酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究0602
酶的提取及其活性影响
青 岛 科 技 大 学本 科 毕 业 设 计（科 技 论 文）题目 __________________________________ __________________________________指导教师__________________________ 辅导教师__________________________ 学生姓名__________________________ 学生学号______________________________________________院（部）____________________________专业________________班 ______年 ___月 ___日酪氨酸酶的提取及其催化活性研究 影响唾液淀粉酶活性的因素化学 应用化学 112 2014 11 14酶的提取及其催化活性研究摘要绝大多数酶的化学本质是蛋白质，本文从酶活性的定义出发，论述了酶的种类、特性以及影响酶活性的因素，酶在人们的生产、生活中均有广泛应用，探讨酶的特性对研究酶的人工合成有积极意义，通过与酶促反应速率的影响因素的比较，阐释影响酶活性的因素,来帮助我们正确理解酶活性以及理解酶活性的影响因素。
The chemical nature of most enzymes are proteins, from the definition of enzyme activity of enzyme, discusses the types, characteristics and factors affecting enzyme activity, enzyme are widely used in people's production and life, has a positive meaning to explore the properties of the enzyme to study enzymatic synthetic, through influence and enzymatic reaction the rate of factor comparison, explains the factors affecting enzyme activity, to help us to correctly understand the enzyme activity and enzyme activity factor influence understanding.关键词：酶；活性；影响因素1.综述1.1酶的简介酶（enzyme）是由生物细胞合成的、对特定底物（substrate）起高效催化作用的蛋白质，是生物催化剂。
酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究
pH值得影响
温度的影响
仪器与试剂
仪器：分光光度计 植物组织捣碎机 离心 机 恒温水浴 试剂：pH6.8磷酸盐缓冲溶液 多巴溶液 （200mg/L） 铜试剂（10-3mol/L） 土豆
实验步骤
1.络氨酸酶的提取：取75g的去皮土豆，洗净，切碎，置于 植物组织捣碎机中，加入冷却的磷酸盐缓冲溶液150ml，在 高速转速下捣碎3分钟，然后用纱布过滤，滤液收集于干净 烧杯中静置数分钟，将上层清液于离心试管中在3000r/min 转速下离心分离5分钟。 2.km和vmax的测定：在比色皿中按表1加入缓冲溶液、多巴溶 液，摇匀、30℃恒温10min，再在00、0、1号比色管各加入 络氨酸酶提取液各0.20mL，摇匀后立即倒入比色皿中，以00 号为参比溶液，测量各溶液的吸光度随时间的变化值，前 5min每隔30s测量一次溶液的吸光度，后5min每隔60s测量一 次溶液的吸光度，并记录溶液的吸光度和对应反应时间。以 同样方法测量2-5号溶液的吸光度并记录数据。
影响酶作用的因素：酶的浓度、底物浓度、 溶液的pH值、和酶抑制剂等。
km 1 1 Vi Vmax[S ] Vmax
米氏方程
[S]、[E]分别为底物浓度和酶的浓度，km为米 氏常数，其物理意义是当酶促反应速度到达 最大速度一半时的底物浓度，单位mol/L
对米氏方程进行双倒数得到：
以1/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，由图得 到截距和斜率，即可计算vmax和km。
