基因工程的酶学基础课件

基因工程的酶学基础
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一、限制性内切酶的发现
1. 细菌限制修饰系统的发现 • 20世纪60年代在研究噬菌体的寄主范围时发现的。 • 从天然宿主大肠杆菌K中分离得到的λk噬菌体，当
其感染B菌株时，感染率仅为10-4，分离得到幸存 的子代λk病毒，再用其感染B菌株，感染率为 100%；若再用其感染K菌株，感染率又降为10-4。 此现象称为宿主限制现象。
其中，N为任意碱基。
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回文诗
悠悠绿水傍林偎， 日落观山四望回。 幽林古寺孤明月， 冷井寒泉碧映台。 鸥飞满浦渔舟泛， 鹤伴闲亭仙客来。 游径踏花烟上走， 流溪远棹一篷开。
开篷一棹远溪流， 走上烟花踏径游。 来客仙亭闲伴鹤， 泛舟渔浦满飞鸥。 台映碧泉寒井冷， 月明孤寺古林幽。 回望四山观落日， 偎林傍水绿悠悠。
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（1）在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。 靠近5’ 端切割产生 5' 端突出的粘性末端，如 EcoRI ：
5' …G▼AATT C…3' EcoR I 5' …G 5’AATTC…3'
3' …C TTAA▲G…5'
3' …CTTAA 5’ G… 5'
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（2）靠近 3' 端切割产生3' 端突出的粘性 末端。如Pst I：
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（二）切割位点的特异性
1.DNA分子酶切片段的末端
• 切割：水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的 DNA片段5’端为磷酸基，3’ 端为羟基。
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• 酶切后产生的片段末端有黏性末端和平末端 等形式。
• 黏性末端：DNA分子在限制性内切酶的作用 下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末 端结构。它们能够通过互补碱基间的配对而 重新连接起来。
• 外切核酸酶（exonuclease） • 内切核酸酶（endonuclease）
• 根据作用的核酸底物不同，分为：
• RNA酶 • DNA酶 • 底物非专一性核酸酶
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6.1 限制性内切酶
• 定义：限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序 列, 并在识别位点或其周围切割双链 DNA的一类内切酶。
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2. 限制酶HindIII的发现
• Smith 等于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现 并分离到HindIII限制酶。
3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制
• Nathans（1971年）用HindIII绘制SV40的限制酶谱。
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• Ⅲ型酶：有专一的识别序列，但不是对称的回 文序列，在识别序列旁边的位置上切割双链。 切割后产生的DNA片段具有各种单链末端。
• Ⅳ型酶：新鉴定出的一种酶，目前无应用。
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三、限制性内切酶的命名
• 命名原则： 属——种——株——分离序号
例如：EcoRⅠ 属：Escherichia 种：coli 株：R 分离序号：Ⅰ
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命名
HindⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属种 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
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四、Ⅱ型限制内切酶的基本特性
5' …C TGCA▼G…3' Pst I 5' …CTGCA3’ G…3'
3' …G▲ACGT C…5'
3' …G 3’ACGTC… 5'
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（3）在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或 称钝性末端（blunt end），如SmaI：
5' …CCC▼GGG…3' Sma I 5' …CCC GGG…3'
第六章 基因工程的酶学基础
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• 限制性内切酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶和反转录酶 • DNA修饰酶 • 外切核酸酶 • 单链内切核酸酶 • RNA酶
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• 核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而使核酸分子断链。
• 根据水解的不同方式，分为：
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• 有些限制性内切酶的识别序列中，某一位或二位碱 基并非严格专一，但不影响其作用位点，只是增加 酶的识别和作用频率。如HindⅡ识别序列为-GTYRAC--，其中Y表示C或T，R表示A或G。
• 有的酶识别6个以上的核苷酸序列，称为稀有限制 性内切酶，如NotⅠ，识别序列为（GCGGCCGC）
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二、限制性内切核酸酶的类型
• 已经鉴定出的限制性内切核酸酶可分为4种不同类型： • Ⅰ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别位点附近的核苷酸
切割DNA双链，但切割序列是随即的，无专一性。在基因工程中 应用不大。 • Ⅱ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别序列的固定位置切 割双链DNA分子，是基因工程中最常用的工具酶。
（一）识别序列的特异性
• 大多数Ⅱ型限制内切酶的识别序列长度为4~6bp， 具有双重旋转对称结构的回文序列（palindromic sequence）。
BamHⅠ：
GGATCC CCTAGG
❖如果识别序列由5对碱基组成，其对称轴为
中间的一对碱基，如MaeⅢ的识别序列为：
--GTNAC---CANTC--
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• 各种细菌都能合成一种或几种能够切割双链DNA 的内切核酸酶，以此来限制外源DNA在自身细胞 内的存在。
• 几乎所有的限制性内切酶都和能识别甲基化相同 DNA位点的甲基转移酶共同作用，构成限制-修饰 系统。
• 宿主细胞的DNA被甲基转移酶修饰而被保护起来， 不被限制性内切酶识别，从而使自身DNA免受降 解。
3' …GGG▲CCC…5'
3' …GGG CCC… 5'
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2.同切点酶（或同裂酶，isoschizomer）
• 同裂酶：是一类来源于不同的微生物、能识别相 同靶序列的限制性内切核酸酶。
识别序列相同，切割位点不同
例：SmaⅠ CCC ↓ GGG XmaⅠ C ↓ CCGGG