细胞融合技术研究进展
细胞融合技术及相关进展
细胞融合技术及相关进展摘要：细胞工程是四大生物工程之一，在生物、医学等许多领域取得了开创性的研究成果。
细胞融合方法得到不断更新，融合率也得到逐步提高。
该技术在细胞遗传学、单克隆抗体及种质资源的开发利用等方面的研究具有重要意义。
因此本文对细胞融合的定义机理、应用及融合技术方面的相关研究成果进行总结和阐述。
关键词：细胞融合；生物法；化学法；物理法细胞融合技术是近30多年来迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术，已在农业、畜牧业、医药等多领域取得研究成果，且应用领域不断扩大[1]。
细胞融合不仅为细胞的起源、肌肉骨骼胎盘的发育、干细胞介导的组织再生等理论领域研究提供了有力手段，而且被广泛应用于育种学、发生生物学及免疫医学，特别是在动植物新品种的培育、单克隆抗体的制备以及抗癌疫苗的研发等方面具有重要意义。
1细胞融合的定义及机理细胞融合也称细胞杂交，是在自然条件下或用人工方法使两个或两个以上的同源或异源细胞或原生质体相互接触，发生膜融合、胞质融合和核融合而形成杂种细胞的过程。
细胞融合与病毒和细胞之间的融合有许多相似之处，即带包被的病毒或细胞通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合，过程中伴随蛋白构象的变化。
细胞融合主要经过以下几个主要步骤：原生质体或细胞相互靠近；质膜融合形成细胞桥；胞质渗透；细胞核融合。
其中细胞桥的形成是细胞融合的关键一步，而只有细胞核发生了融合，多核细胞才能存活下去。
2细胞融合的方法2.1生物法病毒诱导细胞融合：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用而与宿主细胞膜直接融合。
当其同时进入两个细胞时，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，打破两个细胞膜的隔阂，引起细胞质的交流，进而使细胞发生融合。
单纯疱疹病毒（HSV）：HSV介导细胞-细胞融合需要四种关键包膜蛋白gD，gB和异二聚体gH/gL，其介导细胞融合的过程如下：gD与细胞受体结合，导致其胞外域的C端部分发生构象变化，暴露出核心部位[2]；激活的gD与gH / gL相互作用并将其转化为正调控因子；正调控因子激活gB成为活性的融合因子[3]。
破骨细胞融合分子机制的研究进展
2020 年 02 月 第 17 卷 第 1 期doi: 10.3969/j.issn. 1672-5972.2020.01.017 : swgk2018-09-00165生物骨科材料与临床研究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND C LINICAL STUDY综述与讲座破骨细胞融合分子机制的研究进展*杨文杰 1,2 李耀玺 2 段莉 2 王大平 * 1,2[摘要] 破骨细胞是体内介导骨吸收的主要细胞 破骨细胞融合过程包括 识别 半融合结构及融合孔形成 最后融合孔扩张 细胞内容物混合 破骨细胞融合与破骨细胞的大小及其骨吸收能力密切相关 对破骨细胞融合分子机制的研究可为骨吸收亢进性疾病的治疗寻求新的突破口 本文就国内外破骨细胞融合过程及其分子机制的最新研究进展进行综述[关键字] 破骨细胞 细胞融合 分子机制[中图分类号] R329.2[文献标识码] AAdvances in molecular mechanism of osteoclasts fusion[Abstract] Osteoclasts are the main cells that mediate bone resorption in vivo. The process of osteoclasts fusion include the recognition and formation of hemifusion structure and fusion pore. Finally, the fusion pore expands and the cell contents mixed. Osteoclasts fusion are closely related to their size and bone resorption capacity. Research on the molecular mechanism of osteoclasts fusion can seek new breakthroughs in the treatment of bone resorption aggressive diseases. This review summarizes recent advances in the process of osteoclasts fusion and their molecular mechanisms in our state and abroad. [Key words] Osteoclast; Cell fusion; Molecular mechanism破骨细胞 osteoclast OC 是一类由骨髓造血干细胞 来源的单核/巨噬前体细胞融合分化而来的多核巨细胞 含 有 3 100 个细胞核 细胞直径可达 100 m 是体内介导 骨吸收的主要细胞 破骨细胞体积越大 其所含的骨降解相 关酶 如基质金属蛋白酶 9 组织蛋白酶 K 等 就越多 其 骨吸收能力也越强 所以破骨细胞体积大小是评估或衡量衡 量破骨细胞骨吸收能力的重要指标 破骨细胞的体积与破骨 细胞核的数量成正相关 [1] 研究表明 单核细胞与单核细 胞 单核细胞与多核破骨细胞以及多核破骨细胞之间均可相 互融合 其中以单核细胞与多核破骨细胞融合为主 以形成 破骨细胞或细胞核数目更多的破骨细胞 所以细胞间融合是 生成破骨细胞的关键 [2] 随着近年来对破骨细胞相关研究的 不断推进 人们对破骨细胞融合分子机制的认识也不断加 深 这为治疗破骨细胞功能亢进所致的骨破坏过多疾病 如* 基 金 项 目: 国 家 自 然 科 学 基 金 81772394 ; 深 圳 市 科 技 计 划 项 目 JCYJ20170306092215436 作者单位: 1 汕头大学医学院 广东 汕头 515000; 2 深圳市组织工程重点实验 室 广东省智能化数字骨科工程技术研究中心 深圳市第二人民医院 深圳大 学附属第一医院 广东 深圳 518035骨质疏松 类风湿性关节炎 骨关节炎等 寻求新的突破点 正常情况下 细胞的脂质双分子层之间通过疏水作用静电斥力和膜蛋白质的空间相互作用使自身结构稳定下来 破骨细胞前体细胞被招募 迁移到骨表面时 各细胞生物膜 之间的初始距离较大 >20 nm 融合蛋白必须使预融合细 胞间的脂质双层局部弯曲 使最强的膜间排斥面积最小化 从而使预融合细胞间紧密接触 几纳米的距离 下游的融 合事件才得以进行 [3] 细胞融合过程可归纳如下 首先 细 胞识别其融合伴侣细胞 然后细胞质膜中的磷脂双层相互接 触形成半融合结构 随后半融合结构进一步形成融合孔 最 后融合孔扩张 细胞内容物混合完成细胞融合 [4-5] 1 细胞识别细胞识别 cell recognition 是指细胞通过其表面的分 子选择性地和其他细胞表面分子结合的现象 这些表面分子 主要是蛋白质和糖蛋白 研究表明 发生融合的破骨细胞前 体 即破骨细胞融合伴侣 osteoclast fusion partners 间存 在互补分子的差异 融合前融合伴侣间存在选择性 故破骨 细胞融合伴侣间存在细胞间的相互识别 [6]抑制或敲除 CD47 可分别抑制鼠 OCs 以及巨噬细胞的生物骨科材料与临床研究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND C LINICAL STUDY2020 年 02 月 第 17 卷 第 1 期融合 [7] Frendo 等 [8] 在 Syncytin-1 反义 RNA 存在或不存在 情况下研究人类滋养层细胞融合时对所得细胞的核数量进行 终点分析发现 3 5 个核的合胞体的比例明显增加 而 6 个 核以上合胞体的比例显著降低 Møller 等 [7] 在研究破骨细 胞融合不同阶段中 CD47 和 Syncytin-1 的参与情况 共分析 了 1 808 个破骨细胞前体个体融合事件 发现 CD47 和 Syncytin-1 在破骨细胞融合中具有不同的作用 其作用取决于 融合伴侣的核数目 CD47 促进单核破骨细胞前体间融合 Syncytin-1 可促进 2 个多核破骨细胞间的融合 因此 CD47 和 Syncytin-1 可能介导破骨细胞前体间的识别 此外 破骨 细胞融合伴侣间融合主要通过 2 种不同类型的细胞接触进 行 吞噬杯状结构和宽接触表面 CD47 主要通过融合伴侣 细胞膜间的宽接触表面来介导融合 而 Syncytin-1 则通过吞 噬杯状结构来介导融合破骨细胞前体细胞表达的 CD47 又称整联蛋白相关蛋 白 和信号调节蛋白 SIRP- 都是 Ig 超家族的成员 其 中 CD47 可以作为 SIRP- 的配体 CD47-SIRP 相互作用可抑 制巨噬细胞的吞噬作用 并促进巨噬细胞融合形成破骨细胞[9]破骨细胞的树突状细胞特异性跨膜蛋白 DC-STAMP 是一种多次跨膜蛋白 是主导破骨细胞前体融合的主要蛋白 质 是 OC 融合的关键因素之一 其主要在单核破骨细胞前 体的质膜上发现 [10] RANKL 可诱导破骨细胞前体表达 DCSTAMP 在破骨细胞形成过程中 DC-STAMP 的表达是逐渐 降低的 [11] Mensah 等 [10] 研究 DC-STAMP 在巨噬细胞和 RAW264.6 巨噬细胞细胞系的融合中发现 这些细胞在用 RANKL 处理后可引起大约一半细胞细胞膜上的 DC-STAMP 转 移至细胞质内 然后根据巨噬细胞和 RAW264.6 巨噬细胞系细 胞膜上 DC-STAMP 含量分成 DC-STAMP hi 和 DC-STAMP Lo 两 个群体 当一个融合伴侣细胞膜上的 DC-STAMP hi 另一个 为 DC-STAMP lo 时 破骨细胞间才能有效融合 [10,12] Søe 等 [2] 在研究人类 656 个破骨细胞的融合事件中发现人类破骨细胞 前体 preOCs 和破骨细胞 OCs 在选择合适融合伴侣时 的特征: 融合伴侣通常包括一个不移动的融合受体细胞和一 