一、底物浓度对酶促反应的影响
随反应物浓度S的增大，酶促反应速度V 增大。当底物的浓度较低时，V随〔S〕 增大而急剧增大，二者成正比关系；随 着〔S〕的继续增大，V继续增大，而增 幅逐渐减小，若再继续增大〔S〕，则V 将不再变化， 达到一个极 限值Vmax。
酶的种类,活性及影响因素
【摘要】：酶广泛存在与生物体中，对生命的生化反应至关重要
，本实验主要探究不同浓度下催化活性的不同，以及温度，pH值，抑 制剂对于酶活性的影响。
【关键词】：酪氨酸酶，唾液淀粉酶，活性，pH，温度
，抑制剂
【酶的特性综述】
酶是一种具有生物活性的蛋白质，有单纯酶和结合酶 两种。单纯酶只含蛋白质，不含其它物质，其催化活性 仅由蛋白质的结构决定。结合酶则由单纯蛋白质和辅基 组成，辅基是结合酶催化活性中不可缺少的部分。 (1)酶的催化效力远远超过化学催化剂(高108～109倍)。 (2)酶催化剂具有高效化学选择性，能从混合物中选择特 定异构体进行催化反应。 (3)酶催化剂对反应条件要求苛刻，如pH值、温度都各有 特定的界限，超出界限即可引起酶蛋白的变性与分解。
根据实验数据所画图及求出的活度来看，分别加入0.1ml、0.2ml、0.3ml、 0.4ml的活性是不一样，按照实验推测，应该是逐渐上升的，但是从实验结果 反应的情况上来看，并不是如此，而是上升之后下降，原因在于酶提取液提 取之后保存方法不得当，并没有冰浴，所以导致酶失活，从而导致活性下降 的情况
酶活性影响因素的研究
结论
（1）酶是一种活性蛋白质，因此，一切对蛋白质有影响的因 素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、 酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影 响。 （2）提取物在放置过程中变黑，是由于他们的组织中都含酪 氨酸和酪氨酸酶，酶存在于组织内部，当内部物质暴露于空 气中，在氧的参与下将发生反应，生成黑色素。 （3）酶的催化作用，只有在一定温度下才能体现出来。酶在 低温下活性暂时被抑制，高温时会永久失活。
酪氨酸酶简介
实验10 酪氨酸酶动力学
v = C/t = A/L t ΔA v（mM/min） （A1- A0）
1
2
0.5
1.0
3 4
5 6
1.5 2.0
2.5 3.0
利用双倒数作图法，横坐标为1/S，纵坐标为1/v，分别求出 Vmax和Km。
酪氨酸酶动力学分析（双倒数作图）
2012.11 杨斯雷
【注意事项】
1. 量取试剂要准确。 2. 在比色杯中混匀要快速，准确计时。 3. 选择适宜的酶浓度，在1 min内A值的变化应在 0.2-0.3之间。
第二管（A) 0.477 0.554 0.611 0.672 0.726 0.780 0.838 0.901 0.960 1.010 1.060 1.100 1.132 1.174 1.208 1.211 未测定
A= 0.249
2012级 蒋斌杰 学号 1120700086
（二）米式常数的测定
以1.5ml 磷酸缓冲液调零。在另一个比色杯中，按下表依次 加入试剂，采用已确定的酶反应时间（t），分别记录各管 反应开始时A0 和 t 分钟后的A1。
4. 注意酶制剂要低温存放。
【思考题】
1. 为什么酶活力测定的是酶反应初速度？如何确定 酶反应时间？ 2. Km值的意义是什么？计算Km值的方法有哪些？
30
45 60 75 90 105 120
165
180 195 210 225 240 255
绘制产物A-t 反应进程曲线，确定测定酶反应初速度 所用反应时间（t）。一般A值变化在0.2-0.3/min。
时间（S） 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 225 240
酪氨酸酶的粗提取,分离纯化、纯度鉴定及活性测定
课程：实验日期：2012年月日专业班级：组别交报告日期：2102年月日姓名：学号报告退发：（订正、重做）同组者：教师审批签字：实验名称：酪氨酸酶的粗提取、分离纯化、纯度鉴定及活性测定实验目的：1.自行查阅资料，选取原材料，设计合理的酪氨酸酶提取、分离、纯化鉴定以及活性测定的方案；2.按照实验方案，自主进行实验并对实验方案进行评价和改进；3.通过酪氨酸酶的分离过程，了解并熟悉生物工程下游分离工程的一些常规操作；4.对实验结果进行总结，分析和汇总展示，培养分析问题和自我展示的能力。
