金属离子对细胞内金属硫蛋白基因调控的影响

液起到稳定肝脏中离子水平的作用( 吴力专, 2004) , 当组织间的离子浓度梯度达到一定程度时, MT 释 放离子经跨膜运输进入组织。以 Zn 为例, Zn 离子 进入细胞后储存于游离金属离子储库中, 接着它们 对细胞内多个位点作用。如果 MT 充足, 就会生成 Zn2MT; 如 果 MT 不 足, 金 属流 入 量 超过 了 现 有 MT 存留量时, Zn 则被其它蛋白质利用, 同 时启动 MT 的基因转录, 加速诱导 MT 的合成, 新合 成的 MT 与过量的 Zn 结合, 降低游离 Zn 离子的水平, 同时也有效地减少刺激 MT 合成的因素, 从而使细 胞内 Zn 离子的数量维持相对平衡( 王佳塑, 2002) 。 2 金属离子对 MT 的基因调控
中国畜牧兽医 2010 年第 37 卷第 9 期
生物技术
ຫໍສະໝຸດ Baidu
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金属离子对细胞内金属硫蛋白基因调控的影响
王诵涛, 谢鹏, 张敏红, 冯京海
( 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 动物营养学国家重点实验室, 北京 100193)
摘要: 金属硫蛋白是可以被金属诱导和调 节细胞内金 属离子平 衡的一 类细胞 内小分 子蛋白 质。作者主 要阐述 了金属 硫
MT 调节离子平衡的这种机制可以从两方面加 以解释: ¹ 机体通过自动调节 MT 基因表达, 影响 MT 的合成, 以维持细胞内的离子处于相对稳定状 态, 防止高浓度离子对膜系统、酶和细胞内其它敏感 部位的毒害作用; º MT 有可能作为一种金属缓冲
Abstr act: Several pair s of pr imer s wer e designed according to the genome sequences, primers were designed to amplify PCV2 ORF 2 and PRRSV ORF 5. T he for eign gene were inser ted into the modified baculovir us shuttle vector pF VC, three kinds of recombinant plasmid pFVC2ORF 2, pF VC2ORF5, pFVC2ORF 52ORF2 were successfully obt ained, and the recombinant plas2 mid pF VC2ORF2, pF VC2ORF5, pFVC2ORF 52ORF2 were respectively t ransformed into DH 10BacTM E. coli which contain bac2 ulovirus skeleton. Then high2quality recombinant r Bacmid2OR F2, r Bacmid2OR F5, rBacmid2OR F52ORF 2 wer e extracted, and transfect to Sf9 cell. T hr ee kinds of r ecombinant baculovirus rAc2OR F2, r Ac2ORF5, rAc2ORF 52ORF2 were successfully res2 cued. The foreign prot ein were detected by IFA. Recombinant baculovirus r Ac2ORF2, rAc2ORF 5, r Ac2ORF52OR F2 wer e in2 jected into BALB/ c mice for immunization experiments, r esults showed that rAc2OR F2, rAc2OR F5, rAc2OR F52ORF2 wer e able to stimulat e t he body immune response, produce antibodies, and sustain for a long time.