个可移动融合供体细胞; 不移动细胞主要是多核的 并且主 要通过与含有一个细胞核的可移动细胞融合来增加它们的核 数目; 较成熟的 preOC / OC 趋向于和较不成熟的 preOC 融 合 RANKL 刺激 preOC / OC 可诱导 DC-STAMP-配体 该 配体尚未被鉴定出来 可能是可溶性的或者是与膜结合的 的表达 随后 DC-STAMP-配体通过自分泌和 或 通过 G 蛋白偶联受体 GPCR 信号传导介导的旁分泌来诱导融合 基因表达 [13] 因此推断 DC-STAMP 可能参与破骨细胞前体 间某些起识别 如 CD47 Syncytin-1 等 或融合作用分子 表达的调控2 融合中间结构的形成 当两个 preOC / OC 相互识别后 细胞即将进入细胞膜脂质双层融合阶段 见图 1 A 当然这需要某些特定融合 蛋白的存在 对无蛋白质的脂质膜融合过程的研究中发现存 在 2 种重要的中间结构 半融合结构和融合孔 [4] 其中半融 合结构是形成融合孔的中间体 [14]半融合结构表示相互黏附脂质双层间的外层小叶之间有 联系 而内层小叶仍保持不变 见图 1C [4] 蛋白质通过诱 导膜接触处的局部脱水和控制膜的弹性应力来促进半融合结 构的形成 半融合结构是一种瞬时结构 它可解离形成 2 个 分离的 脂质双层 细胞 也可进一步融合形成融合孔 [15-16]Chernomordik 等 [3] 对生物重塑表征良好的流感血凝素 介导的融合现象和机制与无蛋白的脂质双层融合进行比较 认为脂质双层发生半融合和形成融合孔的倾向主要取决于脂 质双层中脂质的组成 脂质双层中特定的脂质分子通过其分 子结构和单层内的脂质相互作用形成有效的自发曲率 从而 影响不同融合中间结构的形成 磷脂酰乙醇胺 PE 的脂 质倾向于形成负自发曲率 呈锥形 见图 2A 磷脂酰胆 碱的脂质倾向于形成略微负曲率 其自发曲率接近于零 近 似圆柱形 见图 2B 溶血磷脂酰胆碱 LPC 倾向于形 成正自发曲率 呈倒锥形 见图 2C 当把倒锥形的 LPC 和锥形的 PE 添加到接触小叶中时 可分别抑制和促进半融 合 这表明半融合结构的形成与净负曲率相关 当把 LPC 和 PE 添加到接触小叶外 即膜的非接触处 可分别促进和 抑制融合孔形成 表明融合孔形成与非接触小叶的净正曲率 相关 [4] 说明半融合结构形成后 预融合的脂质双层在接触 处要形成较大的净负曲率 而在非接触处则需形成较大的净 正曲率 半融合结构才能进一步形成融合孔在生物物理学上 PE 的头基较少与水结合 使得相邻 的富含 PE 的脂质双层可以容易地彼此相互作用 [5] Kreutzberger 等 [17] 在对细胞胞吐过程的研究中指出 PE 可促进膜变 形和稳定融合孔 Irie 等 [5] 在通过定量 PCR 和 shRNA 介导 基因敲除的方法研究破骨细胞形成过程中磷脂的动力学 首 次证明了 PE 在质膜中的重新分布 从脂质双层的内层小叶 转移至外层小叶 是破骨细胞融合所必需的 其中 ABCB4 和 ABCG1 负责 PE 的重新分布 将单核细胞表面 PE 固定 可使其不能融合形成多核破骨细胞 [5,18] 在融合过程中融合 蛋白的主要作用是产生和控制膜弹性应力 [3] 融合蛋白引发 脂质重排的关键步骤是将膜双层局部弯曲成指向即将与其融 合的伴侣细胞的乳头状突起 见图 1B 并且融合蛋白可通 过降低半融合结构形成和融合孔开放的能障使乳头状突起的 顶部融合 [4,19] 所以 推测将破骨细胞前体质膜中 PE 固定 或抑制 PE 在质膜中的再分配使破骨细胞前体不能形成多核2020 年 02 月 第 17 卷 第 1 期生物骨科材料与临床研究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND C LINICAL STUDY破骨细胞原因可以解释为: 即使融合蛋白使 2 个破骨细胞 前体间密切接触 但由于质膜外层小叶中无足够的 PE 使 得细胞前体间的相互作用力不足 致使二者不能进行融合;在破骨细胞前体间的接触小叶处不能形成有效的或足够大 的负性曲率 从而抑制破骨细胞前体由半融合结构向融合孔 方向发展融合孔是发生融合的 2 个脂质双层膜间内 外层小叶之 间的连接 它的形成在细胞间建立了水性连接 见图 1D 融合孔形成后相互融合的前体细胞间有内层小叶脂质和水内 容物的混合 [16,20] 融合孔的结构是由融合蛋白跨膜结构域TMD 围成的完全蛋白质通道样结构 且其外层可能被脂 质覆盖 从而在膜的接触小叶之间形成脂质连接 [21]图 1 两细胞脂质双分子层间的融合是通过半融合途径进行的 A B C D 为两个细胞膜脂质双分子层的融合顺序 A. 2 个预融合 细胞间在促融合剂作用下或相互识别后 逐步相互靠近或接触; B. 2 个预融合细胞膜脂质双分子层局部弯曲成乳头状突起; C. 半融合结 构形成: 2 个细胞膜 脂质双分子层 呈乳头状突起 脂质双分子层中 的外层小叶相互接触混合 而内层小叶仍各自保持独立; D. 融合孔 形成: 2 个细胞膜脂质双分子层中的内外层小叶以及 2 个细胞的胞 浆相互混合PEPCLPC图 2 不同的脂质分子可自发地形成不同的曲率的单层 从而表现为 不同的子形状: A. 磷脂酰乙醇胺 PE 可形成的锥形单层 单层向烃 链的方向上膨胀 ; B. 磷脂酰胆碱 PC 可形成几乎平坦的单层; C. 溶 血磷脂酰胆碱 LPC 可形成倒锥形的单层 单层向极性头的方向上 膨胀ATP 门控 P2X7 受体是属于 P2X 嘌呤能受体家族的质膜受体 由造血起源的细胞表达 其活化后主要通过改变细胞 膜对离子的通透性 从而触发多种细胞内信号传导事件 如 细胞因子释放 炎症 免疫应答和细胞凋亡 [22-23] 另外 有 研究表明 P2X7 受体参与多核巨细胞和细胞多核化的产生[24] 在体内 外人破骨细胞均可表达 P2X7 受体 且 P2X7 受体 具有明显的成孔作用 用拮抗剂氧化 ATP 用单克隆抗体阻 断 P2X7 受体或抑制 P2X7 受体基因表达均可显著抑制破骨 细胞前体间的融合 所以 P2X7 受体可能参与破骨细胞间融 合孔的形成 [24]脂筏 lipid-raft 是位于质膜的外层小叶中由脂质 脂 质 胆固醇 鞘脂和饱和脂肪酸 [25-26] 和脂质 蛋白质 [27]膜 肌动蛋白细胞骨架 相互作用形成的动态结构域 大 小约 70 nm stomatin 是脂筏的主要成分之一 在许多细胞类 型中广泛表达 存在于质膜和外泌体中 具有疏水结构域 棕榈酰化和寡聚化等特殊结构 其可通过分子间相互作用来 调节膜受体 并诱导不同类型的细胞融合形成多核细胞 [28-29] 当外泌体与靶细胞膜融合或者以胞吞作用进入靶细胞后 stomatin 可在脂筏内形成高级寡聚体并执行其功能 stomatin 可通过共聚效应促进促融合蛋白之间的相互作用 也可通过 增加质膜渗透性来缓解膜弯曲应力 导致促融合分子聚集 到肌动蛋白细胞骨架上 从而作为刚性支撑平台或肌动蛋 白聚合位点以驱动融合孔的扩张 在破骨细胞形成过程中 stomatin 的增加可促进 preOC 融合 stomatin 的减少抑制 preOC 融合 [30] 3 展望破骨细胞融合过程包括识别 融合中间结构和融合孔的 形成 破骨细胞前体间的融合与破骨细胞大小及其骨吸收能 力密切相关 故对其融合进行调控有望成为治疗骨吸收亢进 性疾病的突破点 目前 已确定与融合中间结构形成有关的 分子包括 ABCB4 ABCG1 P2X7 受体等 然而 这些分 子并非是 preOC /OC 特异表达 如单用某种药物来长期抑 制破骨细胞的形成可导致严重的不良反应 因此 深入研究 破骨细胞特异性融合蛋白 或分子 可为研发治疗骨吸收 亢进性疾病的特异性药物奠定基础参考文献 [1] Diepenhorst NA, Nowell CJ, Rueda P, et al. 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细胞融合技术研究进展
细胞融合技术研究进展随着生物科技的发展，细胞融合技术已成为重要的研究手段之一。
细胞融合技术是指将两个或多个不同来源的细胞融合成为一个细胞而形成的一种技术。
这种技术可以改变细胞表达的基因、蛋白质和代谢物质等特征，从而产生新的生物功能。
细胞融合技术目前已广泛应用于生物医学、农业、食品工业等多个领域。
本文将从细胞融合技术的基本原理、研究进展和应用前景三个方面进行阐述。
一、细胞融合技术的基本原理1.1 细胞融合机制细胞融合是指两个或多个细胞膜在一定条件下融合成为一个细胞的现象，融合的机制与人体生殖细胞和免疫细胞有关。
其中，生殖细胞是通过卵子与精子的融合而产生的新生命，免疫细胞则是为了对抗病原体而融合形成多核细胞，起到放大杀伤作用。
1.2 细胞融合技术的操作步骤细胞融合技术通常是通过两种或多种不同来源的细胞融合来产生新的细胞，按照操作方式的不同，可分为自然融合和人工融合两种方式。
自然融合：几乎所有人类细胞都可以形成细胞融合状态，如卵子和精子的结合。
人工融合：通常需要特殊条件，比如高浓度聚乙二醇、电脉冲等。
细胞融合技术常用于以下几个方面：构建免疫融合瘤细胞、制备单克隆抗体、制备基因工程生物等。
2.1 核移植技术核移植技术是指将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞的胞浆中，以此产生新的生物体。
这种技术被称为克隆技术的基础。
2.2 基因重组基因重组是指将两种不同的基因或同一基因的不同部分重新组合形成一个新的基因。
借助细胞融合技术可以使共同表达基因的细胞融合，从而实现新的基因重组。
2.3 细胞融合生物的生成细胞融合技术可以产生许多特殊的细胞，如免疫融合瘤、核仁瘤、杂交瘤等细胞。
这些细胞除了具备父母双亲的某些特征外，还拥有一些新的遗传特征，可以应用于生物医学等领域。
3.1 微生物发酵工程利用细胞融合技术可以构建新的高效发酵菌株，改良微生物代谢途径，增加产物产量、提高发酵效率等，实现绿色、可持续的生产方式。
3.2 细胞治疗细胞融合技术可用于干细胞和分化细胞的融合，产生细胞重构或细胞异核瘤等特殊细胞，促进体内细胞再生，缓解或治疗某些疾病。
细胞融合技术及进展
细胞融合技术及进展摘要：细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。
本文综述了关于细胞融合的基本理论并重点综述了细胞融合的基本方法及最新进展。
