铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素的研究_谢红梅
铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究
复旦大学硕士学位论文铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究姓名：谢红梅申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：胡必杰20040518中文摘要背景细菌生物膜（Ｂｉｏｆｉｌｍ，ＢＦ）是细菌粘附于物体表面，并分泌大量多糖、蛋白和ＤＮＡ等多聚物质，将自身包裹于其中而形成的复杂膜状结构。
生物膜是细菌的～种保护性生长模式，广泛存在于自然界。
细菌也可定植于植入物、留置导管或人体组织表面形成生物膜。
生物膜内的细菌生物学特性与普通浮游细菌有显著差异，它具有极强的对外界化学物质的耐受性和抵抗宿主免疫系统的能力，是临床上难治性感染的一个重要原因。
近年来随着医学的发展，各种人工器官和留置导管使用的Ｒ益增多，生物膜相关感染也在不断增加，因此，研究生物膜形成影响因素及机理对于生物膜相关感染的防治具有重要意义。
第一部分铜绿假单胞菌生物膜分析方法的研究目的筛选一种有效且简单易行的生物膜分析方法方法分别采用流动培养法和静止培养法建立生物膜模型，用４种不同的方法分析：共聚焦激光扫描显微镜（ＣＬＳＭ）法、扫描电镜法、结晶紫染色法和超声振荡一活菌计数法分析生物膜的形成情况，ＣＬＳＭ观察生物膜的形态结构和厚度，扫描电镜法观察生物膜的形态结构，结晶紫染色法检测吸光度值，超声振荡一活菌计数法计数生物膜内的活细菌数。
分别将扫描电镜法、结晶紫染色法、超声振荡一活菌计数法所反映生物膜形成情况与ＣＬＳＭ结果相比较。
结果ＣＬＳＭ观察显示２４ｈ生物膜内微菌落呈稀疏散在分布，７２ｈ生物膜内细菌己形成微菌落，且许多微菌落已融合，形成稳定成熟的生物膜结构；２４ｈ和７２ｈ生物膜厚度分别为２７．６¨ｍ、６４．６ｐｒｏ。
扫描电镜法显示７２ｈ生物膜表面有大量形状不规则的基质成分，细菌被包裹于其中。
结晶紫染色法测得８ｈ、１６ｈ、２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ的吸光度值分别为０．０８土０．０４、０．２０土０．０７、０．４１士０．３３、Ｏ．４７士０．３３和０．６８＋０．３４，结果有统计学差异（Ｐ＜０．００１）。
铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控及治疗对策研究进展
ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉｍｉｔａｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｓｅｖｅｒａｌ ａｎｔｉ—ｂｉｏｆｉｌｍ
及菌细胞外ＤＮＡ也参与“帽子”形成与生物被 膜结构的成熟¨－。 １．２．３ 调控生物被膜基质形成的分子及其基 因细菌形成蘑菇状结构后，大量分泌多聚 物——菌细胞外基质包绕在蘑菇状结构之外， 形成稳固的生物被膜。基质主要由蛋白、多糖 和核酸组成，其中藻酸盐是胞外摹质多糖的主 要成分之一。基质多糖在细菌定植形成微菌落 时已开始分泌，在蘑菇状结构形成后分泌才大 量增加。藻酸盐能清除自由基，保护细菌免受 吞噬细胞的清除作用，影响牛物被膜的抵抗 性【８ Ｊ。藻酸盐产生受ａｌｇ基因的调节。铜绿假 单孢菌的ａｌｇ基因根据功能分成３种，即合成 基因、调节基因和基因转换基因。ａｉｇＤ、ａｌｇＧ基 因直接催化藻酸盐的合成；ａｌｇｚ、ａｌｇＲ和ａｌｇＢ基 因调节藻酸盐的合成；转换摹冈ａｌｓＴ、ｍｕｃＡ、 ｍｕｃＢ、ｍｕｃＣ和ｍｕｃＤ介导Ａｌｇ＋表型的转换。 ａｌｇＤ基因编码ＧＤＰ－＿Ｈ．露糖脱氢酶，其活化是藻 酸盐合成调节途径的关键点，受藻酸盐转换基 因和调节基因的调控。ａｌｇＴ基因编码ｓｉｇｍａ２２ 因子，正性调控自身的启动子ＰａｌｇＴ以及ａｌｇＲ 等调节基因的表达；而ｍｕｃ摹冈则编码反 ｓｉｇｍａ２２因子或类似负性调节因子，抑制ａｌｇＴ基 因的表达。调节基囚ａｌｇＲ与ａｌｇＴ结合后上调 ａｌｇＤ的转录和下游的合成基因∽Ｊ。产藻酸盐 黏液型菌株的增加主要是由于ｍｕｃ负性调节 基凶的突变，引起转换基因ａｌｇＴ表达增加，并 导致调节基因ａｌｇＲ和合成基因ａｌｇＤ的高水平 的转录，从而引起细菌由非黏液型向黏液表型 的转变。
铜绿假单胞菌的生物膜形成及其致病机制