多个拷贝的金属反应元件( MREs) 、上游刺激因子/ 抗氧化应答复合元件( U SP / ARE ) 、晚期转录因子/ 抗氧化应答 复合元件( MLTF / ARE ) 、糖皮 质激素 应答元件( GREs) 、白介素26( IL26) 应 答元件、转录 因子 sp1 结合位点等( 田晓丽, 2006) 。MREs 可以 作为转 录 活 性 蛋 白 因 子 ( trnaseript ion activat ing prot ein fact or, MTF21) 结合靶标调节 MT 基因的表 达, 其作用是作为金属反应的增强子, 向异源性目的 基因提供具有诱导性的重金属。转录因子 MTF21 是细胞中能 与 MREs 结合的蛋 白质, 分子质 量为 72. 5 ku, 具有 6 个锌指结构和多个转录活性区, 锌 离子是 其最 强 的激 活 因子。MTF21 的 作 用是 与 MRE 特异结合, 从而启动转录过程; 这些调控单元 相互间的协调作用是 MT 高效表达和多因素诱导 的基础( 陈亮, 2006; 陈伟强, 2004) 。 2. 3 金属诱导 MT 的条件 金属诱导 MT 与其他 细胞内蛋白诱导不同之处在于 MT 的诱导可能需 要 Zn 离子 的参与。H euchel 等( 1994) 在 小鼠 ES 细胞中用基因敲 除方法去除 MTF21 的表达 后, 结 果发现, 无论是天然的还是合成的金属反应启动子 都不能激 活基础水 平或锌诱 导的 MT 转录 过程。 MTF21 的作用是与锌 离子特异 地结合, 从而 启动 MT 的诱导合成过程, 说明 Zn 离子浓度与 MTF21 是 金 属 诱 导 MT 不 可 或 缺 的 关 键 点。 因 而, P almiter( 1994) 推测, 正常情况下存在 一种抑制蛋 白, 平时与 MTF21 或锌指部位结合而抑制与 MRE 的反应, 当有 锌离子 存在时, 抑 制蛋白 解离, 启动 MT 转录过程。 3 MT 诱导的其他因素
金属硫蛋白( metallothionein, MT ) 化学名为金 属硫组氨酸三甲基内盐, 是自然界广泛存在的一种 低分子质量、遗传上高度保守的功能独特的蛋白质。 对哺乳动物 MT 的研究结果发现, 其分子特征有: 分子质量低( 通常小于 10 ku) 、金属含量高( 通常有 4~ 12 个金属离子/ 分子) 、半胱氨基酸含量 高且缺 乏芳香族氨基酸和组氨酸、有丰富的 cys2x2cys 结构 ( x 为除 cys 外的其它氨基酸) 、金属- 巯基 结构的 特征光谱性质、金属巯基簇结构域。MT 的生物学 功能涉及生物体微量元素储存、运输和代谢, 重金属 解毒, 颉颃电离辐射, 清除自由基等方面, 其中金属 离子与 MT 相互作用关系的研究最为明确。 1 MT 对细胞内金属离子的动态调节
金属诱导 并不是 MT 合 成的 唯一途 径。St a2 mat ios 等( 2001) 用 CCL4 处理大鼠 12 h 后, 结果发 现, 大鼠肝细胞核中 MT 表达显著升 高。Kling 等 ( 2000) 用 H2 O2 处理虹鳟鱼性腺 RT G2 细胞系后, 结果 发 现, MT mRNA 和 MT 的 表 达 均 升 高。 Kat hleen 等( 2006) 研究结果发现, 暴露于 26 e 的 非产卵期鳉鱼的肝脏、鳃和肠中的 MT mRNA 的表 达比 暴露 于 16 e 的鳉 鱼 表 达 要高。Sit arina 等 ( 2006) 用模拟日光紫外线照射小鼠表皮, 再局部使 用雌马酚显著增加了 MT 的生成。此外, 研究结果 发现, 脂多糖、松节油、正己烷等对 MT 均具有诱导 作用; 这些因素都分属于不同的氧化剂、激素、免疫 分子及射线等, 说明可以诱导 MT 因素的多元性和 途径的多样性。与金属直接诱导 MT 合成不同的 是, 这些因素对 MT 的诱导是通过引起炎症部位的
mail: s eulb ird@ yah oo. com . cn; T el: 010262895517 基金 项 目: 动 物 营 养 学 国 家 重 点 试 验 室 自 主 研 究 课 题
( 2004DA125184( 团) 0807) 。