实验原理：酪氨酸酶是一种含铜的氧化还原酶，广泛存在于动植物和微生物体内。
与生物体黑色素的合成直接相关。
近年来，有学者已经从各种植物中提取得到酪氨酸酶，如马铃薯，蘑菇，香蕉，苹果，桑叶以及香樟等。
相关资料显示，L-多巴和邻苯二酚测定体系都说明香蕉，马铃薯及蘑菇中酪氨酸酶的活性较高。
因此，本实验选取香蕉为实验原材料，通过简单的提取分离以及纯化，初步得到了酪氨酸酶的样品（溶液），并用邻苯二酚为底物对其活性做了定性鉴定。
酪氨酸酶的粗提取包括研磨（匀浆），过滤，离心，盐析和透析等过程。
盐析蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象。
随着溶液中离子强度的增大，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱。
同时由于盐的水化作用使蛋白质表面的疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出来，增大了蛋白质表面的疏水相互作用，容易发生凝集，进而沉淀。
盐析的方法有K s盐析法和β盐析法，前者是改变体系的离子强度，而后者的则通过改变温度和pH实现。
由于蛋白质对离子强度的变化十分敏感，所以常采用K s盐析法。
常用的盐有硫酸铵等。
通过查阅资料，本实验中采用饱和度为55%的硫酸铵进行酪氨酸酶的盐析沉淀。
透析是一种膜分离的方法，利用的是浓度引起的自由扩散，在透析袋内盛放盐析后酪氨酸酶的溶解液，放入缓冲液内透析，目的是除去盐析过程带入的离子。
透析袋在使用前一般需要进行预处理。
酪氨酸酶提取及活性研究
荧光光谱法
总结词
荧光光谱法是一种利用荧光物质与酪氨酸酶相互作用产生的荧光信号变化来研究酶活性 的方法。
详细描述
荧光光谱法通过测量荧光信号的强度和波长变化，可以分析荧光物质与酪氨酸酶的结合 情况以及酶的催化过程。该方法具有高灵敏度和选择性，适用于生物体系中的酪氨酸酶
活性研究。
紫外可见光谱法
总结词
紫外可见光谱法是通过测定酪氨酸酶在紫外可见光区的吸收光谱来研究酶活性的方法。
有机溶剂萃取法
• 有机溶剂萃取法：利用有机溶剂将目标物质从水相中萃取 出来。常用乙醚、氯仿等。
离子交换法
• 离子交换法：利用离子交换剂将目标物质与溶液中的其他离子进行交换，从而实现分离。常用DEAE-纤维素 、CM-纤维素等。
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药物研发
基于酪氨酸酶的催化机制，开发具有治疗作 用的新型药物或药物前体。
生物工程
利用酪氨酸酶在酶工程领域进行蛋白质改造 和优化，提高酶的催化效率和稳定性。
感谢您的观看
THAபைடு நூலகம்KS
在食品工业领域的应用
• 酪氨酸酶在食品工业中主要用于生产 食品添加剂和调味品。例如，它可以 催化产生茶多酚和咖啡色素等天然色 素，为食品提供丰富的色泽。此外， 酪氨酸酶还可用于生产香精和调味剂， 提高食品的口感和风味。
酪氨酸酶抑制及激活作用动力学的分析
二、实验过程
酶抑制剂的高通量筛选可以 通过酶标仪进行，但系统地 、准确地研究抑制剂的IC50 以及抑制作用的动力学必须 通过精密仪器进行检测。 本实验将利用紫外-可见分 光光度计测试几种化合物对 马铃薯多酚氧化酶（酪氨酸 酶）的抑制和激活作用的动 力学。 实验材料： 马铃薯酪氨酸酶粗酶 （前面实验提取） 抑制剂：硫酸亚铁、 六羟基二苯甲酮、2萘酚 激活剂：1-萘酚、硫 酸铜、二羟基二苯甲 酮
化学ห้องสมุดไป่ตู้物学综合实验六
酪氨酸酶抑 制及激活作 用动力学的 分析
• 指导教师：马林
• 化学与化学工程学院
一、实验基本原理
酪氨酸酶(Tyraseosinase ，Tyrase)又称儿茶酚氧 化酶(Ec.1.14.18.1)属于 多酚氧化酶（漆酶和二酚 氧化酶）中的一种。它广 泛存在于红薯、香蕉、苹 果、蘑菇、马铃薯及人体 等动植物中，也存在于微 生物，特别是霉菌之中。 在动植物体内，酪氨酸酶 对酪氨酸和其它酚类化合 物的代谢以及黑色素的合 成起重要的催化作用。酪 氨酸酶可以催化两类不同 的反应：单酚羟基化形成 邻二酚和邻苯二酚氧化成 邻醌，这两类反应都必须 有氧分子的直接参与。
实验仪器和条件
实验条件： 缓冲液：0.1mol/LpH 6.8 磷酸盐缓冲液。 底物：25mol/L 邻苯二酚 化合物溶液的配制： 1-萘酚和二羟基二苯甲酮 用乙醇配成50mol/L。 2-萘酚和六羟基二苯甲酮 用乙醇配成10mol/L。 硫酸亚铁和硫酸铜用蒸馏 水配成50mol/L。