铜绿假单胞菌的生物膜形成及其致病机制铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的革兰氏阴性杆菌，它产生的生物膜在其致病机制中起着重要的作用。
本文将探讨铜绿假单胞菌生物膜的形成机制以及致病机制的相关内容。
生物膜是由微生物聚集在生物界面上形成的一种复杂的结构。
它由多种微生物、水分、有机物质和矿物质组成，形成了一种稳定的生态系统。
在铜绿假单胞菌中，生物膜的形成是通过一系列复杂的步骤完成的。
首先，菌体附着在生物界面上，形成团块。
接着，菌体在团块之间建立起一种可以将细胞聚集在一起的基质。
这种基质通常由多糖、DNA以及蛋白质等分泌物组成，在保护细菌免受外界环境的侵害方面起到了重要的作用。
最后，菌体在这种环境中继续增殖，形成三维的生物膜结构。
生物膜的形成使得铜绿假单胞菌具有了许多特殊的性质，这些性质有助于其在致病过程中的适应和存活。
首先，生物膜提供了一种有效的保护罩，使得菌体免受抗生素和宿主免疫系统的攻击。
这也是为什么铜绿假单胞菌常常引起慢性感染的原因之一。
其次，生物膜提供了菌体相互作用和信号传递的平台，从而增强了菌体的适应能力和生存能力。
此外，生物膜还为菌体提供了营养物质，以支持其生长和繁殖。
铜绿假单胞菌生物膜形成的致病机制主要与其产生的一些分泌物有关。
其中，腺嘌呤环化酶是铜绿假单胞菌生物膜形成的关键酶之一。
腺嘌呤环化酶能够将腺嘌呤转化为二鸟苷酸（c-di-GMP），从而促进生物膜的形成。
c-di-GMP是一种重要的信号分子，能够调控一系列与生物膜形成相关的基因表达。
除了腺嘌呤环化酶，铜绿假单胞菌还能产生一些胞外信号分子，如N-3-氧代十二碳烯酰-L-丙氨酸（3O-C12-HSL）和N-但酰-L-丙氨酸（C4-HSL）。
这些信号分子能够介导菌体之间的相互作用和协调菌群行为，进一步促进生物膜的形成。
铜绿假单胞菌的生物膜形成和致病机制还与许多其他因素有关。
例如，菌体与宿主细胞表面的相互作用以及细胞外基质的组成都会影响生物膜的形成和稳定性。
铜绿假单胞菌及其生物被膜影响A549细胞分泌细胞生长因子的实验研究
铜绿假单胞菌及其生物被膜影响A549细胞分泌细胞生长因子的实验研究王非;赵玮;王媛;夏永良【期刊名称】《浙江中西医结合杂志》【年(卷),期】2011(021)012【摘要】目的:通过观察经铜绿假单胞菌及其生物被膜作用后,肺泡上皮细胞A549分泌细胞生长因子水平的变化,探讨其在成纤维细胞活化和增殖及分化中的作用.方法:采用体外诱导铜绿假单胞菌形成生物被膜,应用乙醇沉淀法提取细菌被膜并纯化;选用人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549为靶细胞、采用ELISA法分别定量检测经铜绿假单胞浮游菌及其生物被膜藻酸盐作用后上皮细胞分泌生长因子TGF-B1、FGF-2、CTGF、IGF-1表达量.结果:受铜绿假单胞生物被膜藻酸盐作用后,A549细胞表达TGF-B1、FGF-2、CTGF和IGF-1能力明显增强,CTGF在藻酸盐作用后24h达到高峰后缓慢下降,其余3种生长因子均在在藻酸盐作用后48 h内持续升高,与对照相比较,差异有统计学意义(P<0.05);浮游菌作用后4种生长因子表达量无明显增加.结论:铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐可增强A549细胞对TGF-β1、FGF-2、CTGF和IGF-1分泌能力.【总页数】3页(P837-839)【作者】王非;赵玮;王媛;夏永良【作者单位】浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006;浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006;浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006;浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006【正文语种】中文【相关文献】1.铜绿假单胞菌生物被膜诱导肺泡上皮细胞分泌炎性细胞因子的研究 [J], 王非;王媛;赵玮;骆仙芳2.胞壁酰二肽对烟曲霉孢子刺激A549细胞分泌细胞因子的影响及其可能机制 [J], 张辉军;王葆青;瞿介明3.铜绿假单胞菌生物被膜对抗菌药物作用影响的实验研究 [J], 冯星火;赵广福;崔连东;关欣;王宏达4.生物被膜铜绿假单胞菌相关肺感染的实验研究 [J], 关欣;郑红光5.亚胺培南联合阿奇霉素治疗铜绿假单胞菌生物被膜感染的实验研究 [J], 方向群;刘又宁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