关键字：细胞融合生物技术方法综述前言细胞工程是生物工程主要组成之一，出现于20世纪70年代末至80年代初，是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。
细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学，特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。
细胞融合使细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。
它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，扩大了遗传物质的重组范围。
但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性，致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现，直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。
细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，有着重大的实践意义，正得到科学界的日益重视。
随着细胞融合技术研究的不断深入，细胞融合技术的发展前景及其产生的影响将日益显著。
1关于细胞融合的基本理论及概念所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization) 。
如取材为体细胞则称体细胞杂交(somatic hybridization)。
细胞融合技术讲义
细胞融合技术讲义上一节我们讲了细胞融合过程，这里系统学习一、细胞融合技术的研究进展Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。
Virchow（微尔啸）于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。
Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。
细胞是生命的基本单位，一般由细胞核、质、膜构成。
一般来说，多数细胞只有一个细胞核，如果某些细胞出现了多核现象，那是一般是出了什么问题？细胞融合，两个细胞融合就是双核，多核可能是多个细胞融合的结果。
Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。
Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。
1958年日本学者冈田单雄发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。
1974年华裔加拿大学者KAO高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。
1978年德国科学家梅歇尔斯融合了番茄和马铃薯，嫁接技术。
科学家也把两种不同的植物细胞融合起来，生成新品种。
20世纪80年代出现了电融合技术、电磁融合技术、激光融合等随着新型技术的出现，细胞融合也由自发融合进入了诱导促进阶段，细胞间的融合率大大提高，其应用领域也得到了迅速的推广，被广泛应用于食品、药品、发酵工业中。
如我们熟知的酱油，酱油是利用曲霉菌发酵生产的，其品质取决于曲霉菌产生的蛋白酶、肽酶等，选育产蛋白酶活力高的菌株的重要的方法就是采用细胞融合技术。
二、细胞融合技术定义在外力因素（诱导剂或促融剂）的作用下，两个或多个异源细胞（种、属）相互接触后，细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程。
诱导剂或促融剂我们在后面会讲到，比如病毒、PEG（聚乙二醇）等按照生物学分类，界门、纲、目科属种，不同的种，人和鼠，不同的界人和大豆。
细胞融合又叫原生质体融合。
细胞融合与单克隆抗体
优点： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过
程直观； 整合率高
缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性
2、胚胎干细胞（ES细胞）法
ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜 能细胞系。
1．核受体细胞的准备 去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。 卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理， 从输卵管冲出体内成熟的卵母细胞。二是从屠宰场收集卵巢，吸出 滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受 体。
2．核供体细胞的准备 在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，
该细胞必须保持有供体动物完整的基因组； 其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细
胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成 从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。
供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供 体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。
3．细胞核移植 常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射。胞质
细胞融合和单克隆抗体 胡丽芳
一、细胞融合
细胞融合，又称体细胞杂交或细胞杂交，是指在离体条件 下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞 通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。 杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信 息的细胞。 细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生。
广泛应用于单克隆抗体制备、生物的远缘杂交、新品种培 育等。
体外培养 注射到小鼠腹腔
单克隆抗体
单抗的制备过程要点：
1. 动物特异性免疫 2. 分离B淋巴细胞（B）；培养骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞
细胞融和实验心得
细胞融和实验心得介绍细胞融和实验是一种常用的实验方法，用于研究细胞融合、细胞膜的功能以及细胞间相互作用等问题。
本文将详细介绍细胞融和实验的流程和技巧，并分享一些实验心得。
实验流程细胞融和实验的基本流程如下：1.选择相应的细胞系：根据研究目的选择适合的细胞系，如癌细胞系、原代细胞系等。
2.细胞培养：将细胞培养在合适的培养基中，保证细胞的健康生长。
3.细胞准备：用PBS等缓冲液洗涤细胞，使细胞悬浮在合适的浓度。
4.细胞融和：将需要融合的细胞混合在一起，并通过适当的方法（如电融合、化学融合等）使细胞融合。
5.细胞分离：用合适的培养基对融合细胞进行培养和筛选，将未融合的细胞分离出来。
6.结果观察：观察融合细胞的形态、生长情况等，并进行相应的实验分析。
实验技巧在进行细胞融和实验时，有一些技巧可以提高实验的成功率和准确性：1. 细胞培养•选择适合的培养基和培养条件，保证细胞的健康生长。
•定期观察细胞的形态，及时发现并处理异常情况。
2. 细胞准备•细胞的浓度要适中，过高或过低的浓度都会影响细胞融合效率。
•注意细胞的处理时间，以防止细胞的凝聚或沉淀。
3. 细胞融合•选择合适的融合方法，如电融合、化学融合、病毒介导的融合等，根据实验需求选择最合适的方法。
•控制融合条件，如融合时间、融合温度等，不同实验可能需要不同条件的优化。
4. 细胞分离•通过培养基中添加适当的筛选物质，如抗生素、色素等，将未融合的细胞分离出来。
•注意分离细胞时的操作技巧，避免对融合细胞造成损伤。
实验心得通过多次细胞融和实验的实践，我总结出一些心得体会：1.充分准备：在进行细胞融和实验前，要充分准备所有需要的试剂和设备，并确保实验条件的稳定和一致性。
2.注意细节：实验过程中，要注意细节操作，如细胞的处理时间、细胞悬浮液的轻柔混合等。
这些看似微小的细节都可能对实验结果产生影响。
3.实验优化：根据实验结果，及时调整实验条件和方法，进一步优化实验流程，提高实验效率和准确性。
细胞融合技术及其研究进展
细胞融合技术及其研究进展摘要：自1958年Okada首次表明紫外灭活的仙台病毒可以诱导体外培养细胞融合形成多核体以来，细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术，已在医药、环保、免疫学、医药、食品以及农业等领域的基础研究和应用开发。
本文综述了细胞融合技术中的常用方法：仙台病毒（HVJ）诱导法、聚乙二醇（PEG）化学诱导法、电融合诱导法及激光诱导法的基本原理和研究进展。
关键词：细胞；细胞融合；细胞工程1 引言在细胞融合是 20 世纪发展起来的一种细胞工程技术，可以在一定的条件的诱导下使两个或多个细胞(原生质体) 相互接触，进而发生膜融合、胞质融合和核融合，从而形成杂种细胞。
细胞融合所形成的新细胞( 杂合细胞) 得到了来自两个父本细胞的遗传物质，因而具有新的遗传学或生物学特性[1]。
细胞融合逐渐成为细胞工程的一项核心技术，它不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等领域的研究提供了有力手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、免疫学、医药、食品以及农业等领域具有广泛应用价值[2]。