北京普析通用UV-1901 紫外 可见分光光度计
酪氨酸酶是皮肤黑素生物合成的关键酶，它不仅决定黑 素合成的速率,还是黑素细胞分化成熟的特征性标志，因 此它给人体皮肤美白带来困难。酪氨酸酶的活性与黑素 合成量相关，控制其活力即可控制黑素生成量。因此， 研究酪氨酸酶的抑制，对防止水果、蔬菜的褐变，化妆 品中的皮肤增白，以及因酪氨酸酶催化产生黑色素引起 的疾病（黄褐斑、黑色素瘤等色素沉着性皮肤病等）， 具有非常重要的治疗意义。 酪氨酸酶的底物结合部位，由于铜原子与氧的结合部位 关系密切，故凡能与铜原子形成复合物的化学试剂均有 可能是酶的有效抑制剂。苯甲酸、叠氮化物、氰化物、 苯硫脲和半胱氨酸等对O2与酶结合有竞争作用；非酚类芳 香族化合物对底物与酶结合有竞争作用。近些年来，人 们从植物中分离出多种酪氨酸酶抑制剂用于化妆品工业， 如熊果苷、曲酸、根皮素等。
酪氨酸酶的酶学动力学研究
酪氨酸酶的酶学动力学研究
李新荣;韩红
【期刊名称】《南京铁道医学院学报》
【年(卷),期】1992(11)1
【总页数】4页(P33-36)
【关键词】酪氨酸酶类;黄芩甙;酶学动力学
【作者】李新荣;韩红
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】Q550.2
【相关文献】
1.黑木耳酪氨酸酶的分离纯化与酶学性质研究 [J], 邹宇;马堃;胡文忠;姜爱丽;刘程惠;顾振新
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3.47种中药对酪氨酸酶活性的影响及酶动力学的研究 [J], 涂彩霞;刘之力;任凤;赵宝昌;林熙然
4.藏荆芥提取物对酪氨酸酶活性及其动力学研究 [J], 王飞飞;王敏竹;王晗;黄山;旦增江白;李斌
5.土豆中酪氨酸酶的提取及植物精油对其激活作用与动力学研究 [J], 陈怀庆; 廖兴宏; 赵慧; 杨俊棋; 王文君; 张岩
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酪氨酸酶的提取及其催化活性研究
酪氨酸酶的提取及其催化活性研究王宁芳【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2009(037)020【摘要】[目的]进一步研究影响酪氨酸催化活性的因素,减少黑色素在生物体内的生成.[方法]以pH值7.2的Na2HPO4-HCl缓冲溶液为体系, 用分光光度计在480 nm处测定马铃薯提取液的吸光度,以吸光度对时间的变化率(ΔA/Δt) 为反应速率,建立多巴溶液的转换动力学曲线,从而可计算出酪氨酸酶的活性.[结果]结果显示,在480 nm波长下, 以pH值7.2的Na2HPO4-HCl缓冲溶液为体系,对测定体系干扰小, 所测数据波动小,酪氨酸酶的活性稳定性高,为进一步确定和研究影响酪氨酸酶活性的因素提供了理论依据.[结论] 试验以缓冲溶液为底物研究和测定酪氨酸酶的催化活性,准确度高,效果佳.【总页数】2页(P9315-9316)【作者】王宁芳【作者单位】青海师范大学,青海西宁,810008【正文语种】中文【中图分类】Q656【相关文献】1.苹果中酪氨酸酶的提取及其催化活性研究 [J], 李好样;李永耀;韩红斐2.三七叶提取物抑制酪氨酸酶及抗氧化活性研究 [J], 宋建平; 张志信; 娄洁3.响应面法优化新疆阿魏中阿魏酸的提取工艺及其抑制酪氨酸酶活性研究 [J], 阿迪拉·吐尔逊塔依;田永芝;何诗冰;努尔亚·艾尼外尔;范琳惠;约日耶提·萨力;塔吉古丽·阿不里克木4.Box-Behnken优化微波萃取桂花果皮多酚提取工艺及体外抑制酪氨酸酶活性研究 [J], 杨丹;梁正杰;徐广;张万超;黄红燕;梁正杰5.木瓜皮多酚和黄酮提取工艺优化及酪氨酸酶与胰脂肪酶抑制活性研究 [J], 裴文清;吕泸楠;王靖宇;浦思琦;雷霜;王春丽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究
仪器与试剂
仪器：分光光度计 植物组织捣碎机 离心 机 恒温水浴 试剂：pH6.8磷酸盐缓冲溶液 多巴溶液 （200mg/L） 铜试剂（10-3mol/L） 土豆
实验步骤