铜绿假单胞菌生物被膜形成能力与基因型的相关性分析
铜绿假单胞菌生物被膜形成能力与基因型的相关性分析程曦;杨维青;石磊;尹晓琳;谢轶;曾蔚;李心晖;苏建裕;寇亚丽;贾文祥【期刊名称】《四川大学学报：医学版》【年(卷),期】2006(37)5【摘要】目的探讨铜绿假单胞菌(PA)临床分离株的粘附性、生物被膜形成能力及其与基因型的相关性。
方法采用改良的微量平板法对临床分离的48株PA生物被膜的形成进行定量分析;通过肠杆菌基因间重复一致序列-PCR(ERIC-PCR)技术绘制48株PA的指纹图谱,应用计算机软件建立遗传相似性系数矩阵及聚类分析树状图。
结果48株临床分离PA菌株生物被膜的形成能力不同。
生物被膜形成能力不同的PA在基因型上表现出多态性,PA在17%遗传相似性系数上分为A、B、C、D、E五个基因型,生物被膜形成能力强的PA大都属于D型,其遗传相似性系数为42%。
结论绝大多数临床分离的PA株具有较强的生物被膜形成能力;生物被膜形成能力不同的PA在基因型上表现出多态性;生物被膜形成能力较强的PA在基因型上表现出一定的相似性。
【总页数】4页(P666-669)【关键词】铜绿假单胞菌;生物被膜;基因指纹图谱;基因型【作者】程曦;杨维青;石磊;尹晓琳;谢轶;曾蔚;李心晖;苏建裕;寇亚丽;贾文祥【作者单位】四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室;华南理工大学食品与生物工程学院;河北医科大学基础医学院【正文语种】中文【中图分类】R387.991【相关文献】1.铜绿假单胞菌基因型与生物被膜形成能力的分析 [J], 石磊;寇娅丽2.连翘苷对铜绿假单胞菌黏附功能及生物被膜形成能力的影响 [J], 王业梅;程惠娟3.密度感应对铜绿假单胞菌运动能力及其生物被膜形成调控的研究 [J], 温红侠;陈一强;宋志军;吴红;王恒壮;闫萍;孔晋亮4.60例医院获得性肺炎患者铜绿假单胞菌生物被膜形成能力的分析 [J], 李镛;张柏膺;严峻海5.痰热清对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响作用分析 [J], 刘佳; 王钧; 孙聪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
铜绿假单胞菌的生物膜形成与抗菌药物耐受性相关性探究
铜绿假单胞菌的生物膜形成与抗菌药物耐受性相关性探究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的致病菌，可以导致各种感染，尤其在医疗机构和免疫功能低下的人群中特别常见。
其中，铜绿假单胞菌的生物膜形成和抗菌药物耐受性是该菌引起感染并导致治疗困难的重要原因之一。
本文将探究铜绿假单胞菌的生物膜形成与抗菌药物耐受性之间的相关性。
生物膜是铜绿假单胞菌在环境中常见的生存形式，它是由菌落中的细菌通过分泌胞外多糖以及其他黏附因子形成的一层黏稠的聚集体。
生物膜在菌落内提供了保护和致病的优势。
在生物膜内，铜绿假单胞菌形成了一种高度结构化的矩阵，其中包括细菌细胞本身、胞外多糖、蛋白质以及DNA等物质。
铜绿假单胞菌生物膜的形成是一个复杂的过程，涉及多个遗传和环境因素的调控。
首先，一些遗传因素可以促进生物膜的形成。
例如，细菌生物膜有关的基因簇（pel和psl）会编码产生胞外多糖的酶以及其他黏附因子。
此外，铜绿假单胞菌还可以通过调节某些转录因子（例如vqsR和lasR）的表达来控制生物膜的形成。
其次，环境条件对生物膜形成也有重要影响。
铜绿假单胞菌通常生长在潮湿和富含养分的环境中，例如人体上的生化硝化滤池、人体创口和医疗设备表面等。
在这些环境中，菌落周围的水分和营养素可以促进细菌的黏附并形成生物膜。
此外，一些物理和化学参数，例如温度、pH值和氧气浓度，也会影响生物膜的形成。
铜绿假单胞菌生物膜的形成对抗菌药物的耐受性具有重要意义。
一方面，生物膜提供了一种物理屏障，使得抗菌药物难以通过，从而减少了其对菌落内细菌的杀菌效果。
另一方面，生物膜内的细菌通常处于生长缓慢或处于休眠状态，这使得它们对抗菌药物的杀菌作用更加耐受。
此外，生物膜中的细菌群体也通过细菌间的相互作用和基因共享等方式共同抵抗抗菌药物的作用。
为了解铜绿假单胞菌生物膜形成与抗菌药物耐受性之间的关系，研究人员开展了大量的实验和研究。
通过研究发现，生物膜相关基因的突变和缺失会导致菌落内生物膜的形成受到抑制。
