变形链球菌gtf在不同蔗糖浓度下的差异性表达

[要成分是EPS，尤其是水不溶性多糖[6]。GTFs是变性
链球菌以蔗糖为底物合成水溶性和水不溶性葡聚糖的关键酶。研究证明变链有多个GTFs， 并有不同的生物学作用[3]，且不同菌株的变链的GTFs致病性是有差异的。 本实验结果显示，各菌株在含有蔗糖的培养条件下，水溶性和水不溶性葡聚糖的产量 均较在 1%葡萄糖条件下显著升高，且产量随着蔗糖浓度的升高而升高。高产糖株在各培养 条件下水溶性和水不溶性葡聚糖产量均较低产糖株高。 根据以上结果， 本实验选取了产糖能 力最高的临床分离株 502 以及产糖能力较弱的标准株 UA159，对此生化学现象进行基因学 上的进一步探讨。 gtfA 是 Robeson[10]于 1983 年发现的一个与变链产糖相关的基因。Russell[11]于 1988 年 分析指出 gtfA 应为存在于细胞内的蔗糖磷酸化酶的编码基因。Pucci[12]和 Marcina[13]等报道 插入失活该基因导致变链合成水溶性葡聚糖的量减少，并发现 GTFA 可以合成小分子量的 水溶性葡聚糖， 且认为此水溶性葡聚糖可作为变链合成水不溶性葡聚糖的引物。 本实验两株 细菌的 gtfA 在 1%蔗糖条件下的表达均升高，显示蔗糖有诱导 gtfA 表达的作用，且其表达 升高的趋势与 gtfB,C,D 一致，提示了 gtf 各基因在功能上有协同作用。实验结果还显示 gtfA 在 2%蔗糖条件下的表达无明显变化。Chassy[15]和 Tazer[16]等报道变链仅利用 2-5%的蔗糖快 速的合成细胞外多糖使细菌粘附至牙面，Hudson[9]报道当合成的细胞外多糖到达一定量时， 变链会迅速的启动一些机制阻止继续合成胞外多糖。 因此笔者认为， 在培养基中蔗糖的浓度 为 2%时，细菌生长可利用的糖源更加充足，合成足量胞外多糖所需的时间更短，而实验中 所有样本的取样时间均为 16h， 主要合成胞外多糖的 gtfB,C,D 的表达已经由高峰回落， 结合 gtf 各基因的协同作用，认为 gtfA 的表达亦由高峰降低。此结果也证实了变链合成胞外多糖 的量有一定限制的。 研究表明 GTFD 的作用主要是合成水溶性葡聚糖。Fujiwara[8]等报道 gtfD 的稳定表达 对变链的蔗糖依赖性粘附有关键性的作用，并认为 GTFD 是被分泌至唾液中的而不像 GTFB,C 位于细胞壁上；因为在唾液中 GTFD 会被稀释，故为发挥其在牙面粘附中的作用， gtfD 的表达水平较高。Kuramitsu[17]等报道部分 GTFD 合成的水溶性葡聚糖还被 GTFB,C 用 来进一步合成水不溶性多糖。本实验发现，在各培养条件下，临床分离株 502 的 gtfD 表达 量在指数生长后期仍稳定在略高于 100%的水平， 同时 gtfB,C 两者或至少其中之一的表达量
表1 gtfA,B,C,D及recA的引物设计
基 因 名称 gtfAF gtfAR gtfBF gtfBR gtfCF gtfCR gtfDF gtfDR RecA -F RecA -R CTTCCTTAAATGGTGGAGCAAC GTGCGGAGATTGACGGAGATA TGCCGCCTTATCATCCTCACT TACCTTGGGCACCACAACACT GCCTACTGGAACCCAAACACCTA GTGCGCTACACCAATGACAGAG GCCATGTATTGCCCGTCATCT TGCCGCAGTCCCTTCTTATTC CTTCAATACGGCCATCCAAATC AGGTCGGTGCCAATGTCAATC 引物
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本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金的资助。 -1-

厌氧培养 16h，离心，弃上清液。用蒽酮法测定水溶性和水不溶性葡聚糖含量。每个样品一 式三份。
1.3 real-time PCR 对各基因的定量检测
1.3.1 RNA的提取：根据以上合成细胞外多糖试验，选取在各培养条件下产水不溶性多 糖(WIG)及水溶性多糖(WSG)均较高及较低的两株菌代表高、低产糖株，分别取其三种不同 培养条件的10mL菌液，按TRIZOL（Invitrogen）试剂说明书抽提细胞总RNA。取5µL RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。取5µL RNA样品用紫外分光光度计检测A260／A280。 1.3.2 引物设计：采用primer premier 5软件对gtfA,B,C,D及recA进行引物设计，见表1。
1 实验材料和方法
1.1 菌株和培养基
菌株采用本课题组前期研究所获的变链菌 ( 血清型 c) 临床分离株 20 株和标准菌株 UA159。培养基采用 TPY 培养基。
1.2 合成细胞外多糖试验
冻干变形链球菌临床株复苏、形态学鉴定后接种于 TPY 固体平板，厌氧培养 48h，挑 取单菌于相同条件下培养 24h 增菌。按照菌液与培养基 1:10（v/v）比例接种于以下三种不 同的培养基：含 1%葡萄糖的 TPY 培养基（对照组） ，含 1%和 2%蔗糖的 TPY 培养基。37℃
1.3.3 RT-PCR:处理的 RNA 按照 cDNA 合成试剂盒合成 cDNA。在 0.5 ml PCR 反应管 中，25µL 反应系统：0.5µL/dNTP 1µL(2.5mM)/foward Primer 1µL (10µM)/reverse Primer 1µL (10µM)/10×PCR buffer 2.5µL/Taq DNA Polymerase 0.5µL/H2O 18.5µL。 PCR 反应参数为： 95℃ 1min； （94℃ 30s； 58℃ 30s；72℃ 30s）×40 次循环。反应产物取 5µL 做电泳检测。 1.3.4 real-time PCR： 在 0.2 ml PCR 反应管中， 50µL 反应系统：cDNA 1µL/foward Primer 1µL (10µM)/reverse Primer 1µL (10µM)/2× Platinum SYBR Green qPCR SuperMix(Invitrogen) 25µL/H2O 22µL。 PCR 反应参数为： 50℃ 2min； 95℃ 2 min； （94℃ 30s； 58℃ 30s； 72℃ 60s） ×45 cycles；95℃ 1 min；55℃ 1min；55℃ 10s×80 cycles，每 cycle 温度升高 0.5℃。反应产 物取 5µL 做电泳检测。