1.络氨酸酶的提取：取75g的去皮土豆，切碎，置于植物组 织捣碎机中，加入冷却的磷酸盐缓冲溶液150ml，在高速转 速下捣碎2分钟，然后倒入干净烧杯中静置2分钟，去上层清 液于离心式管中在3000r/min转速下离心分离5分钟。 2.Km和vmax的测定：在6支比色管中按表1加入缓冲溶液、多 巴溶液，摇匀、30℃恒温10min，再在00、0、1号比色管各 加入络氨酸酶提取液各0.20mL，摇匀后立即倒入比色皿中， 以00号为参比溶液，测量其吸光度，前5min每隔30s测量一 次溶液的吸光度，后5min每隔60s测量一次溶液的吸光度， 并记录溶液的吸光度和对应反应时间。以同样方法测量2-5 号溶液的吸光度并记录数据。
影响酶促反应速度的因素： 酶的浓度[E] 底物的浓度[S] 溶液的pH值 温度 酶的抑制剂 酶的激活剂
二、实验原理
酶催化剂的特点
1.具有表观活性和专一性所需要的结构空间，反应能在比较 温和的条件下进行； 2.酶促反应的活化能较低； 3.酶的催化效能极高； 4.酶具有高度的专一性。
影响酶作用的因素：酶的浓度、底物浓度、 溶液的pH值、和酶抑制剂等。
米氏方程 [S]、[E]分别为底物浓度和酶的浓度，km为米 氏常数，其物理意义是当酶促反应速度到达 最大速度一半时的底物浓度，单位mol/L
对米氏方程进行双倒数得到：坐标作图，由图得 到截距和斜率，即可计算vmax和Km。
实验注意事项
土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究 (终稿)
本科毕业论文（设计）题目：土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究学生：蒋泽琦学号： 201040320111学院：生命科学学院专业：生物科学入学时间： 2010 年 09 月 15 日指导教师：张秋研职称：助理实验师完成日期： 2014 年 05 月 04 日诚信承诺我谨在此承诺：本人所写的毕业论文《土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究》均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了注释，若有不实，后果由本人承担。
承诺人（签名）：年月日土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究不同因素对酪氨酸酶活性的影响学位申请人：蒋泽琦导师：张秋研摘要酪氨酸酶从目前的研究看来是一种由Cu+ 或Cu2+作为辅助因子构成的全酶，空气中的氧对多巴的氧化反应就是由其催化的[1]。
而我们可以通过多巴转换反应过程中的颜色变化检测其中的催化过程，所以酶的活性我们可以通过对于吸光度随时间的变化的测定来求得。
本论文则是首先从土豆中提取出酪氨酸酶，而后采用分光光度计法对其的活性进行测定，大约于480nm处使用紫外分光光度计测定土豆提取液的吸光度，将吸光度对于时间的变化率（△A/△V）作为反应的速率，并以此建立对于多巴溶液的转换动力学曲线，得出酪氨酸的活性[2]。
关键词酪氨酸酶；提取；活性；活性动力学曲线Extraction and catalytic activity of Tyrosinase potatoes Abstract：From tyrosinase appears to be a current study of Cu + or Cu2 + as a cofactor holoenzyme composed of the oxygen in the air is oxidation of dopa by catalysis. We can convert the catalytic process and reaction process wherein the color change is detected by dopa, the enzyme activity that we can change with time for the measurement of absorbance to obtain. This paper is the first extract from potato tyrosinase, followed by the spectrophotometer its activity was measured at approximately at 480nm using a UV spectrophotometer absorbance potato extract, the