铜绿假单胞菌生物被膜研究进展
铜绿假单胞菌生物被膜研究进展摘要:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是最严重的医院内获得性感染的病原菌之一,生物被膜(Biofilm,BF)多粘附在生物材料和植入的各种导管及人体组织表面,它的形成使得铜绿假单胞菌生物被膜相关感染不断上升,致使慢性感染性疾病反复发作且难以控制,给治疗增加更大的难度。
临床上已有许多被证实可用于治疗PA生物被膜感染的药物,藻酸盐、密度感应系统对PA生物被膜形成的作用也为治疗生物被膜病提供了新思路。
关键词:铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐感应密度系统生物被膜(Biofilm,BF)是细菌为适应自然环境,在生长过程中附着于固体表面而形成的特殊存在形式,是由多细菌组成的膜状结构,而并非单一细菌的膜成分。
细菌生物被膜的生存方式不仅可以保护其中的细菌抵抗临床抗生素和工业设施中杀菌剂的作用,而且还可以对抗人体的免疫清除作用,对人类的健康造成了很大的危害,从而导致严重的临床问题。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是医院内感染最常见的细菌之一,其生物被膜形成常给临床治疗带来许多困难。
本文就铜绿假单胞菌生物被膜的研究情况进行综述。
1 生物被膜的形成生物被膜的形成过程包括3个方面:①浮游细菌粘附到表面形成单细胞层;②细菌通过群落生长或聚集形成微菌落,进而形成蘑菇状结构;③细菌分泌细胞外多聚物,形成基质,细菌深埋于基质内,成为成熟的生物被膜。
细菌生物被膜结构坚实稳定,不易受到破坏,是细菌为了适应环境、维持自身发展所发生的形态变化。
2 藻酸盐对生物被膜形成的作用据报道,铜绿假单胞菌会在活体内产生藻酸盐,而且在铜绿假单胞菌感染住院的病人的体内也检测到藻酸盐抗体的存在。
这些多糖藻酸盐结构主要成分是甘露糖醛酸和古洛糖醛酸。
研究表明铜绿假单胞菌可以分成粘液型及非黏液型两种表型,粘液型铜绿假单胞菌可借助其表面分泌的藻酸盐,而粘附于异物表面。
Sauer K 等在流动的介质中建立的铜绿假单胞菌生物被膜模型,发现黏液型菌株的生物被膜为塔状或蘑菇状,非黏液型菌株的生物被膜为薄膜状[1]。
铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控及治疗对策研究进展
铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控及治疗对策研究进展
王文敏;徐志豪
【期刊名称】《浙江大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2010(039)001
【摘要】铜绿假单胞菌是医院内感染重要的致病菌.该菌易形成生物被膜,常给临床治疗带来很多困难.在生物被膜形成的细菌早期定植、蘑菇状结构形成以及细胞外基质生成的各个阶段均受多种分子及基因的调控,而密度感知信号系统整体调控生物被膜的形成.根据生物被膜的形成过程及调控机制,多种针对生物被膜的治疗对策已应用于临床,一些新药物和新方法也在研究之中.
【总页数】6页(P103-108)
【作者】王文敏;徐志豪
【作者单位】浙江大学医学院附属第二医院、浙江大学呼吸疾病研究所,浙江,杭州,310009;浙江大学医学院附属第二医院、浙江大学呼吸疾病研究所,浙江,杭州,310009
【正文语种】中文
【中图分类】Q936
【相关文献】
1.LuxS/AI-2型群体感应系统调控细菌生物被膜形成研究进展 [J], 刘蕾;桂萌;武瑞赟;李平兰
2.群体感应对铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控 [J], 黄媛媛;宋水山
3.单核细胞增生性李斯特菌生物被膜形成调控机制研究进展 [J], 张辉;崔焕忠;郑鑫
4.SarA调控金黄色葡萄球菌生物被膜形成的研究进展 [J], 郑艳阳;曹凤娇;明迪;母丹;向华
5.鲍曼不动杆菌生物被膜形成与调控的研究进展 [J], 蔺飞; 余彬; 袁明勇; 凌保东因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
文献阅读报告2(铜绿假单胞菌的耐药机制)
铜绿假单胞菌的耐药机制摘要铜绿假单胞菌是1种条件致病菌，在健康人皮肤、呼吸道等部位均可存在。
随着抗生素的广泛和不合理使用导致细菌抗生素耐药性增加，其耐药机制主要涉及外膜通透性障碍、作用靶位改变、产生灭活酶、形成生物膜和主动外排泵系统等.从而为临床治疗铜绿假单胞菌感染提供积极可行的重要意义。
