实验，包含或不含抑制剂的对照以检测蛋白浓度。
一般来说，我们下面推荐的裂解前细胞数量可以产生足够蛋白浓度供酶标仪检测；然而不同大小、体积的细胞及蛋白浓度可能需要增加铺板密度。
当裂解2×107/ml细胞是，产生的蛋白浓度约为1-3mg/ml，体积10ul，含约10-30ug蛋白。
依据其细胞系，最少应有106个细胞，体积50ul的裂解缓冲液进行处理。
• 细胞计数，离心收集细胞。
以PBS缓冲液洗涤一次。
若细胞已被caspase抑制剂处理过，建议多洗几次以防止后继实验中可能造成的不利影响。
细胞凋亡中Caspase-3活性的检测
细胞凋亡中Caspase-3活性的检测关键词：细胞凋亡活性检测执行分子 2012-09-27 18:04 来源：互联网点击次数：5249Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。
Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。
但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→H RP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。
结果如下图2 荧光分光光度计分析原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。
根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。
在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。
根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC （caspase-3四肽荧光底物）?37°C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。
人半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)试剂盒使用方法
人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）试剂盒使用方法本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T3 pmol/L -80 pmol/L使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）水平。
用纯化的人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3），再与HRP 标记的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。
TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）浓度。
试剂盒组成1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶 7 终止液 6ml×1 瓶2 酶标试剂 6ml×1 瓶 8 标准品（160 pmol/L） 0.5ml×1 瓶3 酶标包被板 12 孔×8 条 9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶4 样品稀释液 6ml×1 瓶 10 说明书 1 份5 显色剂A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 张6 显色剂B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
细胞凋亡的检测
细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。
细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。
一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。
三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。
紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS 稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。
储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。
凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
caspase-glo3 7assay
1.说明2.G8090成分1x2.5ml caspase 3/7 buffer，1瓶caspase 3/7底物（冻干）；置于-20度，避光。
4度3个月，常温4天。
96孔板25次100ul/孔384孔板100次25 ul/孔3.试剂的准备和储存a caspase 3/7 buffer和caspase 3/7底物用前置于室温；b 将caspase 3/7 buffer加入caspase 3/7底物瓶，混匀，使得caspase 3/7底物溶解，成为caspase glo-3/7试剂。
c caspase glo-3/7试剂4度可放置3天；4度放置1周可达到90%信号；4度放置4周可达到75%信号；caspase glo-3/7试剂-20度放置1周可达到75%信号；-20度放置4周可达到60%信号。
4. 检测细胞内caspase glo-3/7活性本实验caspase glo-3/7试剂和样品1：1混合。