absorbance changes with respect to time rate (△ A / △ V) as the reaction rate, and thus create a solution for the conversion of dopa kinetic curve derived tyrosinase activity.Key words：Tyrosinase; extraction; activity; activity kinetics目录1引言 (1)2 材料与方法 (3)2.1 材料 (3)2.2 方法 (3)2.2.1 酪氨酸酶的提取 (3)2.2.2 酪氨酸最大吸收波长确定 (3)2.2.3 酪氨酸酶的活性测定 (3)2.2.4 酶活性因素测量 (3)3 结果与分析 (4)3.1 酪氨酸最大吸收波长确定 (4)3.2 建立酶的动力学曲线 (4)3.3 计算酶的活性 (6)3.4 影响酶的活性的因素研究 (7)3.4.1 pH值对酶活性的影响 (7)3.4.2 温度对酶活性的影响 (7)3.4.3 抑制剂EDTA对酶活性的影响 (8)4结论 (9)5参考文献 (10)1 引言酪氨酸酶（Tyrosinase），简称TYR，是一种75kD含铜的多酚氧化酶，酪氨酸酶非常普遍的存在于微生物、动植物及人体中[3]。
酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究
酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究一、实验目的1.认识生物体中酶的存在和催化作用，了解生物体系中在酶促反应的特点，认识一些生物化学过程的特殊性。
2.掌握生物活性物质的提取和保存方法，了解研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。
二、实验原理酶（enzyme）是由生物细胞合成的、对特定底物（substrate）起高效催化作用的蛋白质，是生物催化剂。
生物体内所有的化学反应几乎都是在酶的催化作用下进行的。
只要有生命活动的地方就有酶的作用，生命不能离开酶的存在。
在酶的催化下，机体内物质的新陈代谢有条不紊地进行着；同时又在许多因素的影响下，酶对代谢发挥着巧妙的调节作用。
生物体的许多疾病与酶的异常密切相关；许多药物也可通过对酶的作用来达到治疗的目的。
随着酶学研究的深入，必将对人类社会产生深远影响和作出巨大贡献。
酶的化学本质是蛋白质。
结构上，同样具有一、二、三级结构，有些酶还具有四级结构。
分子的化学组成上，有单纯酶和结合酶之分。
单纯酶分子是仅由蛋白质构成的酶，不含其他物质，如脲酶、活化蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等等。
结合酶分子是由蛋白质分子和非蛋白质部分组成，前者称为酶蛋白（apoenzyme），后者称辅助因子（cofactor）。
辅助因子是金属离子或有机小分子。
酶蛋白与辅助因子结合形成的复合物称全酶（holoenzyme），酶蛋白和辅助因子各自独立存在时，均无催化活性，只有全酶才有催化活性。
在酶促反应中酶蛋白决定着反应的专一性和效率，而辅助因子则决定着反应的种类和性质。
辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度和作用特点，一般分为辅酶（coenzyme）和辅基（prosthetic group）。
辅酶是指辅助因子与酶蛋白结合松弛，没有固定的组成比，往往可用透析或超滤法除去，在反应中作为底物接受质子或基团后离开酶蛋白，参加另一酶促反应并将所携带的质子或基团转移出去，或者相反。
而辅基是指与酶蛋白结合比较紧密，与酶蛋白有一定的组成比，不能通过透析或超滤法除去，在反应中辅基不能离开酶蛋白。
酪氨酸酶的提取及其催化活性研究(课件)
1. 2材料： 供试原料为市售马铃薯。仪器: V IS 7220 型可见分光光度计(北京瑞利分析 仪器公司); 电热恒温水浴锅( 天津市中环试 验电炉有限公司); 离心机; 秒表。药品: 0. 01 mol/L 二羟基苯丙胺酸( 多巴) 溶液, 0. 10 mol/L N a2HPO4 缓冲溶液( pH 值7. 2和pH 值6. 0) , 盐酸。
2 结果与分析
2. 1酶的动力学曲线的建立 以表1中的吸光度为纵坐标, 时间为横坐标, 可得出在加入酶的作用下, 多巴溶液的转换 动力学曲线, 再由曲线的直线部分得出直线 斜率(即转换速率), 由斜率可求出酶的活性。