关键词铜绿假单胞菌；耐药机制；β-内酰胺酶；生物膜；主动外排泵铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）俗称绿脓杆菌，是1种革兰氏阴性菌致病菌，在健康人皮肤、呼吸道等部位均可存在，是临床上常见的院内感染致病菌。
近年来，PA 对人体的致病作用明显增加，成为一系列严重的化脓性感染，尤其是支气管扩张、慢性支气管炎、囊性肺纤维化等基础疾病继发感染的重要致病菌。
随着抗生素的广泛应用，PA对临床常用抗生素出现不同程度的耐药且耐药率呈逐年上升趋势，这已成为临床治疗最棘手的问题，给治疗感染带来相当大的困难。
PA耐药机制十分复杂，包括外膜通透性障碍、作用靶位改变、产生灭活酶、形成生物膜和主动外排泵系统等，现综述如下：1 外膜通透性障碍在阻碍抗菌剂渗透作用上，细菌细胞外膜起主要作用。
一般细菌细胞膜上镶嵌有孔蛋白，作为生命物质交换的通道，有些药物可以通过孔蛋白进入细菌内。
PA的外膜由微孔蛋白孔道组成，仅允许相对分子质量小的糖类扩散，在维持PA基本生理代谢的同时，即使小分子水溶性抗生素通过孔道的速度依然很慢，因而PA具有天然的多重耐药性倾向，疏水的抗菌剂，如β-内酰胺类和喹诺酮类，必须通过细菌外膜的专用水通道外膜孔蛋白（outer-membrane porin,Opr）才能进入细胞。
特定Opr的缺乏可能造成相关抗菌剂的耐药。
实验研究表明，抗生素的选择压力和长时间使用加快了细菌突变的速度，PA更易丢失外膜蛋白，导致多药耐药[1]。
如OprD2是碳青霉烯类进入PA的通道，OprD2缺失或低表达常是导致PA对碳青霉烯类耐药的重要原因[2-3],在临床使用亚胺培南治疗PA感染失败时就会有亚胺培南耐药菌株出现，检查这些菌株的外膜蛋白常可发现OprD2缺失。
大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜的作用
五、铜绿假单胞菌 $% 细菌计数 已形成 $% 的 聚 碳 酸 酯 膜 片 用 无 菌 生 理 盐 水 ) /0冲洗游离菌后，放入9/0无菌生理盐水中，用匀 浆器（<4=9>)型，浙江机械厂）粉碎后，用连续稀释 法进行菌落计数，制备生物膜同时加入不同抗菌药
表) 大环内酯类药物与环丙沙星联用 对铜绿假单胞菌 $%的清除作用
பைடு நூலகம்
药 物#
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无药对照 阿奇霉素／环丙沙星 红霉素／环丙沙星 麦迪霉素／环丙沙星
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差异较大，体内的 ,& 形 成 环 境 更 为 复 杂，细 菌 在 生 物材料如人工置留物、导管表面形成 ,& 的情况以 及药物对,& 的影响，大环内酯类药物能否成为治 疗 ,&相关感 染 的 有 效 药 物，还 需 大 量 的 实 验 及 临 床疗效观察。
本研究中，(／() "#$*+（023／4）、5"（023／ 4）可使铜绿假单胞菌,&菌落计数由对照组(161/ (1789:／820 降为 (67/(1!89:／820、-61/(1!89:／ 820 预先制备的 ,& 置入含有(／()"#$ 大环丙酯 类药物或!"#$$%&’ 中孵育-.，,&菌落计数为 用药前的;76<=!(->6-=，!"#$$%&’ 和(／() "#$的 *+ 或 5" 联用作用则可使其菌量下降至 167= 和 060=，为 单 用 ! "#$ $%&’ 的 (61= 和 06-=。麦迪霉素对铜绿假单胞菌 ,& 形成与清除 均无明 显 作 用。 扫 描 电 镜 观 察 与 菌 落 计 数 结 果 一
铜绿假单胞菌耐药率与生物膜形成能力之间的相关性分析
铜绿假单胞菌耐药率与生物膜形成能力之间的相关性分析摘要：铜绿假单胞菌与多种人类感染有关，主要与医疗保健服务有关。
在医院里，它与对几种抗生素的耐药性有关，这对治疗造成了巨大的挑战。
然而，治疗铜绿假单胞菌感染的最大挑战是与生物膜相关的感染，其引起的感染是危及生命的，因此，本研究旨在评价具有生物膜形成能力与铜绿假单胞菌分离株的抗生素耐药性。
关键词：铜绿假单胞菌；生物膜；耐药性铜绿假单胞菌是一种革兰染色呈阴性的微生物，是继金黄色葡萄球菌和大肠杆菌之后的第三大最常见的医院感染原因。