（96孔板100ul caspase glo-3/7试剂+100ul 样品；384孔板25ul caspase glo-3/7试剂+100ul样品。
）需要准备的仪器a 光度计b 96孔板振荡器c 加样器d 96孔板4 A检测条件空白对照：caspase glo-3/7试剂+细胞培养液阴性对照：caspase glo-3/7试剂+培养细胞的细胞培养液实验孔：caspase glo-3/7试剂+处理后细胞的细胞培养液注意：a 96孔板中加入<20000细胞/孔；b 阴性对照和试验孔细胞数要一致；c 最高发光信号可能在1-2h达到，所以要在3h之内检测。
4 B 96孔板中培养的细胞caspase glo-3/7活性检测的标准方案a 检测前，把caspase 3/7 buffer和caspase 3/7底物置于室温，混匀；b 拿出96孔板，室温放置片刻；c 把caspase glo-3/7试剂100ul加入96孔板中（空白孔，阴性对照孔，试验孔）。
Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)
Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)产品简介：Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用，其成员包括Caspase1~11等,均属于蛋白酶家族。
Caspase 3又称CPP32、Yama、apopain、Caspase-3，属于CED-3亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。
Caspase 3 可以剪切procaspase 2、6、7和9，可直接特异性剪切许多Caspase底物（如PARP、ICAD等），并在细胞核凋亡过程中起到重要作用。
Jimei Caspase 3活性检测试剂盒（比色法）(Caspase 3 Colorimetric A ssay Kit)的检测原理是利用Caspase 3催化底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide(Ac-DEVD-pNA)产生黄色的游离硝基笨胺pNA (p-nitroaniline)，通过测定分光光度比色法测定pNA在400~410nm处吸光值，从而间接获得Caspase 3的活性。
自备材料：1、水浴锅或恒温箱2、96孔板3、酶标仪或分光光度操作步骤（仅供参考）：1、制备标准曲线：①按照Caspase Lysis buffer：Assay buffer=1：9的比例配制适量的标准品稀释液。
②用标准品稀释液稀释pNA(10mM)，使pNA分别达到200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM，另外设置一般不加pNA仅含标准品稀释液作为零管，把以上系列浓度物质作为标准品。
③取pNA浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、0的标准品各100μl加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl的比色杯，测定405nm处吸光值即A405。
④用每一个标准品的A405 减去不含pNA的空白对照的A405，计算出实际的吸光值。
Western blot检测caspase3 的步骤及原理
蛋白免疫印迹检测caspase-3的活化原理及步骤
【原理】
蛋白免疫印迹技术是以某种抗体作为探针，使之附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原部位发生特异性反应，从而对复杂的混合物中的某些特定蛋白进行鉴别和定量。
基本过程：蛋白质样品先经SDS-PAGE分离，后通过电转移将凝胶上的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白的特异性抗体作为探针与之结合，经洗涤后，将滤膜与辣根过氧化物酶偶联的抗IgG二抗结合。
辣根过氧化物酶可催化鲁米诺氧化并发光，试剂中的增强剂能使发光增强1000倍。
当加入免疫印迹化学发光剂后，鲁米诺发生氧化发光，并发射波长为428nm的光，此光可经X光胶片感光记录下来。
以此确定抗原-抗体-抗抗体复合物在滤膜上的位置及丰度。
【步骤】。
比色法检测Caspase-3相对活性
材料和方法11试剂caspase3底物acdevdpna购自biomol公司4羟乙基哌嗪乙磺酸hepes33胆酰胺基丙基二甲氨基丙磺酸盐chaps乙二胺四乙酸edta二硫苏糖醇dtt聚乙二醇辛基苯基醚tritonx100二甲基亚砜dmso购自amresco公司达氏修正依氏dmem高糖培养基购自gibco公司胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司bradford蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所氯化钠nacl甘油glycerol碳酸氢钠nahco等试剂均购自天津市化学试剂三厂
Caspase-3活性测定试剂盒
北京索莱宝科技有限公司
反应缓冲液μl
无样品 空白对照
95
待测样品μl
－
底物 μl
5
总体积μl
100
高酶活性 样品 85 10 5 100
低酶活性 样品 60 35 5 100
产品说明： 1、Caspase酶活力单位定义：参考 One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37 ºC under saturated substrate concentrations。即当底 物饱和时,一个Caspase酶活力单位定义为37 ºC 1小时水解pNA底物，产生1nmol游离pNA。根据pNA标准曲线 和样品OD值，可计算出Caspase酶活力单位。 2、除了处理组外，可设置阳性凋亡诱导剂组，阴性实验对照可包括不具有凋亡诱导作用的试剂(如 果能 得到)处理组、溶剂对照组、或凋亡诱导零时间点。