体上, 说明 MT 主要是一种胞内蛋白。一旦 mRNA 被翻译成蛋白质, MT 可存在于几乎所有细胞器中, 包括线粒体、内质网、细胞核等。MT 作为一种胞内 蛋白, 由于其对金属的高亲和性, 因此它可以作为一 些金属元素的储存蛋白, 从而调节一些机体必需元 素( 如锌、铜) 的平衡。Pouranga 等( 2005) 研究结果 发现, 波斯湾对虾在不同储存条件下( 淡水、冷藏和 冰冻) , 其可食用组织中 Zn 和 Cu 离子的重新分配 可能取决于 MT 从器官到肌肉组织的运输。H ui 等 ( 2008) 用人小肠 Caco22 细胞培养, 证明在高 Zn 离 子浓度条件下, ZnT1 和 MT21 mRNA 是促使锌流 出的关键因素, 对维持细胞内 Zn 的动态平衡起着 关键作用。Tat suo( 2000) 用人胰岛腺瘤细胞进行试 验, 结果发现, 正常胰岛组织和胰岛肿瘤组织中, 含 锌的金属蛋白酶与 MT 的表达一致, 所以 MT 参与 了胰岛细胞中 Zn 的 动态平衡调节和代谢。因此, MT 作为一种胞内蛋白, 不仅参与了细胞内的离子 调节, 还参加了组织间的离子运输。
研究结果发现, 无论在正常状态还是诱导状态 下, 肝细胞中的 MT mRNA 主要存在于游离的多核 糖体上, 只有不到 10% 的 MT mRNA 位于 膜核糖
收稿日期: 2010203225 作者简介: 王诵涛( 1984- ) , 男, 河南人, 硕士生, 研究方向: 动物
营养与环境。 通信作者: 谢鹏, 男, 副研究员, 研究方向: 动物营养 与环境。E2
Key words: porcine circovir us type 2 ( PCV2) ; PRR SV; recombinant baculovirus; BALB/ c mice immunization exper iment
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生物技术
中国畜牧兽医 2010 年第 37 卷第 9 期
蛋白调节细胞内金属离子平衡的机理和金属诱导硫蛋白合成的基因调控, 并简要介 绍了其他 因素对金属 硫蛋白的 诱导, 从 而
探讨不同因素对金属硫蛋白生物合成的差异。
关键词: 金属硫蛋白; 金属诱导; 金属反应元件
中图分类号: Q756
文献标识码: B
文章编号: 167127236( 2010) 0920067203
研究结果表明, MT 基因结构高度保守, 在表达 上具有高度可诱导性, 其基因调控是一个多因素、多 环节的调控过程。 2. 1 金属对 MT 的诱 导 研究结果发现, 能诱导 MT 的金属 有 Ag、Cu、Au、Zn、H g、Cd、Co、Ni、Al 等。Rodilla 等( 1998) 用人近曲小管细胞培 养结果 发现, Cd、H g、Zn、Bi 离子都 可以 诱导 MT 生成。 Kazuaki 等( 2003) 试验结果发现, Cu 可以显著提高 酵母 MT mRN A 的水平。Rhee 等( 2009) 研究结果 发现, Cd、Zn、Cu 都 可以诱导鳉鱼不 同组织中 MT mRNA 的表达, 因而 MT 的诱导作用可能发生在转 录水平。进一步研究 MT 转录基因, 结果证实, MT 的诱导由其转录基因上的金属反应元件( MREs) 进 行调控。动物体内存在一种或多种呈金属依赖性结 合的转录活性蛋白因子( MRTF s) , 与参与诱导的金 属结合后发生变构, 进而与 MREs 特定位点结合, MRTF s 对效应基因进行调控, 由此促使 MT 基因 转录( 吴力专, 2004) , 而且其转录的速率与细胞内金 属浓度呈正比。Bernt ssen 等( 2001) 研究结果发现, 大马哈鱼暴露于 Cd 时, 肾中 MT 显著升高, 且在逐 渐升高的暴露浓度中, MT 随 Cd 的积聚而不规则升 高。Alain 等( 2005) 研 究结果发现, 贻贝消化 腺中 MT 月平均浓度与 细胞质金 属含量呈 强相关。因 此, 细胞内金属浓度通过影响 MT mRNA 转录速率 对 MT 表达进行调节。 2. 2 MT 诱导的基因结构 目前认为对 MT 诱导 能力 的差 异 主要 与 MT 基 因上 游 的顺 式作 用 元 件 ) ) ) 金属调节元件有关。研究结果发现, MT 基 因分为 5c末端、5c 非翻译区( 5c2UT R) 、3 个外显子、 2 个内含子、3c 非翻译区( ( 3c2U TR) ) 和 3c 末端。所 有的基因在 3c2UT R 都含有典型的多聚腺苷酸 ) ) ) AATAA 信号, 5c末端包含调节元件, 其中有一个或