此外，患恶性肿瘤、血液病和代谢性疾病的患者，以及术后或接受某些治疗后的患者易感染本菌，特别是在囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)、烧伤或免疫缺陷患者和那些接受人工通气的患者中[1]。
一、研究背景医院感染铜绿假单胞菌是发达国家和发展中国家的医学所面临的主要问题之一，它促进了传染病在社区中的传播。
烧伤伤口患者对微生物感染的敏感性较高，导致免疫系统减弱，烧伤损伤能力较强。
近年来广泛使用抗生素导致铜绿假单胞菌抵抗广谱抗生素，使其形成不同程度的多重耐药性(multidrug resistance，MDR)，现有研究表明，这些菌株的抗性模式是由获得其他遗传因子产生的，如转座子、噬菌体和含有抗性基因的可移动基因盒，这些可移动的遗传元件具有转移耐药基因的很高的潜力[2]。
位于转座子上的整合子有好几类，其中第1、2、3类，特别是第1类在抗生素耐药性中起着重要作用。
在铜绿假单胞菌中，金属-β-内酰胺酶(MBL)由可移动的遗传元件编码，包括第1类和第2类整合子[3]。
二、研究意义了解这些菌株是如何在传播过程中形成生物膜来抵抗药物，对于寻找疾病的来源和治疗手段具有特殊的流行病学意义，因此，本研究旨在评价具有生物膜形成能力的铜绿假单胞菌分离株的抗生素耐药性模式。
三、采集标本与方法本研究于2021年1月至2021年12月，共获得439例济宁市第一人民医院烧伤病房收治医院（尿路感染、伤口感染、软组织和皮肤感染、菌血症）感染患者的临床标本（尿液、血液、伤口、脑脊液）。
铜绿假单胞菌生物膜形成的影响因素及防治策略探究
铜绿假单胞菌生物膜形成的影响因素及防治策略探究铜绿假单胞菌是一种常见的细菌，广泛存在于环境中，包括水体、土壤和动植物体内。
它是一种革兰氏阴性杆菌，能够形成生物膜，这种薄膜结构的形成对于铜绿假单胞菌的繁殖、生存和抗药性有着重要的影响。
生物膜是一种由细菌聚集形成的微生物聚集体，它们通过分泌胶质多糖和其他分子，将自身牢牢固定在表面上。
铜绿假单胞菌的生物膜形成会导致其迅速适应环境变化，并增加对抗生素、消毒剂等化学物质的耐受性。
因此，深入了解铜绿假单胞菌生物膜形成的影响因素以及寻找有效的防治策略是至关重要的。
首先，我们来探讨一下铜绿假单胞菌生物膜形成的影响因素。
以下是一些主要的影响因素：1. 温度和湿度：铜绿假单胞菌能够在较宽的温度范围内生长，并且在湿润条件下更容易形成生物膜。
2. 营养物质：适宜的营养物质是生物膜形成的关键。
铜绿假单胞菌需要合适的碳源和氮源来维持其生物膜形成和生长。
3. 表面特性：表面的物理和化学性质对生物膜形成有重要影响。
光滑的表面和较低的表面能量会促进生物膜的形成。
4. 其他微生物的存在：在环境中，铜绿假单胞菌通常会与其他细菌和真菌共生。
这种共生关系可能会影响生物膜的形成。
有了对影响因素的初步了解，我们可以开始探索一些防治策略，以减轻铜绿假单胞菌生物膜形成带来的负面效应。
1. 物理方法：机械清洗和超声波清洗等物理方法可以有效地去除表面的生物膜。
这些方法可以用于预防和控制生物膜的形成。
2. 化学方法：使用化学物质，如消毒剂和抗生素，可以抑制生物膜的形成。
然而，需要注意的是，长期使用化学物质可能会导致细菌产生耐药性。
3. 表面改性：通过改变表面的物理或化学性质，可以阻止铜绿假单胞菌吸附和生物膜形成。
例如，使用抗菌表面涂层可以防止细菌附着。
4. 生物方法：利用特定的微生物，如以益生菌为基础的生物防治方法，可以有效地降低铜绿假单胞菌的生物膜形成。
总的来说，铜绿假单胞菌的生物膜形成对于其生存和繁殖非常重要。
铜绿假单胞菌的致病机制及抗菌药物耐药性分析
铜绿假单胞菌的致病机制及抗菌药物耐药性分析铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的致病菌，对人体健康造成严重威胁。
本文旨在探讨铜绿假单胞菌的致病机制以及其抗菌药物耐药性，并提供相应的分析。
1. 铜绿假单胞菌的致病机制：铜绿假单胞菌主要通过以下几种机制引起感染：1.1 生物膜形成：铜绿假单胞菌具有优秀的黏附能力和生物膜形成能力，可以黏附在各种生物和非生物表面，形成生物膜。
该生物膜提供了有效的保护层，使得铜绿假单胞菌对抗几乎所有抗菌药物变得更加耐受。
1.2 外毒素产生：铜绿假单胞菌能够产生多种外毒素，包括溶血素、内毒素、外毒素A和外毒素S等。
这些毒素对人体器官和免疫系统具有强烈的毒性作用，导致炎症反应和损伤。
1.3 酶的产生：铜绿假单胞菌能够产生多种酶，如蛋白酶、脂肪酶和核酸酶等，这些酶能够溶解宿主组织，破坏细胞的完整性，从而促进感染的发展和扩散。