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北京索莱宝科技有限公司
×105个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。 1、（1）细胞裂解：1000g 5分钟收集细胞，吸尽上清。每2~10×106细胞加50~100µl裂解液震荡裂解，冰浴 10分钟，再次震荡。
(2) 组织裂解：3~10mg组织加100 µl裂解液放入小型玻璃匀浆器，上下匀浆30次。转移匀浆液于离心管。 2、4 ºC 12,000g 10分钟，取上清测定，或-70 ºC保存。 3、蛋白定量：用Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1-3 mg/ml， 相当于每10 μl待测样品含10-30μg蛋白，否则应增加细胞用量。
细胞凋亡测定_实验报告
一、实验目的本实验旨在通过观察细胞凋亡的形态学特征和检测凋亡相关蛋白表达，了解细胞凋亡的发生机制，为细胞凋亡相关疾病的研究提供理论依据。
二、实验材料1. 细胞：人肝癌细胞株HepG2，人正常肝细胞株LO2。
2. 试剂：Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，Caspase-3活性检测试剂盒，DNA ladder检测试剂盒，荧光显微镜，流式细胞仪等。
3. 仪器：CO2培养箱，细胞培养瓶，移液器，离心机，荧光显微镜，流式细胞仪等。
三、实验方法1. 细胞培养：将HepG2和LO2细胞分别接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时进行实验。
2. 细胞凋亡检测：（1）Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：将细胞悬液离心后弃去上清，加入Annexin V-FITC/PI染液，室温避光孵育15分钟，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
（2）Caspase-3活性检测：按照试剂盒说明书操作，检测细胞中Caspase-3活性。
（3）DNA ladder检测：按照试剂盒说明书操作，进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA ladder现象。
3. 数据分析：采用SPSS软件进行统计学分析，比较两组细胞凋亡率、Caspase-3活性和DNA ladder的差异。
四、实验结果1. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：HepG2细胞凋亡率为（30.2±2.5）%，LO2细胞凋亡率为（2.1±1.2）%，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
2. Caspase-3活性检测：HepG2细胞Caspase-3活性为（2.58±0.21）U/mg，LO2细胞Caspase-3活性为（0.83±0.14）U/mg，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
3. DNA ladder检测：HepG2细胞出现明显的DNA ladder现象，LO2细胞无DNA ladder现象。
3Caspase-3分析
Caspase-3 分析简介Caspase-3在早期凋亡细胞中就已经活化，是凋亡程序中的重要的Caspase酶。
凋亡细胞中，32kD的原酶(Pro-caspase-3)裂解为一个17-21kD亚单位和一个12kD 亚单位，两个亚单位形成二聚体，即为活化的Caspase-3，活化的Caspase-3又水解、活化其它Caspase酶和多种胞浆内成分（如D4-GDI，Bcl-2）和核内成分（如PARP）。
多克隆或单克隆Caspase-3抗体可以识别Caspase-3活化形式，它特异性识别由无活性的Pro-Caspase-3活化水解后的暴露的断裂端，C92单克隆抗体与Pro-Caspase-3无交叉反应。
试剂1.Fluorescence-conjugated Polyclonal Rabit Anti-Active Caspase-3 Antibody：多克隆抗体识别人类和小鼠的活化的Caspase-3，与人类Caspase-3的活化序列反应。
此抗体常用于流式细胞仪分析Jurkat T细胞。
抗体应4°C避光保存。
2.Cytofix/Cytoperm Solution在细胞内染色之前，进行细胞固定和破膜处理，此固定/破膜处理液是PH 缓冲液，含4%多聚甲醛。
缓冲液应4°C避光保存。
3.Perm/Wash Buffer破膜/冲洗缓冲液，用于细胞破膜，以便于细胞内染色；同时，此缓冲液也是抗体稀释液和洗液。
它含有FBS、NaN3和皂素，由于皂素的破膜过程是可逆的，所以应注意细胞内染色要在皂素缓冲液内进行。
缓冲液应4°C避光保存。
注意：有时10×浓度的缓冲液内会出现沉淀，属正常现象，在稀释成1×浓度的缓冲液后，使用0.45μ的滤器过滤即可。
用途荧光标记的Anti-Active Caspase-3抗体，可以与20μl/1×106cells进行最佳滴度反应，染色之后，可以用流式细胞仪进行检测。
Caspase3 活性检测试剂盒
3. Wang Q, Luo W, Zhang W, Dai Z, Chen Y, Chen J. Iron supplementation protects against lead-induced apoptosis through MAPK pathway in weanling rat cortex. Neurotoxicology. 2007 Jul;28(4):850-9.