它已成为杂交育种、单克隆抗体制备、动物克隆以及抗癌疫苗研发等现代生物医学研究中的一项关键技术。
随着研究的不断深入，细胞融合技术的应用领域越来越广，产生的影响也日益显著，本文就其现有的研究情况进行讨论。
2 细胞融合技术2.1仙台病毒(HVJ)诱导法2.1.1仙台病毒诱导法原理1962年日本的冈田善雄偶然发现了由仙台病毒引起的细胞融合成多核细胞的现象[2]。
由于仙台病毒诱导细胞融合法较简便,特别是许多种类的细胞对其敏感,所以常选用仙台病毒作为细胞融合的诱导剂。
仙台病毒属于RNA病毒,其质膜表面存在两种糖蛋白,一种是HANA 蛋白,它具有凝集红细胞能力和神经氨酸普酶活性。
一种是F蛋白,它具有质膜融合能力(质膜和细胞膜融合的能力)、细胞融合能力和溶血能力。
仙台病毒诱导细胞融合的能力与共质膜表而两种糖蛋白有关:(1)HANA蛋白能使病毒吸附在细胞膜表面,具有凝集素的作用。
细胞膜融合与共内吞机制的研究进展
细胞膜融合与共内吞机制的研究进展细胞是生物体中最基本的单位，它们通过细胞膜与外界进行物质、信息交换。
细胞膜是由双层磷脂、膜蛋白、糖脂等组成的，通过一系列复杂的蛋白质机制，为细胞提供了一个与外界相互作用的平台。
细胞膜的重要性不言而喻，而细胞膜融合与共内吞等过程成为细胞生物学研究中的热点。
本文将对细胞膜融合和共内吞机制的研究进展进行概述。
一、细胞膜融合机制细胞膜融合是生命过程中一种最基本的现象，它不仅体现在细胞之间，也发生在细胞内部各个细胞器的融合与分裂过程中。
目前，关于细胞膜融合机制的研究主要分为三个方面，即融合启动、膜对齐和膜融合。
融合的启动涉及到蛋白质与膜蛋白之间的相互作用。
许多细胞膜上都存在膜融合素蛋白，它们能够识别和结合目标膜上的特定蛋白质或糖脂，从而启动膜融合。
一些研究发现，膜融合素蛋白能够在膜表面形成大片的聚集，从而形成许多近距离相互作用的细胞膜颗粒，这些颗粒能够在酵母菌和哺乳动物细胞质中促进膜融合事件的发生。
膜对齐是细胞膜融合过程中的第二个环节，其主要目的是将两个膜表面聚集在一起，形成紧密的相互作用。
最近的研究表明，细胞膜融合可以通过两种不同的方式进行。
第一种方式为完整膜双层的膜对齐，该方式是通过一系列复杂的蛋白质和膜蛋白相互作用完成的。
研究表明，很多蛋白质在细胞膜融合过程中发挥了重要的作用。
如 SNARE 蛋白是一类在细胞膜融合和新胞体形成过程中发挥重要作用的蛋白质。
它们通过特定的成对结合方式实现了膜对齐和膜融合。
近期研究还表明，细胞膜的一类新型脂质，即伪血蓝脂，也能够作用于 SNARE 蛋白，促进膜对齐和膜融合。
第二种方式是不完整膜双层的膜对齐，这类事件包括泡膜的扩张和吞噬等。
它与完整膜双层的膜对齐方式不同，不需要 SNARE 蛋白参与，而是利用了蛋白质和细胞膜磷脂的自组装能力。
有研究表明，草鱼毒液中的一个新型蛋白质 F-27 也能够参与细胞膜融合，进一步揭示了这一新型膜蛋白对细胞膜融合的作用。
物理方法诱导细胞融合的进展
物理方法诱导细胞融合的进展细胞融合是指将两个或多个细胞的融合成一个细胞的过程。
细胞融合技术在细胞生物学和生物医学领域具有广泛的应用，例如用于制备杂交细胞、重建组织和器官等。
物理方法诱导细胞融合是一种常用的技术手段，其原理是利用物理因素改变细胞膜和细胞内的环境，从而促进细胞的融合。
目前，各种不同的物理方法已经被用于诱导细胞融合，并取得了一系列的进展。
首先，电融合是一种常用的物理方法，通过施加电场使细胞表面产生电场效应，从而临时地改变细胞膜的通透性，使细胞发生融合。
电融合技术的优点在于操作简便，可以获得较高的细胞融合率。
研究发现，当施加电场时，细胞表面的脂质双层结构会发生变化，产生孔道或者管道，这些孔道或者管道可以让胞质流动，从而使细胞融合。
同时，电融合还可以克服不同细胞类型之间融合的障碍，实现异种细胞的融合。
例如，通过电融合可以实现癌细胞和免疫细胞的融合，从而提高抗体的表达效率。
其次，激光融合是一种新兴的细胞融合技术，它利用激光束瞬时加热细胞，使细胞膜发生热伸缩，从而促进细胞融合。
激光融合技术具有高时空精度和非接触性等优点，可以选择性地融合单个细胞，对于研究单个细胞的功能非常有用。
研究发现，激光融合可以实现不同细胞之间的融合，而且融合后的细胞可以保留各自的特性。
此外，激光融合还可以用于细胞的精准修补，例如修补DNA中的缺陷，使得细胞恢复正常功能。
另外，超声波融合是一种利用高频声波来诱导细胞融合的方法。
通过超声波的能量传递，可以产生微小气泡或者融合区域，从而破坏细胞膜的完整性，使细胞发生融合。
超声波融合技术具有非接触性、可控性和可重复性等优点，广泛应用于细胞融合、细胞拟态和细胞转染等领域。
研究发现，超声波融合可以实现不同细胞类型、不同物种细胞以及细胞与囊泡之间的融合。
此外，超声波融合技术还可以用于细胞的病理诊断，例如通过检测细胞融合的特征来鉴定肿瘤细胞。
综上所述，物理方法诱导细胞融合在细胞生物学和生物医学领域具有重要的应用价值。
植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展_李杰
仲恺农业技术学院学报,16(4):64～71,2003Jour nal of Zhongkai Agr otechnical College文章编号:1006-0774(2003)04-0064-08收稿日期:2003-04-23基金项目:国家“863”高技术研究计划(2001A A244011)资助项目.作者简介:李 杰(1974-),男,四川巴中人,在读博士生.＊通信作者.植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展李 杰1,2,黄敏仁1＊,王明庥1,蔡 汝2(1.南京林业大学林木遗传和基因工程国家林业局重点实验室,江苏南京210037;2.江苏省兰花工程研究中心,江苏泰州225321)摘要:自20世纪70年代以来,植物原生质体培养和体细胞融合操作技术不断趋于精密化、微量化、高效化与多样化.文章侧重于实验操作技术和当前研究热点,对植物原生质体培养和体细胞杂交等关键技术环节的重要研究成果和研究进展进行了综述,并对其在理论和实践上的应用前景及未来发展趋势进行了展望.关键词:植物;原生质体培养;体细胞融合;研究进展中图分类号:S682.31 文献标识码:A 植物原生质体培养和体细胞融合技术作为细胞工程技术的重要分支,一直是20世纪70年代以来的研究热点.30多年来,随着一系列关键性实验方法的发展和技术难关的逐步突破,原生质体培养和体细胞融合技术己广泛应用于生物科学众多领域的研究,尤其是在通过这样的实验体系进行植物品种改良和创造远源杂种方面取得了可喜的进展.近年来有关该领域的研究综述颇多,但大多是针对某一具体植物研究结果的总结,而针对更具普遍指导意义的操作技术评述较少.结合国内外有关文献,侧重于实验操作技术,作者对植物原生质体培养和体细胞杂交等关键技术环节的重要研究成果和研究进展进行综述,以期为相关领域的研究提供参考.1 植物原生质体的培养据许智宏等[1]介绍,自从1971年Nagata 和Takebe 首次利用烟草叶片分离原生质体,并培养获得再生植株以来,迄今至少已有46个科160多个属的360多种植物(含变种和亚种)的原生质体再生植株问世.1.1 植物原生质体的游离原生质体的游离是原生质体培养成功的一个重要环节.目前,游离植物原生质体的常规方法是酶解法.用酶解法游离原生质体时,首先要考虑植物材料的正确选择.一般情况下,当植物处于最佳生长状态时取材,分离的效果最为理想.如茄科植物一般选取生长旺盛、生理状态一致的试管苗上部叶片[2],而禾本科植物大多数选取胚性悬浮细胞系为材料[3].一个处于指数期快速生长的细胞培养体系,如愈伤组织或悬浮培养物,最适宜作为游离原生质体的材料.其次,要选择合适的水解酶种类、组合及浓度.目前市场上出现了许多游离原生质体的酶制品,但各种酶的性质、活性、纯度及作用有很大的差别,选用时应根据植物材料和酶制品的特性进行综合考虑.此外,还必须控制好酶解条件.影响酶解过程的主要因素有温度、pH 值、渗透压、离子浓度、振荡及预处理等.一般情况下,酶解温度为25～30℃,酶解液的pH 值根据所用酶种类的不同可以在5.4～6.2之间变动,渗压剂的使用浓度,一般控制在0.45～0.8mmol /L 范围内.酶解前对材料进行轻微的质壁分离,酶解时低速振荡(40r /min )以及酶解液中高钙镁离子浓度(CaCl 2和MgCl 2)等能提高原生质体的产量和质量.原生质体成功游离后的提纯方法常用的有漂浮法和沉降界面法.漂浮法在洗涤纯化过程中对原生质体的损伤较小,但对离心力要求严格,不易掌握,沉降界面法易造成原生质体损伤,但操作简单.具体选择方法则依实验条件而定.1.2 原生质体的培养在培养方式上,植物原生质体培养常采用固体包埋培养、液体培养、固液双层培养以及在此基础上发展起来的一些其它培养方式.固体包埋培养能提高培养初期原生质体的成活率,利于定点观察,但不利于通气和培养后期代谢物的排出.相比而言,多数实验者喜欢采用液体浅层培养法.这种方法的优点是培养物与空气接触面大,易于通气,添加更换培养基和转移操作方便,细胞悬浮培养中产生的有害代谢产物易于扩散,但不利于定点观察,易造成原生质体局部密度过高或过低.在固液双层培养法中,Shillito 等[4]建立的念珠培养法是比较好的一种方法,它是将含有原生质体的琼脂糖培养基切成小块放在液体培养基中进行振荡培养.用这种方法,明显提高了矮牵牛(Petunia hybridia )、番茄(Lyc opersicum escule ntum )、芜菁(Brassica rapa )等原生质体培养的植板率[4].在上述培养方式中,均可以加入未去壁但失去分化能力的完整细胞进行原生质体的看护培养(nurse culture ),能明显提高培养效果.Mit -sugu 等[5]用这样的方法,极大提高了百合(Lilium L .)原生质体培养初期的成活率. 在培养基的选择上,两种最常用的培养基为8P 和NT ,它们分别是由B5和MS 培养基改良而形成的.在这些基本培养基的基础上,针对不同植物材料和不同的培养阶段可以进行适当修改.大量元素中Mg 2+、Ca 2+浓度变化最多,铵态氮和硝态氮的比例及用量,不同实验也不尽相同.对碳源的要求一般不专一,多数采用蔗糖,或者以蔗糖和葡萄糖混合使用作为碳源营养.在激素使用上,一般须在含有一种生长素和一种细胞分裂素的培养基中才能正常分裂和生长.