变形链球菌 gtf 在不同蔗糖浓度下的差异性表达1
陆玉，刘天佳*，杨锦波
四川大学华西口腔医学院，成都（610041）
E-mail：liutianjia822@
摘 要：目的 检测具有不同产胞外多糖能力的变形链球菌株在不同培养条件下产胞外多糖 (EPS)的能力及其与 gtfA,B,C,D 表达变化的关系。材料与方法 选取高产糖与低产糖的临床 分离株各 10 株及标准株 UA159，用蒽酮法分别检测其在 1%蔗糖和 2%蔗糖培养条件下产 EPS 的能力。再以 real-time PCR 方法检测在这些条件下与变链产糖能力密切相关的毒力因 子 gtfA,B,C,D 的表达变化。结果 蔗糖在各菌株均能诱导 EPS 的产生。在 1%蔗糖浓度下， 高产糖株与低产糖株的 gtfA,B,C,D 表达均有不同程度升高。在 2%蔗糖浓度下，低产糖株的 gtfB,C,D 表达均不同程度降低，gtfA 略有升高；高产糖株的 gtfB,D 表达略有升高，gtfA,C 略有降低。结论 gtfs 的表达水平与变形链球菌的致龋力密切相关。 关键词：变形链球菌，葡萄糖基转移酶，real-time PCR 龋病是一种细菌感染性疾病，其发生以致龋菌在牙面的粘附为首要条件。变形链球菌 是主要致龋菌，它能够以蔗糖为底物合成的细胞外葡聚糖，介导细菌对牙面牢固的粘附，从 而增强变链致龋作用[1]。葡萄糖基转移酶（GTFs）是变形链球菌自发合成的固有酶，可以 特异性的以蔗糖为底物合成细胞外葡聚糖，变形链球菌至少产生三种葡萄糖基转移酶 GTFB，GTFC，GTFD，是变链重要的毒力因子。 GTFB 主要合成水不溶性葡聚糖；GTFC 既合成水不溶性葡聚糖又合成水溶性葡聚糖； GTFD 主要合成水溶性葡聚糖。以往对 GTFs 的研究发现这些酶紧密相关且其产物有免疫学 上有交叉反应，因此对其产物进行免疫学上的研究较为困难[2]。gtfB 和 gtfC 在基因组中呈 前后邻接排列，其表达似乎有很强的相关性，但是也有研究显示 gtfB 和 gtfC 有不同的启动 子[3]。故对 GTFs 编码基因 gtfs 在蔗糖依赖性粘附中的动态表达，我们还知之甚少。同时有 报道称编码蔗糖磷酸化酶的 gtfA 也与变链的蔗糖依赖性粘附有密切关系[4]。 另外，本课题组前期的实验发现，部分高龋患者仅能分离出低致龋毒力株，而部分无 龋患者仍能分离出高致龋毒力株， 这仅由变形链球菌的血清型和致龋毒力因子遗传多态性难 以完全解释，由此认为变形链球菌致龋毒力因子表达水平也影响龋病的发生。real-time PCR 是一种敏感、高效且可靠的定量检测 RNA/DNA 的方法。本实验的目的即定量的检测变形 链球菌在不同蔗糖浓度条件下 gtfs 的表达变化。
表2 各基因的扩增效率和相关系数
基因名称 gtfA gtfB gtfC gtfD recA
扩增效率 99.3% 96.0% 99.5% 97.0% 99.9%
相关系数 0.991 0.992 0.996 0.997 0.992
溶解曲线 单一峰值 单一峰值 单一峰值 单一峰值 单一峰值
2.2.4 染料法real-time PCR是一种相对定量的检测不同条件下， 目的基因在细胞中不同 的转录效率的方法， 即基因的差异化表达。 需要计算目的基因在样品与对照品间表达差异的 倍数，本实验以各菌株在含1%葡萄糖TPY培养基中的基因表达水平为对照组，检测在其他 培养条件下目的基因的表达变化情况。结果见图1，图2：
2.2 realtime-PCR 的结果
2.2.1 细菌RNA提取：电泳结果显示各组细菌提取的总RNA均完整无降解。所有实验 菌株总RNA的A260／A280>1.9， A260／0.025×40>500µg/ml，达到抽提的要求。 2.2.2 RT-PCR的结果表明，设计的引物均能有效扩增目的基因，且扩增特异性高。 2.2.3 各基因的扩增效率和相关系数见表2。