10µl
Ac-DEVD-pNA (2mM)
10µl
10µl
总体积
100µl
100µl
注意：在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入
10µl Ac-DEVD-pNA (2mM)。
C. 加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即
可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
D. 样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准
曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。
E. 参考Chemicon公司的caspase 3酶活力单位的定义：One unit is the amபைடு நூலகம்unt of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the
Caspase3_测定
Caspase3 测定caspase-3的检测方法：(1)免疫细胞化学检测caspase-3蛋白的表达，用悬浮的细胞；(2)western blot 理想结果：caspase-3有32ＫＤ的条带外，还出现了20ＫＤ和10ＫＤ大小的条带，表明caspase- 3被活化；(3)RT-PCR检测mRNA的表达，用凝胶成像分析系统处理，可以半定量。
Caspases可以在哺乳动物细胞内启动凋亡，caspase3比色蛋白酶试剂盒通过简单、方便的测定caspases活性的方法这种方法通过识别序列DEVD，这种方法基于用分光光度计测定从标记底物DEVD-pNA分开的发色团（pNA) 此时游离的pNA的发射光谱可用分光光度计或酶标仪或微量滴定板在400或405nm 检测,通过样本和背景的吸光度比较来测定caspase3活性的增加，进而推知Caspases的活性。
原理：在Caspase的底物多肽(如Caspase-3的底物为DEVD)上标记pNA (p-nitroanilide, 对硝基苯胺).当活化的Caspase剪切标记的底物多肽后, pNA被释放出来,此时游离的pNA的发射光谱可用分光光度计或酶标仪在400或405nm 检测,进而推知Caspases的活性.一．实验前准备：消毒的EP管、枪头、三蒸水、冰、水浴箱、实验组及对照组心肌组织、超速低温离心机、酶标仪、721分光光度计二．活性测定操作步骤（一）每组试剂组成Samples（lysis buffer）2×Reaction buffer DEVD-PNA 总Sample well （标本组）30ul 65ul 5ul 100ul Sample control（背景组）30ul（lysis buffer）70ul 0 100ulSample well（样本组）Sample control（背景组）3小时组N3 30ul样本30ul样本65ul Reaction buffer 70ul Reaction buffer5ul DEVD-PNAC3 30ul样本＋65ul Reaction buffer5ul IETD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer R3 30ul样＋65ul Reaction buffer5ul LEHD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer6小时组N6 30ul对照样本30ul样本65ul Reaction buffer 70ul Reaction buffer5ul DEVD-PNAC6 30ul样本＋65ul Reaction buffer5ul IETD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer R6 30ul样本＋65ul Reaction buffer5ul LEHD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer 共需2×Reaction buffer810 ul，配制2×830ul以防不够，用前加入8.3ul DTT活性表示为＝样本OD1－背景OD1（实验组）/样本OD2－背景OD2（对照组）（二）．操作步骤——酶标仪 1.取标记好的EP管（已消毒）2.取已冻好的冰块加点水，置插EP管的座于冰水中3. 放转子，打开高速离心机电源，时间、速度都在零位置先开机将至4摄氏度注意要配平套管A、B、C、D注意：1.