最常用的外源生长素是2,4-D ,但对细胞分裂素的需求,各种文献报道不一致.原生质体对外源激素的需求可能会随培养时间的推移而发生改变.如烟草(Nicotiana tabacum )原生质体在培养基中生长素水平降低或其作用消除后,会迅速生长并随之发生植株再生[6].此外,还发现一些其它化合物对原生质体的生长和分裂有一定影响.如鸟氨酸和丁二胺对木本植物的叶组织原生质体分裂和细胞团形成有利,亚精胺-精胺类多胺物质则对禾谷类植物的原生质体分裂有促进作用[6].在培养密度和条件上,根据物种和材料来源的65第4期李 杰,等:植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 不同,一般可在3×103～1×105个/ml 原生质体之间变动,培养初期往往要求黑暗或弱光条件,对大部分植物种来说,25℃的培养温度,pH 5.5～5.7的范围是合适的.1.3 原生质体的植株再生原生质体的植株再生途径通常有3条:①经细胞团发育形成愈伤组织,再分化成芽长成植株;②直接形成胚状体,再发育成植株;③先形成愈伤组织,再由愈伤组织分化形成胚状体,最后发育成植株.分化和再生所需培养基的营养成分一般与同种植物正常离体组织培养的要求相似,但其分化和植株再生能力受供体植物的染色体组型和基因型影响.曾有文献[7]介绍,油菜(Brassic a campe stris )的再生能力以AABB 染色体组品种最强,AACC 次之,AA 最差.Kyozuka 等[8]报道,籼稻(O ryza sativa subsp .indica )、粳稻(O .sativa subsp .japonica )和野生稻(O .minuta )的不同基因型在分化和再生能力方面表现出基因特异性.甚至同一品种的不同个体之间也表现出这样的差异.据黄白渠[6]介绍,在同一品种的苜蓿(M edic ago sativa )中,来自不同植株的原生质体分裂和形成胚状体的潜力是不同的.最初由原生质体成功地再生出植株的是茄科的一些植物,如烟草和矮牵牛,这些物种长期以来一直被用来作为研究原生质体培养和植株再生的模式植物.20世纪80年代以来,原生质体植株再生的研究在许多植物中取得突破性进展,已经获得了若干种有重要经济价值的原生质体再生植株,包括禾谷类的水稻(O .sativa )、玉米(Zea mays )、小麦(Tritic um ae stivum )、甘蔗(Sacc harum sinense )、高粱(Sacc harum bicolor ),豆科中的大豆(G lycine max )、花生(A rac his hypogaea )、蚕豆(Vicia faba )、苜蓿(M .sativa ),重要经济作物中的棉花(G .hirsulum spp .)、甜菜(Beta var .rapa )及重要木本植物咖啡(Coffea stenophylla )、苹果(Malus pumila )、梨(Pyrus spp .)、龙眼(Dim ocarpus longan )、猕猴桃(A ctinidia chinensis )、杨树(Populus spp .)、泡桐(Paulownia spp .)、白云杉(Picea glau -ca )、观赏植物菊花(Chrysanthemum morifolium )、康乃馨(Dianthus caryophyllus )、天竺葵(Pelargonium hortorum )等[1].再生植株着重于农作物和经济植物,并从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物、体细胞向生殖细胞扩展.总结原生质体植株再生成功的经验,有3个共性的关键因素:①选择合适的基因型;②利用胚性悬浮细胞或愈伤组织作为分离原生质体的材料;③培养条件适宜.尽管原生质体培养取得了令人鼓舞的成功,但原生质体培养的稳定性和可重复性差,存在很强的经验性,得到的原生质体再生植株仅占已进行原生质体培养的数百种植物中的一部分,而且原生质体分裂、分化的潜在生理生化本质和机制,以及各种影响因素需作深入的研究.2 植物体细胞的融合从原生质体再生完整植株的成功,最终引发了将不同遗传背景的细胞组合在一起的尝试.经过近30年的努力,人们建立起一套完整的体细胞杂交体系,它可能使不能通过有性过程杂交的亲本之间进行核基因的重组或胞质基因的重组.这套技术体系包括诱导原生质体的融合、选择融合体或杂种细胞及杂种植株的再生与鉴定.2.1 原生质体融合技术的进展原生质体的融合方法经历了一个逐步改进和完善的过程.早期使用的有Na NO 3法、高66 仲恺农业技术学院学报第16卷钙高pH 法、PE G 法等,后来相继发展了PEG 与高Ca 2+、高pH 值相结合的方法(也简称PE G 法)、电融合法以及聚集微束激光法.目前,广泛使用的是PEG 法和电融合法.PE G 法是采用聚乙二醇为融合剂的一种化学方法,使用简便、经济、可重复性强,已成功使近百个实验获得体细胞杂种.PE G 法诱导原生质体融合时,一般所用分子量为1500～6000,浓度为15%～45%.PE G 法的缺点是处理时间、PE G 分子量、诱导液的浓度等不易掌握,且易形成多元融合物,还有待于完善.电场融合是目前最流行的物理诱导融合法,它是20世纪80年代初迅速崛起的一种细胞融合技术[9].近年来,已发表了数百篇关于电融合的基本化学机理及其在医学、分子生物学、生物技术学等方面应用的科学论文.迄今为止,通过电融合反复实验,已测出了数十种植物原生质体的电融合参数,如水稻、小麦、燕麦(A vena sativa L )、马铃薯(Solanum tuberous m )、油菜(B .campestris )、胡萝卜(Daucus carota )、菜豆(Phaseolus vulgaris )、蚕豆、烟草、矮牵牛等,并成功获得部分细胞杂种[10].原生质体在融合液中的接触和融合受到外电场的作用强度、融合液的组成(如渗透剂种类、Ca 2+,Mg 2+浓度、添加的化学物质、pH 值等)的影响.电场融合的最适条件,需要分别具体材料,在实验中不断加以探索而提高,但电融合因其操作简便、快速、融合同步性好,尤其是与微培养技术相结合,将会是非常有前途的技术体系.在融合的方式上,主要有对称融合和供体-受体式融合两种.对称融合是体细胞杂交最初采用的融合方法,并由之实现了许多有性杂交不亲和的种属间的基因交流.如在马铃薯的育种中,Mattheij 等[11]用对称融合的方法获得了产量提高的四倍体细胞杂种,开辟了马铃薯商业化育种的新途径.但一般来说,对称融合在导入有用基因的同时,也带入新的全部不利基因,同时在体细胞水平上,也往往表现出一定程度的种间不亲和性.供体-受体式融合可分为细胞质杂交和不对称融合.若用致死剂量的射线处理供体原生质体,则可以形成完全没有亲本染色体的胞质杂种,若利用X 射线、紫外线打断或破坏亲本一方完整的染色体结构,使染色体部分被破坏后用于体细胞杂交,则形成不对称体细胞杂种.供体-受体式融合,可以实现胞质基因的重组,更有希望克服远缘杂交的不亲和性,因而是一条育种的简便途径,但不足之处在于供体基因丢失是一个随机的过程,丢失的程度是不可预见和难以控制的,所以有针对地转移特定的性状是亟待解决的问题.2.2 植物体细胞的杂交组合20世纪70年代,在培育体细胞杂种方面所取得的巨大成功使人们极度兴奋,许多学者一直致力于用这一方法创造新的杂种.在早期的研究中,研究兴趣和重点集中于获得亲缘关系较远的植物之间的体细胞杂种,在许多系统发育上无关的种间进行了大量的原生质体融合实验.有关例子包括大豆和烟草、大豆和大麦(H ordeum vulgare )、大豆和玉米、大豆和油菜、胡萝卜和大麦、胡萝卜和芹菜(Apium graveolens )等.多数情况下这些实验都如意料中的一样失败,融合的产物几乎不能进行分裂和生长.随后,许多学者试图从同科异属的杂种细胞再生杂种植物,杂交组合的例子有番茄+马铃薯、拟南芥+油菜、颠茄(Atropa spp .)+曼陀罗(Datura spp .)等,且获得了一些稳定的杂种细胞品系,有的还成功地再生出属间杂种植物,如广为宣传的番茄+马铃薯杂交植株.20世纪80年代中期以来,人们研究的兴趣转向选用近缘种内或种间以及较近缘属间的杂交组合.近缘体细胞杂交,具有更强的目的性,并且在实践上已经证明是一条可行的育种途径.在此期间,随着一大批经济植物如水稻、大67第4期李 杰,等:植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 豆、小麦、柑桔(Citrus reticulata )、猕猴桃(A .c hinensis )、樱桃(Pyrus avium )、杨树等原生质体培养的成功和对部分体细胞杂种研究的重视,重要经济植物非对称体细胞杂交成为该领域研究的主流.Zhou 等[12]、向凤宁等[13]先后以小麦为受体进行了一系列属间、种间非对称原生质体细胞融合,并获得体细胞杂种植物.邓秀新等[14]通过柑桔体细胞杂交得到抗寒、抗高温和抗病的杂种植株.肖尊安等[15]通过猕猴桃属种间原生质体融合,获得了中华猕猴桃(A .chinensis )与狗枣猕猴桃(A .kolomikta )的4个体细胞杂种无性系再生植株.辛化伟[16]通过非对称杂交,获得水稻与大黍(Panicum maximum )的体细胞杂种及后代.据不完全统计,通过体细胞杂交,至少已获得44个种内、103个同属异种,48个属间、5个科间的杂种植物,其中非对称融合的体细胞杂种在90%以上.2.3 杂种细胞筛选和体细胞杂种鉴定植物原生质体融合后的杂种细胞筛选方法,迄今还没有一个在总体上可以被广泛应用的方案.目前按其各自的基本原理可分为3类:①利用或创造各种缺陷型或抗性互补细胞系,用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来.细胞系互补包括叶绿素缺失互补、营养缺陷互补及抗性互补.前两种为隐性性状,其实施的关键是作为遗传标记的有关突变的利用.将黄化的黄花烟草(N .rustica )原生质体同白化的普通烟草原生质体融合,随后筛选出绿色的种间体细胞杂种[6].抗性互补为显性性状,当两个单抗的亲本融合后产生双抗杂种细胞,用相应的选择培养基则能将杂种细胞筛选出来,如Wijbrandi 等[17]用这种方法筛选了体细胞杂种.②利用或人为地造成两亲本原生质的物理特异性差异进行选择.