2.2 酶的活性计算
根据公式 (其中k是斜率, 由图1可知), 将不同的k、 V值代入公式, 可求得提取液中酪氨酸酶的 活性, 由公式A = a V0 /m(其中V0 = 6. 0 ml、m = 10. 0 g, 即马铃薯原料的总体积 和质量)可得原料马铃薯中酪氨酸酶的活性。
1. 3 方法
1. 3. 1 酪氨酸酶的提取：在研钵中放入10. 0 g切碎的马铃薯, 加入7. 5m l pH值7. 2的缓冲溶液, 研磨挤压。滤出提取液, 离心分离。倾出上层清液保存于冰浴或冰箱中。 1. 3. 2 酶的活性测定：取6. 0 m l上述提取液, 用pH 值 7. 2的缓冲溶液于10. 0 m l比色管中稀释至刻度, 摇匀。取 0. 1 m l稀释过的提取液于10. 0 m l比色管中, 加入2. 9 m l pH 值6. 0的缓冲溶液, 再加入2. 0 m l多巴溶液, 用分光光 度计在480 nm处测定吸光度。开始6m in内每分钟读1个 数, 以后隔2m in读1个数, 直至吸光度变化不大为止, 得吸 光度为A1。取0. 2, 0. 3, 0. 4 m l已稀释过的提取液重复上 述试验, 得吸光度分别为A2、A3、A4。
实验4-电子教案酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究.
Comprehensive Chemical Experiments
11
化学化工学院
综合化学实验
四、实验简要步骤
土豆或苹果（12.5 g）
缓冲溶液25 mL 用力研磨
酶提取物 离心分离 酶提取物清液
475 nm, 1 cm比色皿
475 nm, 1 cm比色皿
铜试剂
酶催化多巴氧化反应动力学
抑制剂的影响
n 1 Q 2 [yI - (axI+b)]（-xI）=0 a i 0
n 1 Q 2 [y - (ax +b)]（-1）=0 I I b i 0
Comprehensive Chemical Experiments
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二、实验原理
最小二乘实验数据拟合：
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实验4-电子教案
酪氨酸酶的提取及其酶促反应
动力学研究
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实验特色
实验对象：酶——天然的生物催化剂
内容：提取、催化及动力学研究
一种新的数据处理方法——最小二乘法
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二、实验原理
最小二乘实验数据拟合：
以线性模型y = ax+b 为例： 为确定回归系数a和b，通常采用最小二乘法，即要使 Q=[yI - (axI+b)]2达到最小。 根据极值原理，a与b应满足下列方程：
酪氨酸的提取及其酶促反应动力学研究
5.4 K
m 和V
max
的测定分析讨论
Km和Vmax成线形关系, Km增大,Vmax也随之增大
结果分析与讨论:
由上述三组图表可知，Km值是一个特征值，
它与酶的浓度无关，在一定的温度和酸度条件下
为常数。
由图二、三可知，铜试剂和KCl溶液都是多
巴的竞争性抑制剂，两者竞争酶的同一个活性中
心。
提高底物浓度可以克服这种竞争性抑制，使
得抑制剂的作用减弱。
在实验中要注意的是, 多巴需要冷藏保存；酶催化作用的环境一般是在体温下，接近中性的介质中进行；实验所用的土豆和研钵等提取酶的用具，以及磷酸缓冲溶液都必须事先充分冷却，同时提取酶的操作时间亦应尽可能地短。
否则会使酶失活，从而影响后面实验测定的经过酶促反应后的溶液吸光度。
最后，测量吸光度的时候, 反应的时间要一致,减少系统误差。
最佳温度的测定
分别在不同温度测定酶的活性,结果上图所示:以酶的活性为纵坐标,温度为横坐标作图,如上图所示,可看出不同温度对酶活性的影响情况。
由图可看出,酪氨酸酶的最适温度为℃。
随着温度的升高,酪氨酸酶的活
性不断提高,达到最大值后,酶的活性又逐渐降低。
当温度达到℃,酶的活性直线下降。
因此,调节温度特别是低温条件能有效地抑制酶的活性。
由图可知，当溶液中酶的含量增加时，曲线斜率也增加，这表明酶浓度高，其反应活性也高。
马铃薯酪氨酸酶的提取.