速度、时间均为0时，才能开电源2.设置温度降温10min（夏天时间可以稍微长一些）3.开电源前先把转子放入4.定时－启动－慢慢调速10000转（显示为1000转）未配平－停机－重新配平－再开机5.停机灯亮，开盖（复位：速度、时间均为0)1．从低温冰箱中取出用锡铂纸包着的组织（已称重标记好的），取2-3块（30mg/块），放在EP管中，一直浸在冰水中2．锡铂纸剥去，组织直接置于EP管中，加裂解buffer（溶后4摄氏度保存）约700ul 冰上EP管中，用小弯剪将心脏组织剪碎，越碎越好组织、裂解buffer比例：1：10冰上操作3．开匀浆机取几块冰块于小烧杯中，接自来水成冰水液将EP管置于盛有冰水的小烧杯中，固定于匀浆机上先做对照组将转头插于组织液面下，打开电源，逐渐调大速度至max，上下搅动，直至浑浊，基本无小的组织块为止调小速度至零，关电源，取出转头，EP管放回冰水底座用蒸馏水冲洗转头，液冲至废烧杯中依次以同样方法将样本组进行匀浆注意：放空转，慢慢加速，别转别上下移动轴4．匀浆后置于离心机内先设时间10min “起动”；缓慢增大离心速度至1000×10r/min；缓慢减小离心速度，降至30×10r/min时，“停机”灯亮，即可取出注配平：套管A、B、C、D配平5．取Reaction buffer 6ml，用前加入60ul DTT（稀释100倍）吸取上清至小EP管依次加Reaction buffer、上清、底物至ELISA板，加底物时，每加一次换一个枪头（因为要混匀）注：底物每取完一次都要盖盖，避光；加完底物后，混匀。
流式细胞术在细胞凋亡检测中应用
检测究竟是如何进行的呢？一、细胞凋亡检测的意义和方法正常细胞的周期时相 细胞凋亡和周期上图为流式测定细胞凋亡图，通过PI染色来测定细胞含量。
正常的细胞的周期为第一张图中所示的G1、G0期，S期、G2/M期，那么在G1、0期前面没有亚二倍体峰，也就是M1这个位置它的含量会很低。
这是一个正常细胞的周期时相，当这个细胞发生凋亡之后，在G1G0期的前面出现了一个亚二倍体峰，我们也把它叫做凋亡峰，M1这个位置细胞数百分率明显增多，相对其他的时相，G1G0、S期和G2/M期的含量就会相对减少。
（3）获取参数通过DNA含量分析所获取的、信息包括两个参数：凋亡细胞的百分率，和细胞周期当中其它时相的百分率。
（4）方法学评价DNA含量分析方法比较简便，而且经济，在临床上用的比较多，而且标本制备也比较容易，但是它有它的缺点：只有当凋亡细胞达到一定浓度的时候才能够检测出亡峰来。
所以在早期凋亡的时候采用DNA含量分析可能是不合适的，因为可能检测不出凋亡峰，含量太少。
所以比较适合的是中晚期凋亡的检测。
另外DNA含量分析也无法获取一些信息，也就是这个凋亡到底是S期还是G2/M期，有的时候无法反应这个情况。
2.Caspase-3活性的检测（1）原理检测原理主要是由于半胱氨酰基天冬氨酸蛋白酶家族，也叫做Caspases-3的家族有一种酶：是一个重要的凋亡指示蛋白，在凋亡发生的早期就可以被激活。
该酶的活性被激活之后，就在整个凋亡过程当中不断地升高，直到凋亡的晚期酶的活性才能够迅速下降。
因此，对Caspase-3酶的连续检测可以动态地观察凋亡的整个过程。
（2）检测试剂通常检测此酶的活性的试剂包括一个荧光底物，其中它的荧光基团被激活的Caspase-3切断后可以释放荧光物质，在380nm的紫外波长下发出450nm波长的荧光，这样就可以用流式细胞仪来检测。
我们通常通过对荧光强度的检测来测定出Caspase-3的活性并进行定量分析。
但是由于它是紫外激发的检测方式，因此对于没有紫外光的流式细胞仪是无法来获取Caspase-3的活性检测信息。
SP染色法检测宫颈癌细胞Caspase-3活性
采用ｓ 法 检测 ｃ Ｐ 闽 一 ， ｃ ｓ臼ｅ ３ 鼠单 克隆 抗体（ ３抗 ａｐ９一小 ＿ 碧云天生 物技术 研究所 提供 ）工作浓 度 ｌ１０ ， Ａ 显 色 ， 素复染 。 Ｂ ， ：００Ｄ Ｂ 苏木 以Ｐ Ｓ
缓冲液 代替 一 抗做 空 白 ， 染色 步骤 严格 按 说 明书进 行 。 １３ 判 断标 准 ． 显微镜观 察并收集 图像 ，ａｐ ＿ 阳性以 细胞核或细 胞质呈浅 黄 ｃ ｓ∞ｅ ３ ＿
参考 文献
【】李晟磊 ， 宗文 ， １ 刘 赵秋 民 ． 食管 鳞癌组 织 中ＲＥＣ ＫｍＲＮＡ和 蛋白的 表达 及 意义［】 中国 肿瘤 临床 ， ０ ７， ４２ ） １ ８ Ｊ． ２ ０ ３ （２ ： ２ ０～１ ８ ２ ６．
［］ 马 惠芳 ， 彩霞 ， 秀君 ． ２ 林 任 针刺 对 脑缺 血 大 鼠海 马 区凋 亡细 胞及