如Sundber 等[18]根据融合和未融合原生质体物理特性的差异,利用倒置显微镜成功挑选出油菜融合原生质体,Chuong 等[19]用荧光激活细胞分拣机FACS 实现了大量挑选杂种细胞.③利用或人为地造成细胞生长或分化能力的差异进行选择.向凤宁等[20]在小麦与3种近缘属间禾草的体细胞杂交中发现,融合克隆具有优先生长的现象,这种生长速度的差异可用作选择的依据.当由杂种细胞获得再生植株后,必须进一步的分析和鉴定以证实杂种的真实性.常用的杂种鉴定方法有表现型鉴定、细胞学鉴定、同工酶鉴定及分子生物学鉴定.表现性鉴定是最常用的方法,是利用杂种与双亲表现型的差异进行比较分析.这种差异可以是形态学的直接特征,也可以是通过转基因人为创造的抗逆性.染色体数目和形态具有种的特性,是鉴定杂种的主要细胞学证据.此外基因组原位杂交(GISH )是分子细胞学鉴定杂种的主要方法.如Zhining 等[21]利用GISH 确认了羊草(L .chinensis )和小麦体细胞杂种.同工酶分析是最基本的生化分析方法,杂种的同工酶谱往往是双亲酶谱的总和,同时表现双亲特有的酶谱,也可能出现双亲没有的新酶带.有学者成功地通过分析油菜的PGI 、PGM 等同工酶,鉴定了体细胞杂种[7].近年来,对融合杂种植株进行分子生物学鉴定己成为强有力的手段.常用的鉴定植物体细胞杂种的分子生物学方法有限制性片段长度多态性(Restriction fragment length ploymorphism ,RFLP )、随机扩增多态性(Random amplified polymorphic DNA ,RAPD )、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length ploymorphism ,AFLP )、简单重复序列(Simple se -quence repent ,SSR )等.在这方面已经有较多成功的例子.68 仲恺农业技术学院学报第16卷3 植物原生质体培养和融合技术的应用原生质体培养和融合是细胞工程的核心内容,它在基础理论研究和实现远缘遗传重组,转移多基因控制性状,创造和改良品种中展示出广阔的应用前景.3.1 原生质体的理论研究和遗传应用离体的植物原生质体和其起源细胞一样仍然具有全能性,可作为生物试验系统而广泛用于生理学、遗传学、病理学、病毒学和育种学的研究.如当细胞脱壁时会引起细胞自身防御系统启动,诱发某些基因表达和关闭,深化了对细胞修复机理的认识[22].Fo wke [23]对白云杉(P .glauc a )以及Simmonds [24]对烟草原生质体培养的研究表明,影响原生质体植株再生的因素如基因型、材料来源、培养基成分、培养条件等在生理或分子水平上有一定的重叠性和相关性,揭示了脱分化机理、细胞分裂等发育学上的问题.原生质体又是遗传工程的理想受体.原生质体可以直接摄取外源物质,包括细胞核、细胞器基因组、DNA 片段及病毒颗粒,而且在控制条件下,以单个原生质体进行准确的遗传操作,易于转化受体的筛选和分析,避免嵌合现象.经过多年的努力,以原生质体为受体直接进行基因转化己取得较大的成功[25].3.2 植物体细胞杂交的应用从有性杂交植物时代到体细胞杂交植物时代所获得的各种研究结果,使植物育种的视野在器官和细胞水平上都得到了扩大.在理论上,体细胞杂交可以和常规的有性杂交技术一样作为遗传分析的手段,用于对遗传性状的本质、核基因、核外基因以及细胞分化和形态发生机理的研究和分析.在实践中的应用体现在3个方面:①获得新的种质.体细胞杂交技术不仅能使近缘不亲和种内或种间植物,而且可使远缘不亲和的属间甚至科间植物产生体细胞杂种,使植物能够利用远缘的有用基因,从而扩大植物可利用的基因库.如果杂种植物可育,并能稳定遗传,就可能形成农业上有用的新物种.如通过白菜型油菜(B .c ampestris )与甘蓝(B .napobrassica )进行原生质融合得到38条染色体的甘蓝型油菜,通过甘蓝型油菜(B .napus )与黑芥(B .nigra )体细胞融合得到的含3套染色体的杂种,大部分可育并结籽[7].②培育新品种.将栽培品种与相关的野生种作为亲本,经过原生质融合、选择与再生,从而获得具有抗性的新品种.如通过这样的方法,得到抗马铃薯晚疫病的体细胞杂种[26].③转移细胞质基因.通过体细胞杂交能够转移多基因控制的性状,并且是目前唯一能使双亲胞质和核基因在杂种细胞中共存的技术.原生质体融合涉及了双亲的细胞质,它不仅可以把细胞质基因转移到全新的核背景中,也可使叶绿体基因组与线粒体基因组重新组合.这为许多实验所证实并直接应用于植物育种.4 结语纵观30多年来,虽然有关植物原生质体培养和体细胞融合技术的研究始终保持了长盛不衰之势,并取得了可喜的成绩,但是在原生质体培养技术的成熟度、在体细胞杂种的育性(特别是远缘体细胞杂交中)以及非对称杂交中染色体消失的随机性等方面都存在着亟待研69第4期李 杰,等:植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 究和解决的问题.以原生质体植株再生技术为基础,利用体细胞杂交技术转移胞质雄性不育基因、多基因和基因组以及某些野生抗性性状等方面,将是未来研究的主流.有理由相信,原生质体培养和体细胞杂交技术与遗传转化技术相辅相成,与常规育种技术结合起来,将为植物基因组之间的结合和相互作用以及新品种的培育提供了无限的可能性.参考文献:[1] 许智宏,卫志明.植物原生质体培养和遗传操作[M ].上海:上海科学技术出版,1997.20-30.[2] SHEPARD J F .Cultivar dependent cultural refinements in potato protoplast regeneration [J ].Plant Science Letters ,1982,26:127-132.[3] FUJIMURA T .Regeneration of rice plant from protoplant [J ].Plant Tissue culture letters ,1985,2:74-75.[4] SHILLITO R D ,PASZKOOOSKI J ,POTRYKUS I .Agarose plating and a bead type culture technique enable andstimulate development of protoplast 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细胞融合研究进展
细胞融合的研究进展摘要: 细胞融合技术已在农业、工业、医药等领域取得了开创性的研究成果，应用领域不断扩大。
该技术不仅为核质关系、基因定位、基因调控、遗传互补、细胞免疫、疾病发生、膜蛋白动力学等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发育生物学，在实际应用中特别是在单克隆抗体、抗肿瘤疫苗及动植物远缘杂交育种和微生物菌种选育，绘制基因图谱等方面具有十分重要的意义。
随着细胞融合技术的不断改进和完善，动物、植物及微生物细胞融合技术无论在基础理论研究还是在实际应用中产生的影响将日益显著。
关键词：细胞融合；应用人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象，首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞，紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合，随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。
自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了利用灭活病毒促进动物异种细胞融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技术跃上新的台阶。
纵观细胞融合技术的发展历史，该技术的不断改进首先表现在融合剂上，从致癌活病毒到灭活病毒再到化学物质，其次体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。
现在新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行，如将磁、超声、机械等和激光、电相结合，同时添加化学剂以便进一步提高融合率，细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、简单，便于量化研究，同时融合率又能得到不断提高的方向发展[1]。
1细胞融合的意义所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合或细胞杂交[1]。
如取材为体细胞则称体细胞杂交，体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。
细胞融合不受种属的局限，可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。
细胞工程近十年的研究进展
细胞工程细胞工程是生物工程的一个重要方面。
总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。
当前细胞工程所涉及的主要技术领域有细胞培养、细胞融合、细胞拆合、染色体操作及基因转移等方面。
通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。
根据设计要求，按照需要改造的遗传物质的不同操作层次，可细胞工程学分为染色体工程、染色体组工程、细胞质工程和细胞融合工程等几个方面。
(1)染色体工程染色体工程是按人们需要来添加或削减一种生物的染色体，或用别的生物的染色体来替换。
可分为动物染色体工程和植物染色体工程两种。
动物染色体工程主要采用对细胞进行微操作的方法(如微细胞转移方法等)来达到转移基因的目的。
植物细胞工程目前主要是利用传统的杂交回交等方法来达到添加、消除或置换染色体的目的。
(2)染色体组工程梁色体组工程是整个改变染色体组数的技术。
自从1937年秋水仙素用于生物学后，多倍体的工作得到了迅速发展，例如得到四倍体小麦，八倍体小黑麦等。
