核酸的序列分析PPT课件

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碱基特异性修饰及裂解
反应体 系
G
碱基修饰试 剂
硫酸二甲酯
碱基修饰反 应
主链断裂试 剂
断裂点
鸟嘌呤甲基 化
六氢吡啶
G
G+A
甲酸
脱嘌呤作用 六氢吡啶 G和A
C+T
肼
嘧啶开环 六氢吡啶 C和T
C
肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶
C
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化学法读序
每组测序图谱为4条垂直的阶梯带，该片从胶底部一 个个向顶部读，G+A和C+T两列中含有所有相差一个碱基的 DNA片段。如果G+A中出现1条带就看G列中是否有同样大小 的带，若有即为G碱基，无则为A碱基；同理，C+T中则检 查C列中有无同样大小条带，有即为C，无则为T。
从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200-300bp以内
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化学裂解法的特点
• 优点： 1、所测序列直接来源于所测 DNA ，避免了 DNA 复制中错误 dNTP 的掺入。
2、可直接对合成的寡核苷酸测序，可分析甲 基化修饰等，以及研究 DNA 的二级结构及蛋 白质与 DNA 的相互作用等。
C reaction
TCG TCGA
G reaction A reaction
每一管中的复制的序列都停留在ddNTPs 处
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7源自文库
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反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离.
这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基.
电泳结构通过显色指示. TCGA
3’
C C T T T A G C T
• 缺点： 操作复杂，读序困难。
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5.3 DNA测序自动化和大规模测序
特点
原理同末端终止法
标记物为荧光染料
激光扫描自动测序
结果清晰、准确、分辨率高
测序速度快 200bp/h
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DNA自动测序与手工测序的不同点
1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动 测序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物
一、化学裂解法测序的原理
1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端
2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系
3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断 裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一 端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的 DNA片段的混合物
4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图 谱，即可读出DNA序列
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测序的常用方法
1、末端终止法 2、化学裂解法 3、DNA测序自动化
优点
使用特异性引物 与单链模板DNA退 火，在DNA聚合酶 作用下进行延伸 反应，用ddNTP终 止，用PAGE区分 长度仅相差1个核 苷酸的ssDNA，从 而完成测序的方 法。
简便、迅速、应 用广泛。
用化学试剂在A、G、 类似末端终止法，所 C、T处特定的裂解 不同的是用荧光染料 DNA片段，产生一簇 标记，计算机自动读 各种长度的短链， 出。 经过PAGE放射自显 影可直读DNA顺序。
不需酶促反应，可 1、高负荷，1块胶可
以对寡核苷酸测序。 测16个样品；2、机
读不需放射自显影；
3、安全不用同位素；
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4、简单迅速。 3
5.1. Sanger双脱氧链终止法(dideoxy-termination sequencing)
原理：双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样 直接掺入新合成的DNA链中，但因3’ 端不具OH基，DNA链合成至 此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故 可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。
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5
3’
AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’
添加 DNA polymerase 所有4 dNTPs 其中一种标记的ddNTP
在四个不同的反应管中各只包含一种ddNTP.
ddTTP ddCTP ddGTP ddATP
5'-AACTGCTG--3'
dNTP ddATP
5'-AACTGCTG-3' ddAC-5'
5’
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5.2Maxam-Gilbert化学裂解法
化学裂解法是Maxam和Gilbert等人1977年创 建的，用来测定DNA序列。化学法是用化学试剂在 A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种 长度的短链（等差数列 n=1），经过PAGE和放射 自显影后，可以直接读出DNA的顺序。
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3+6
dNTP ddTTP
5'-AACTGCTG-3' dd.TGACGAC-5'
5'-AACTGCTG-3' ddTTGACGAC-5'
7+8
6
3’ 5’
AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’
T TCGAT TCGATT TCGATTT
T reaction
TC
TCGATTTC TCGATTTCC
5'-AACTGCTG-3' ddCGAC-5'
2+5
与引物退火
dNTP ddCTP
5'-AACTGCTG-3' ddC-5'
5'-AACTGCTG-3' ddCGAC-5'
1+4
5'-AACTGCTG--3' 5'
dNTP ddGTP
5'-AACTGCTG-3' ddGAC-5'
5'-AACTGCTG-3' ddGACGAC-5'
第五节 核苷酸序列分析
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即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生 物学一项重要的技术。
1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成 胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是 一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和 Maxam----Gilbert等人又建立了核酸序列测定的 方法，Sanger双脱氧末端终止法和Maxam---Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到 “直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质 氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序 列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。
2、加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应 物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内 电泳，提高电泳分析的效率
3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡 聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序 则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑
不能和下一个核苷酸
通过磷酸二酯键连接 起来
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• 测序过程:
–1.模板与引物杂交
–2.引物的延长和合成阻断
• 四个试管分别加入 标记底物
DNA聚合酶 dNTP
• 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT
• 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个 核苷酸的聚合链
–3.电泳
–4.放射自显影得到直读图象