2. 抗菌药物耐药性分析：铜绿假单胞菌在临床上已经出现了广泛的抗菌药物耐药性，主要体现在以下几个方面：2.1 多重耐药性：铜绿假单胞菌对多种抗菌药物同时表现出耐药性，这包括广谱β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类和碳青霉烯类抗生素等。
这种多重耐药性使得治疗铜绿假单胞菌感染变得更加困难。
2.2 β-内酰胺酶产生：铜绿假单胞菌能够产生广谱β-内酰胺酶，这种酶能够降解许多β-内酰胺类抗生素，如青霉素和头孢菌素，导致这些抗生素的失效。
2.3 药物外排泵系统：铜绿假单胞菌表面有多种药物外排泵系统，这些泵可以将抗生素从细胞内排出，从而降低抗生素对菌体的有效浓度，引发抗药性。
2.4 基因突变：铜绿假单胞菌具有高变异性，其基因组中存在多个突变位点。
这些基因突变可能导致抗菌药物靶标的结构改变，使得抗生素无法结合并发挥作用。
3. 克服抗菌药物耐药性的措施：面对铜绿假单胞菌的抗菌药物耐药性，我们可以采取以下措施：3.1 合理使用抗生素：合理使用抗生素可以减少抗菌药物的滥用，从而减少耐药菌株的产生。
铜绿假单胞菌的致病机制探究
铜绿假单胞菌的致病机制探究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的病原菌，可以导致多种感染，包括肺炎、泌尿道感染、创伤感染等。
铜绿假单胞菌具有高度的耐药性和致病性，对于患者的健康构成了重大威胁。
本文将探究铜绿假单胞菌的致病机制，以加深对该菌种的了解。
铜绿假单胞菌致病的主要机制包括黏附、生物膜形成、外毒素产生和免疫逃避。
首先，黏附是铜绿假单胞菌与宿主细胞结合的第一步。
该菌种通过毛状纤毛和类鞭毛结构附着于宿主细胞表面，从而确保其在宿主体内的存活和繁殖。
此外，铜绿假单胞菌还能通过一种称为Type IV pili的附件结构执行黏附，促进细菌与宿主细胞之间的相互作用。
随后，铜绿假单胞菌能够形成生物膜，这是其致病机制中的关键环节。
生物膜是细菌在表面上形成的一种粘附多细胞结构，在对抗抗菌药物和免疫系统时具有重要作用。
铜绿假单胞菌通过生物膜能够保护自身免受宿主免疫系统的攻击，从而使其能够长期存在于宿主体内。
铜绿假单胞菌的外毒素也是其致病机制的重要组成部分。
该菌种产生的外毒素包括外毒素A（Exotoxin A）、外毒素S（Exotoxin S）以及细胞质外毒素（Cytotoxin）等。
这些外毒素能够破坏宿主细胞的正常功能，损伤细胞膜，导致细胞死亡。
外毒素A是铜绿假单胞菌最重要的外毒素之一，能够通过抑制蛋白合成而导致细胞死亡。
另外，铜绿假单胞菌具有较强的免疫逃避能力，这也是其能够引起严重感染的原因之一。
该菌种能够调节和抑制宿主免疫系统的反应，包括干扰细胞因子的产生、减少中性粒细胞活性等。
这种免疫逃避机制使得铜绿假单胞菌能够在宿主体内逃避免疫系统的攻击，继续生长和繁殖。
在研究铜绿假单胞菌的致病机制过程中，科学家们也发现了一些其他的因素，例如多黏菌素（Mucoidy），即产生黏多糖的能力。
这些黏多糖能够使得铜绿假单胞菌形成更加致病的菌群，增加其在宿主体内的存活和传播能力。
综上所述，铜绿假单胞菌的致病机制涉及黏附、生物膜形成、外毒素产生、免疫逃避等多个方面。
氧浓度变化对铜绿假单胞菌生物被膜生成的影响
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抗铜绿假单胞菌生物膜形成相关因素及干预药物的研究进展
抗铜绿假单胞菌生物膜形成相关因素及干预药物的研究进展王洪曼1,2，黄铮铮1，李天牧1综述，高伟3，李倩1审校(1.潍坊医学院医学检验学系,山东潍坊261053;2.山东省高密市人民医院检验科,山东潍坊261500;3.潍坊医学院临床医学院,山东潍坊261053)·述评·基金项目:国家自然科学基金项目(81802054);山东省高等学校科研计划项目(J17KA252);潍坊医学院博士启动基金(2017BSQD15)作者简介:王洪曼,女,1985年生,硕士,检验技师,临床检验诊断学专业,主要研究方向为临床微生物学诊断研究。
通信作者:李倩,女,1983年生,博士,讲师,微生物学专业,主要从事临床微生物学诊断研究。
E-mail :liqian@ 。
审校者:高伟,男,1984年生,博士,副教授,病理生理学专业,主要从事病原体感染的干细胞治疗研究。
E-mail :gaowei@ 。
摘要：铜绿假单胞菌分布广泛,占临床非发酵菌检出率首位,属于条件致病菌。
铜绿假单胞菌具有固有耐药性,近年来其多重耐药性问题进一步加剧。
其中,铜绿假单胞菌生物膜的形成对其耐药性的增加起着尤为重要的作用,导致临床治疗更加困难。