制和修复 ， 破坏Ｄ 和核结 构 ， 凋亡 小体 的形成等 ， 细胞凋 亡过 ＮＡ 诱导 在
程 中起着 重要 作用 。 因此 ，ａｐｓ３ 达对 宫颈癌 病情 进展 的监测 、 Ｃ ｓａ 表 ｅ 转 移潜 能及预 后估 计等具 有潜 在研 究价 值 。
色或棕 黄色 颗粒 样物 质 。 个标 本在 ４Ｏ 的观 察随 机５ 每 Ｏ倍 个视 野 计数 ，
Ｃａ ｐ ｓ－９ 白表 达 的影 Ｉ Ｊ ． 国 中医 药信 息杂 志 ， ０ ９， ６ ｓａｅ 蛋 Ｉ 】中 ￣［ ２ ０ １ （ １ ： ５～２ １ ）２ ６．
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流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - Active Caspase-3 检测细胞凋亡
A c t i v e C a s p a s e-3检测细胞凋亡实验原理Caspase-3 在早期凋亡细胞中就已经活化，是凋亡程序中的重要的Caspase 酶。
凋亡细胞中，32kD 的原酶(Pro-caspase-3)裂解为一个17-21kD 亚单位和一个12kD 亚单位，两个亚单位形成二聚体，即为活化的Caspase-3，活化的Caspase-3 又水解、活化其它Caspase 酶和多种胞浆内成分（如D4-GDI，Bcl-2）和核内成分（如PARP）。
PharMingen 多克隆或单克隆Caspase-3 抗体可以识别Caspase-3 活化形式，它特异性识别由无活性的Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的断裂端，C92 单克隆抗体与Pro-Caspase-3 无交叉反应。
Active Caspase-3 Apoptosis Kit 特为流式细胞术分析凋亡细胞的Caspase-3 而设计。
包括荧光标记多克隆兔抗Active-Caspase-3 抗体（Anti-Active Caspase-3 FITC 或Anti-Active Caspase-3 PE）、固定/破膜剂、破膜/冲洗缓冲液。
实验步骤1Camptothecin 诱导细胞凋亡在DNA 合成中，需要拓扑异构酶I。
Camptothecin 是拓扑异构酶I 的抑制剂，它在体外依剂量不同而影响凋亡的发生。
在此，Camptothecin 做为常规的凋亡诱导方案，辅助细胞凋亡分析。
凋亡诱导试验用品1.用DMSO 制备1.0mM 的Camptothecin 储备液2.Jurkat T 细胞（ATCC TIB-152）凋亡诱导试验步骤1.1⨯106cells/ml 增殖的Jurkat T 细胞加入Camptothecin，Camptothecin 终浓度为4-6μM。
2.细胞37︒C 孵育4 小时。
2Active Caspase-3 染色步骤试验用品：1.12⨯75mm 的Falcon 管2.PBS 缓冲液3.凋亡检测试剂盒染色步骤：。
糖基化终末产物对纯化培养的视网膜神经节细胞caspase-3活性的影响
糖基化终末产物对纯化培养的视网膜神经节细胞caspase-3活性的影响金燕刘光耀1（吉林大学第二医院眼科，吉林长春130041）〔摘要〕目的研究糖基化终末产物（AGEs ）对体外纯化培养的视网膜神经节细胞（RGCs ）caspase-3活性影响。
方法体外建立RGCs 纯化培养体系，分别在实验组及对照组中加入AGEs 及其对照物。
用Live /Dead Cell Viability Kit 检测培养体系中RGCs 时存活率，TUNEL 法检测凋亡细胞数量，荧光分光光度计测定caspase-3活性。
观察AGEs 作用下RGCs 存活率、凋亡细胞数量变化，以及AGEs 作用下0、8、16、24h 不同培养时间细胞caspase-3活性的变化。
结果AGEs 作用24h 后的RGCs 存活率为，较对照组明显降低（P ＜0.05）；凋亡RGCs 数量，较对照组明显增加（P ＜0.05）。
AGEs 作用下不同培养时间RGCs 细胞caspase-3活性（单位为pmol /mg /protein /min ）分别为0h ：0.97ʃ0.03，8h ：4.12ʃ0.87，16h ：8.65ʃ1.87，24h ：12.31ʃ2.23，较对照组明显增强（P ＜0.05）。
结论在AGEs 作用下，体外纯化培养的RGCs 发生凋亡，细胞caspase-3活性增加。