黑色素的形成不仅是黑色素细胞的胞内行为，同时也是胞外物质作用的结果。内皮素是黑色素形成信号传导途径中重要的信号分子，抑制内皮素可抑制黑色素的形成。内皮素是一类由21个氨基酸组成的多肽物质，其中内皮素-1(ET-1)、内皮素一2(ET一2)和内皮素一3(ET-3)均已被分离。已知人体血管内内皮素浓度的增加易产生各种与血液有关的疾病，如高血压、糖尿病等。同时近来研究发现，内皮素一l和内皮素一2也是黑色素形成过程中两种不可缺少的胞外物质，对此两种物质的抑制是现在美白型化妆品领域的又一研究方向之一．一方面偏重于其形成及抑制机理的研究，另一方面偏重于在此基础上的抑制剂的开发与应用。
a、酪氨酸酶的破坏性抑制(即破坏酪氨酸酶的活性部位)。所谓酪氨酸酶的破坏性抑制，也就是某种可以直接对酪氨酸酶进行修饰、改性的物质，使酪氨酸酶失去对黑色素前体——一酪氨酸的作用，从而达到抑制黑色素形成的目的。目前该抑制剂的研究、开发主要限于对Cu2+等酪氨酸酶活性部位的破坏。因此寻找安全、高效的Cu2+络合剂是该领域的一个研究热点。
b、酪氨酸酶的非破坏型抑制。所谓酪氨酸酶的非破坏性抑制，即不对酪氨酸酶本身进行修饰、改性，而是通过抑制酪氨酸酶的生物合成或取代酪氨酸酶的作用底物，从而达到抑制黑色素形成的目的。
依据总用机理的不同，可分为3种：酪氨酸酶的合成抑制剂、酪氨酸酶糖苷化作用抑制剂及酪氨酸酶作用底物替代剂。由于在黑色素的生物合成中，酪氨酸是酪氨酸酶的作用底物，因此寻求与酪氨酸竞争的酪氨酸酶底物也可有效的抑制黑色素的生成。
1．2．2 酪氨酸酶的提取。称取去皮切碎土豆16 g(于一20℃冷冻过夜)，按l：l(WIV)的比例加入pH值6．0的磷酸盐缓冲溶液100ml，用组织捣碎机制成匀浆，转速4 000r／min下离心10 min，吸取上清溶液保存于冰浴或冰箱中。
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酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究
实验目的：本实验拟通过从土豆等物中提取酪氨酸酶并就其酶促反应的动力学研究其活性，使学生对酶有个初步的认识。
实验内容：
1.以土豆为原料提取酪氨酸酶；
2.以多巴为底物研究酪氨酸酶对底物的催化氧化：
①底物浓度对催化反应的影响：在一定的实验温度、酶用量的条件下，改变底物浓度（至少5个浓度），探究酶的催化氧化活性；
②研究温度对酶催化氧化的性能的影响（3～4个温度）；
③探究酶的用量对反应体系的速率的影响（至少5个浓度）；
④反应体系的pH 值对酶催化氧化反应的影响；
⑤探究抑制剂（铜试剂/磺基水杨酸/水杨酸等）对反应的影响。
数据记录及处理：
1.设计实验所需要的记录表格；
2.根据米氏方程，求出米氏常数和最大反应速度；
（Km 等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，即当V=Vm/2时，【S 】=Km,单位为mol/l 。
Km 是酶极为重要的动力学参数，其物理含义是指ES 复合物的消失速度常数（k-1+k2）与形成速度常数（k1）之比。
当PH 、温度、离子强度不变时，Km 是恒定的。
）
3.根据实验得到的反应速率确定反应体系的最佳条件。
实验注意事项：
1.络氨酸酶的提去要现提现用；
2.提取时的温度不能太高；
3.反应温度的设置应低于40℃；
4.反应温度应保持恒定。