(3)细胞质工程又称细胞拆合工程，是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。
可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研究和育种工作。
(4)细胞融合工程是用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程。
可用于产生新的物种或品系(植物上用得多，动物上用得少)及产生单克隆抗体等。
其中单克隆抗体技术利用克隆化的杂交瘤细胞分泌高度纯一的单克隆抗体，具有很高的实用价值，在诊断和治疗病症方面有着广泛的应用前途。
大规模的细胞培养可分为三个层次：单个细胞培养、组织培养和器官培养。
植物细胞和原生质体培养技术可以用于育种，也可用于各类植物的快速繁殖，在培养无毒苗、长期贮存种子和生产次生代谢产物等方面发挥作用。
动物细胞培养技术可用于制取许多有应用价值的细胞产品，如疫苗和生长因子等。
细胞融合及其在生物学研究中的应用
细胞融合及其在生物学研究中的应用在生物学中，细胞是生命的基本单位，而细胞融合则是指两个或多个细胞将其外膜融合在一起，从而形成一个新的细胞。
细胞融合在许多生物学研究中发挥着重要作用。
本文将讨论细胞融合的基本过程，以及它在细胞生物学、生理学和病理学中的应用。
一、细胞融合的基本过程细胞融合包括两个主要过程：细胞相互识别和细胞膜融合。
细胞相互识别是指细胞表面的蛋白质互相识别并相互黏附。
在许多情况下，这种识别过程是由半透明的“锁孔”和“钥匙”分子完成的，这些分子互相识别并在适当的角度和位置对齐，从而促进细胞融合。
一旦细胞相互识别，膜融合的发生通常涉及细胞膜的融合和膜蛋白的重组。
一些重要的膜蛋白，如SNARE蛋白，已经被鉴定为参与膜融合的关键分子。
二、细胞融合在细胞生物学中的应用在细胞生物学中，细胞融合通常是进行杂交实验的常用工具。
杂交实验是将两种不同种类的细胞融合在一起，形成一个新的细胞。
这种细胞可以帮助生物学家了解不同的细胞类型如何相互作用，并研究它们如何控制细胞分化和发育的过程。
此外，杂交细胞可以用作生产单克隆抗体所需的免疫细胞，这是医学和生物研究的重要工具。
三、细胞融合在生理学中的应用在生理学中，细胞融合可以用于研究细胞间信号传递的过程。
这种信号传递可以通过直接细胞间的联系或间接通过分泌信号分子完成。
在某些情况下，细胞融合可以促进细胞间的信号传递，因为它可以使细胞共享细胞膜中的受体和信号转导分子。
例如，当胰岛素细胞和肌肉细胞融合时，胰岛素受体可以被肌肉细胞所利用，从而促进葡萄糖的摄取和利用。
四、细胞融合在病理学中的应用在病理学中，细胞融合可以与某些疾病的发生和进展有关。
一些癌细胞可以通过与其他细胞融合来增强其生长和扩散的能力。
例如，某些研究表明，乳腺癌细胞可以与肝脏细胞融合，并形成肝转移性癌细胞。
此外，病毒和细菌可以通过与宿主细胞融合来感染宿主细胞，从而导致疾病的发生。
细胞融合作为一种生物学技术，在许多生物学领域发挥着重要作用。
细胞融合技术
细胞融合技术及其研究进展摘要：细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合是生物工程研究的重要内容和核心基础技术，该技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。
细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上，另一方面体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。
现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用，使细胞融合的方法和手段向操作更为简便，便于量化研究，同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。
本文主要介绍细胞融合技术的发展史及其新的研究进展，并对它们的优缺点进行简要的评述。
关键词：细胞工程细胞融合技术研究进展细胞融合技术是近20多年来迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术。
细胞融合利用现代科学技术，把不同种生物的单个细胞融合成一个细胞。
这个融合后的细胞可以培养成为新的物种、品系或成为新的细胞工程产品。
这项技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段。
而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值。
特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。
随着细胞融合技术研究的不断深入，其发展前景及其产生的影响将日益显著。
1细胞融合及其意义1.1细胞融合的概念所谓细胞融合就是指在外力 (诱导剂或促融剂 )作用下，两个或两个以上的异源 (种、属间 ) 细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合或细胞杂交。
如取材为体细胞则称体细胞杂交[ 1 ]。
体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞。
由此形成的杂交细胞，具有新的遗传或生物学特性。
1.2细胞融合的意义细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。
它的意义在于：一方面它打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，扩大了遗传物质的重组范围。
细胞融合在肿瘤转移中作用的研究进展
【 Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ 】Ｃ ｅ ｌ ｌ ｆ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｉ ｓ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｂ ｙ ｔ ｈ ｅ ｏ ｒ ｇ ａ ｎ ｉ ｓ ｍ ｓ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｏ ｆ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｎ ｄ ａ ｄ ｙ ｎ ａ ｍ ｉ ｃ ｅ ｑ ｕ ｉ ｌ ｉ ｂ ｒ ｉ ｕ ｍ ． Ｔ ｕ ｍ ｏ ｒ ｄ ｅ —
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物理方法诱导细胞融合的进展
细胞融合方法有生物法、 细胞融合方法有生物法、化学法 生物法 和物理法，其中生物方法因病毒制备 和物理法， 困难、操作复杂、 困难、操作复杂、灭活病毒的效价差 异大、实验的重复性差、 异大、实验的重复性差、融合率很低 目前， 等。目前，这种方法主要适用于动物 细胞融合，用于实验室。 细胞融合，用于实验室。化学法因为 存在对细胞损伤大、残存毒性、融合 存在对细胞损伤大、残存毒性、 率较低及经验性大等缺陷， 率较低及经验性大等缺陷，目前应用 也不广。 融合频率高， 也不广。而物理方法因 融合频率高， 是PEG的100倍；操作简便、快速； 操作简便、快速；
病毒介导的宿主细胞融合机制研究
病毒介导的宿主细胞融合机制研究病毒介导的宿主细胞融合是一种非常重要的生物学现象。
它通常发生在病毒感染宿主细胞后，病毒利用宿主细胞的膜融合机制，将自己的遗传物质输送到宿主细胞内，从而实现自身复制和传播的目的。
而了解这一现象的机制，不仅对于病毒学相关研究具有重要意义，同时也能进一步加深我们对细胞膜融合机制及其生物学意义的认识。
针对病毒介导的宿主细胞融合机制的研究，近些年来进展迅速。
这里将从四个方面进行讨论。
一、病毒膜蛋白负责介导融合病毒侵入宿主细胞的过程中，常利用其外层膜上的膜蛋白介导与宿主细胞的膜融合。
比如爆发性病毒的膜蛋白质作为介导途径结构上构建而成，能够直接穿透细胞膜进入宿主细胞内部，而不发生囊泡的形成。
经过相关免疫学实验，也证实这类病毒的膜蛋白质可以单独介导细胞膜的融合过程。
另外，一些其他类型的病毒（如HIV）在侵入宿主细胞时则主要依靠宿主细胞膜表面的整合素蛋白进行膜融合。
整合素蛋白是细胞膜上的糖蛋白，负责介导细胞与细胞之间，或者细胞与基质之间的黏附。
在一些特定条件下，整合素蛋白的构型会发生变化，从而将细胞膜推向宿主细胞膜，促进两者的融合。
这些研究结果进一步加深了我们对于病毒膜蛋白和整合素蛋白介导膜融合的理解。
二、病毒RNA结构与融合过程相关近年来，一些研究人员也开始探讨病毒RNA结构与膜融合的关系。
例如在HIV中，病毒的基因组经过一系列的RNA剪切、剪接等过程，从而生成了多种不同的转录本。
而其中一个转录本会生成一种名为TAR的RNA片段，它与病毒膜蛋白之间存在一种特殊的相互作用，能够诱导病毒RNA和细胞质膜的结合，最终完成膜融合的过程。
除此之外，在流感病毒等其他类型的病毒中，研究人员也发现细菌毒素部分中含有一种特殊的RNA结构，也能够协同病毒膜蛋白介导膜融合。
这些研究结果表明，病毒的RNA结构在膜融合过程中可能扮演了非常关键的角色。
三、宿主细胞表面蛋白参与介导融合除了一些特定的病毒膜蛋白和整合素蛋白外，宿主细胞表面的其他蛋白质分子也被发现可以介导病毒与宿主细胞的 RNA 膜融合。
细胞融合技术及其进展
细胞融合技术及其进展
王克明
【期刊名称】《浙江科技学院学报》
【年(卷),期】2004(16)2
【摘要】自1958年Okada首次表明紫外灭活的仙台病毒可以诱导体外培养细胞融合形成多核体以来,细胞融合技术得到了迅速发展和应用.以聚乙二醇(PEG)为代表的化学融合方法在生物、遗传、医药学等研究领域取得了可喜的成绩.自1978年报道电脉冲诱导细胞融合成功以来,Zimmermann 及其同事将细胞电介质电泳引入诱导细胞间接触,创立了物理的实用的Zimmermann 电融合法.现在,电融合法已由非特异性的细胞电融合发展为特异性电融合法.激光诱导细胞融合技术成为目前的研究热点,但此项技术尚处于发展初期,有待于进一步完善.本文综述了PEG化学融合法,电融合领域的新进展和激光诱导细胞融合技术.