〔关键词〕视网膜神经节细胞；caspase-3；糖基化终末产物；细胞凋亡〔中图分类号〕R774.1〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）09-1861-02；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.09.038基金项目：吉林省科技发展计划项目（200705246）；吉林省科技发展计划项目（200905153）1吉林大学中日联谊医院骨科通讯作者：刘光耀（1971-），男，教授，主要从事骨肿瘤的研究。
第一作者：金燕（1971-），女，副教授，主要从事糖尿病视网膜病变的研究。
Caspase酶活性检测的各种应用类型
Caspase酶活性检测的各种应用类型
Caspase活性
Caspase(cysteinyl-aspartic acid proteases)是一个家族的蛋白酶,其会破坏一些重要的胞内蛋白从而引发凋亡的发生。
多种因素会激活Caspase活性,一旦一个Caspase酶被激发,其会激活一系列其他的Caspase酶。
在调亡的早期及晚期,都会有Caspase的表达。
基于活细胞Caspase酶活性检测
Cell Meter™Caspases酶活性测定试剂盒提供了一种强大而便捷的方法来测量活细胞中的Caspases酶活性。
这些测定法利用含有识别位点的可渗透细胞的底物来测量Caspases 3和7，Caspases 8或Caspases 9的活性，以及可以同时测量四种Caspases的多重检测试剂盒。
Caspases酶活性测定试剂盒检测原理
Caspases识别序列的结合抑制了荧光团或生色团产生可量化信号的能力。
在适当的活化的Caspases酶的存在下，将荧光团或发色团从识别序列上切割下来，并自由地产生指示凋亡的明亮的荧光或颜色信号。
该测定对于其各自的活化的胱天蛋白酶高度特异性的。
检测过程无需清洗的步骤，Cell Meter™半胱天冬酶活性测定试剂盒可轻松应用于高通量筛选。
用于测定活细胞种Caspases 3、7、8和9活性的试剂盒
用于测定溶液样本的Caspases 3/7活性的试剂盒
用于测定Caspase 1、2、3 / 7、6、8、9、10或13活性的结合检测试剂盒
用于测量细胞凋亡的胱天蛋白酶和磷脂酰丝氨酸检测试剂盒：
文章来源：艾美捷科技。
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Caspase 3 活性检测试剂盒
产品组成：
产品组成 BB-4106-1 BB-4106-2 BB-4106-3
规格 20 assays 50 assays 100 assays 裂解缓冲液 5ml 10ml 15ml
Ac-DEVD-p NA 200ul 500ul 1ml
检测缓冲液 5ml 10ml 15ml
DTT 100ul 150ul 250ul
产品简介：
Caspase 3 活性检测试剂盒(Caspase 3 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中Caspase 3酶活性或纯化的Caspase 3酶活性的试剂盒。
Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。
Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。
Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。
Caspase-3在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在细胞发生凋亡阶段，Caspase-3被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。
Caspase 3可以剪切procaspase 3、6、7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase 底物，包括PARP，ICAD，gelsolin和fodrin等。
这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。
另外，caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固缩，DNA片段化等。
同时caspase 3对细胞起泡也起到关键作用。
本Caspase 3 活性检测试剂盒是基于casepase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA，pNA在405nm附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3的活性。
本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测，可用于培养细胞或新鲜组织样本的caspase-3检测。
使用方法：
一、裂解缓冲液和检测缓冲液配制
根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液，每1ml缓冲液中加入10ul DTT。
二、样品处理
A．细胞样品
1.收集2-5×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，
尽可能吸干，收集细胞。
2.用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3.在细胞中加入100μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。
4.置冰上15分钟，每隔5分钟高速涡旋振荡15秒。
5.在4℃，500×g条件下离心5分钟。
6.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
B．组织样品
1. 取适量组织样本剪碎，按照50mg/100μl冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器匀浆至
无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置15分钟，小心将上清吸入另
一预冷的干净离心管。
1.在4℃，500×g条件下离心5分钟。
2.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
三、对上述处理过的上清用Bradford法进行蛋白定量。
四、Caspase 3活性检测
1、取10ul大约含20-50ug蛋白的裂解上清，加入90ul检测缓冲液。
2、再加入10ul Ac-DEVD-p NA （使用前请混匀），在37℃下避光反应1-2小时，有
黄色颜色产生即可进行检测，如果颜色变化不明显，时间可以延长，甚至孵育
过夜。
部分样品中激活的caspase-3水平较低，颜色变化不明显，直接上机检
测，与对照组样品产品变化即可。
3、测定A405nm或A400nm。
4、根据凋亡诱导的细胞的吸光值与空白对照细胞的吸光值的比值计算相对的
Caspase 3活性程度。
参考文献：
●Yakun Ge et al. Silibinin Causes Apoptosis and Cell Cycle Arrest in Some Human
Pancreatic Cancer Cells
International Journal of Molecular Sciences 2011, 12(8) （IF=2.279）
●Zhixiong Pan et al. Effects of palmitic acid on lipid metabolism homeostasis and apoptosis
in goose primary hepatocytes
Molecular and cellular biochemistry 2010 Volume 350 （IF=2.168）
●Zhixiong Pan et al. Screening and identification of differentially expressed genes in goose
hepatocytes exposed to free fatty acid
Journal of Cellular Biochemistry 2010 Volume 111, Issue 6 （IF=3.122）
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产品 产品号 产品 产品号 Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒 BB-4101 细胞周期检测试剂盒 BB-4104
Annexin V-EGFP/PI凋亡试剂盒 BB-4102 JC-1线粒体膜电位试剂盒 BB-4105
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DAPI染色试剂盒 BB-4133 Rhodamine 123染色试剂盒 BB-4137
细胞存活率检测试剂盒 BB-4122 AO/EB双染试剂盒 BB-4132。