【总页数】4页(P113-116)
【作者】王克明
【作者单位】浙江科技学院,生物与化学工程系,浙江,杭州,310023
【正文语种】中文
【中图分类】Q813.2
【相关文献】
1.植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 [J], 李杰;黄敏仁;王明庥;蔡汝
2.细胞融合技术研究进展 [J], 李保华
3.细胞融合技术研究进展 [J], 崔彬彬;朱维红;冯大领
4.细胞融合技术的应用研究进展 [J], 霍乃蕊;孟利梅
5.体细胞融合技术在病毒学方面应用的研究进展 [J], 肖扬名
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细胞融合技术研究进展年级专业课程学生姓名学号指导教师摘要：人们对细胞融合的机理、融合方法的了解越来越多，其应用范围也越来越广。
对细胞融合的机理、方法、应用及目前存在的问题进行了综述。
关键词：细胞融合;机理;方法;应用细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉骨骼胎盘的发育[1]、肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供了有力的手段[2],而且被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单克隆抗体[3-4]及动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。
1细胞融合的机理最近研究表明,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞内的膜泡融合有许多相似之处,即带包被的病毒(或细胞)通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。
I类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素(HA)和人类免疫缺陷病毒包被蛋白,它们都具有相似的结构域,即都具有a-螺旋结构。
病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程(伴随有构象的变化)的。
细胞内的膜泡融合也是如此,其相关融合蛋白包括GTPases及SNARE家族。
因此推测细胞融合采用相似的机理。
然而细胞融合蛋白并不全具有a-螺旋结构,提示a-螺旋并非融合所必需[2]。
2细胞融合的方法2.1生物法自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新台阶。
解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。
2.2化学法2.2.1盐类融合法此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。
盐类融合剂对原生质体的破坏小。
今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。
2.2.2高钙和高pH值融合法Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。
Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。
提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。
2.2.3聚乙二醇融合法(PEG法)加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。
此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。
在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。
2.3物理法2.3.1电脉冲诱导细胞融合技术电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。
该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。
2.3.2激光融合技术1987和1989年德国海德堡理化研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟[7]。
该法可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌无毒性,但它只能逐一处理细胞。
2.3.3空间细胞融合技术植物细胞融合过程中由于地球重力的存在,有无液泡的原生质体密度差很大,异源细胞融合率低[8]。
在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中,在地面上由于无法排除地球重力的影响,要提高B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。
20世纪80年代以来,在空间材料科学的启发下,试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。
2.3.4离子束细胞融合技术。
20世纪80年代证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在,建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系,据此原理发展了该技术。
离子束的可操纵性高,可用微束对细胞进行超微加工,有目的地切割染色体,通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的[9]。
该项研究一旦成功,将改变传统的一对一细胞融合的弊端,减少供体细胞导入的染色体范围,使融合更具目的性,大大减少筛选的工作量,将是细胞融合研究的一大进步。
2.3.5非对称细胞融合技术。
即利用某种外界因素(如γ射线)辐照某一细胞原生质体,选择性地破坏其细胞核,并用碘乙酰胺碱性蕊香红6 G,处理在细胞核中含有优良基因的第2种原生质体,选择性地使其细胞质失活。
然后融合来自这2个原生质体品系的细胞,实现所需胞质和细胞核基因的优化组合。
实践表明非对称细胞融合技术通过γ射线X 射线照射为实现供体亲本少数基因的转移,创造种间、属间杂种提供了可能性[10]。
3细胞融合的应用3.1动物细胞融合技术的应用3.1.1用于研究细胞的核质关系。
Prescott等1972年首先应用离心术结合细胞松弛素B分离哺乳类动物细胞的胞质体获得成功,为研究哺乳类细胞的核质关系、细胞质基因的转移开创了新途径[11]。
3.1.2用于揭示疾病发生的机制。
细胞融合是一种揭示疾病机理的有效方法。
Lattanzi等将细胞融合技术与免疫荧光、生化分析、电镜技术相结合,对肌肉萎缩症发生的机理进行了研究并取得较大的进展[12]。
细胞融合技术与显微技术相结合可以研究膜蛋白动力学以及这些膜蛋白之间的关系,Aguilar等研究发现,多次跨膜蛋白Prm1在酵母细胞的结合现象中起重要作用,该蛋白缺陷的突变体不能完成质膜之间的识别与融合[13],这有助于了解禽流感病毒的致病机理。
3.1.3用于基因定位研究。
JP2杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与细胞的某一性状表达与否相联系,从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。
1967年Weise等发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,利用这一特点可以对人染色体上的基因进行定位。
3.1.4用于衰老机制研究。
Tam等采用细胞融合的方法在干细胞研究中揭示了衰老的分子机制:衰老是一个可逆的过程,它决定于直接或间接控制端粒长度及端粒酶活性的生物分子之间的平衡作用,通过改变染色质的状态进而进行表观遗传修饰调节基因表达[14]。
3.1.5动物细胞融合用于动物育种动物体细胞融合后,杂种细胞一般难以发育再生为一个个体,但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内,可培育出新的杂种。
3.1.6动物细胞融合用于生产单克隆抗体Zou等应用细胞融合技术和酶连免疫技术成功制备出一种新基因Urg11的抗体[3]。
单抗试剂盒可对一些过敏性疾病查找过敏源(抗原检测),癌症、性病、妊娠、妇女月经排卵等进行早期诊断。
3.1.7动物细胞融合用于细胞疗法SCNT(Somatic cell nu-clear transfer)将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合,融合子进行有丝分裂形成囊胚,囊胚的内细胞团是多能干细胞,对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植,不仅解决了器官和组织来源问题,而且避免了宿主对外来物的免疫排斥。
Lagutina等的研究工作解决了动物体细胞与去核卵细胞融合率低的问题[15]。
3.2植物细胞融合技术的应用3.2.1基础理论研究Yamagishi等设计了一种新的高效原生质体培养体系,增加了不对称杂交属内种间细胞融合率[16]。
可以设想,细胞融合技术改善后,可把人参和冬虫夏草的细胞融合产生新的品种,并具备它们各自特有的药效。
3.2.2改善作物品质杂种优势现象在生物界普遍存在,利用这一现象是提高农作物品质和产量的有效途径之一,即可以利用雄性不育系进行杂交一代种子生产。
核基因控制的雄性不育的保持系很难解决,而细胞质雄性不育的不育系、恢复系和保持系较易通过体细胞杂交短期内得到。
3.2.3培育抗逆植株Shelley用马铃薯二倍体作亲本经过体细胞杂交得到抗科罗拉多马铃薯甲虫的四倍体体细胞杂种;Bastia等对耐霜冻的野生种和栽培种进行体细胞杂交,获得的所有体细胞杂种都比栽培种亲本耐霜冻,其中有3株比野生种亲本的耐性还高[17]。
3.2.4应用于种质保存和有用物质生产目前可将各种细胞器、DNA、质粒、病毒、细菌等外源遗传物质引入原生质体,从而有可能引起细胞遗传性的改变,为某些珍稀植物的快速繁殖、植物的复壮提供可行的方法,还可应用于种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质生产[18]。
3.3微生物细胞融合技术的应用微生物细胞融合技术一方面用于生物药品的生产,包括抗生素、生物活性物质、疫苗等;另一方面为发酵工业提供优良菌种,如酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交,分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。
4目前存在的问题及前景细胞融合的确切机理至今仍不清楚,融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等性状出现,此外,细胞融合也存在伦理方面的问题,如将人的细胞核植入牲畜细胞核内,难免会使牲畜遗传信息传入人的细胞核内,如果用于医疗,将是非常危险的。
任何事物都是一把双刃剑:了解细胞与细胞融合的机理有望对诸如细胞凋亡、神经系统发生、肿瘤发生、干细胞生物学等生命现象作出诠释,对癌症及传染病进行有效的防护和治疗。
人体皮肤细胞与动物卵母细胞融合有望克隆出人类胚胎,用于治疗性克隆研究,获取人类胚胎干细胞,再在体外诱导分化,克隆出人体全身所有组织和器官。
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