本文就近年来对抗铜绿假单胞菌生物膜生成具有影响的相关因素、抗铜绿假单胞菌生物膜生成的相关药物进行综述,为临床进行更有效的抗铜绿假单胞菌生物膜治疗提供指导依据。
关键词：铜绿假单胞菌;生物膜;环境因素;化学药物;传统药物中图分类号：R378.99+1,R978.2+4文献标识码：A文章编号：1674-1129(2019)05-0771-03DOI :10.3969/j.issn.1674-1129.2019.05.001铜绿假单胞菌在自然界中呈广泛分布状态,除了水、空气、土壤中,还常分布于人体的皮肤、肠道和呼吸道等与外界相通的部位[1]。
铜绿假单胞菌是一种革兰阴性杆菌,具有条件致病性,可导致多种感染,占非发酵菌临床分离率首位,常见于医院感染[2]。
铜绿假单胞菌生物膜形成能力及其耐药性关系的研究
·临床交流·铜绿假单胞菌生物膜形成能力及其耐药性关系的研究庞余，刘向群*（徐州第一人民医院，江苏徐州 221000）【摘要】目的 回顾性分析临床采集41株铜绿假单胞菌药敏情况，并研究铜绿假单胞菌生物膜形成能力与耐药性之间的关系。
方法 41株铜绿假单胞菌采用96孔平板构建生物膜模型，用结晶紫染色法定量测定其生物膜形成能力，分析菌株生物膜形成能力与其耐药性之间的关系。
结果 本研究中铜绿假单胞菌体外药敏试验中仅有氨基糖苷类抗生素敏感率超过75%，其余包括亚胺培南在内的所有抗生素耐药率均较高。
所测41株铜绿假单胞菌均具有生物膜形成的能力，随生物膜形成能力的增强，铜绿假单胞菌对哌拉西林他唑巴坦、头孢吡肟、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、亚胺培南、妥布霉素、阿米卡星的敏感率均上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。
结论 临床分离铜绿假单胞菌耐药率较高。
分离铜绿假单胞菌菌株均具有较强生物膜形成能力。
随着铜绿假单胞菌生物膜形成能力的增强，铜绿假单胞菌耐药性下降。
【关键词】铜绿假单胞菌；生物膜；耐药性【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-8242.2019.59.30.02铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种革兰阴性杆菌[1]。
既往对产生灭活酶，膜通透性下降，靶位改变均研究较多，现认为生物膜（BF，biofilm）也是铜绿假单胞菌多重耐药的重要因素之一，且与上述几种耐药机制均有密切关联[2]。
本文通过对41株临床分离铜绿假单胞菌生物膜能力的测定及分析与体外药敏试验的结果，进一步探讨体外药敏试验结果与铜绿假单胞菌生物膜形成能力的相关性。
1 材料与方法1.1 菌株收集2015年2月～2015年3月由徐州市第一人民医院、徐州市第四人民医院两家医院检验科培养、分离、自动化微生物分析仪鉴定的铜绿假单胞菌，并记录药敏试验结果。
采用法国生物梅里埃公司的 VITEK 32微生物生化检测系统进行菌种鉴定。
喹诺酮类药物诱导铜绿假单胞菌后对其生物膜形成能力影响的研究
喹诺酮类药物诱导铜绿假单胞菌后对其生物膜形成能力影响的研究目的:用喹诺酮类药物对PA进行诱导,测定环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和氧氟沙星四种喹诺酮类药物诱导后PA的MIC值变化;测定对PA进行二次诱导八代后其毒力因子表达和生物膜形成能力的影响,从而解释喹诺酮类药物对PA的PQS信号系统的影响。
方法:筛选来自临床的铜绿假单胞菌菌株18株,都经过VITEK-2细菌鉴定仪重新鉴定;标准菌株PAO1株和QS系统双缺陷标准菌株PAOJP1株,共20株。
(1)诱导前MIC值的测定:采用琼脂倍比稀释法,多点接种仪测定菌株的MIC 值,S、I、R判断标准依据CLSI(2013版);(2)用PA对四种喹诺酮类药物环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和氧氟沙星的0.5倍MIC值一次诱导培养四代后,MIC 值的测定:采用琼脂倍比稀释法,多点接种仪测定0.5倍MIC值一次诱导后菌株的MIC值,记录其变化;(3)用上述四种喹诺酮类药物对PA进行0.5倍MIC二次诱导培养四代后,MIC值的测定:同(2);(4)四种喹诺酮类药物对PA进行二次诱导八代后其毒力因子的变化:包括弹性蛋白酶活性测定、绿脓菌素活性测定和鞭毛泳动能力的测定;(5)四种喹诺酮类药物对PA进行二次诱导八代后其生物膜形成能力的变化:利用平板法制备生物膜、染色法建立生物膜,结合酶标仪测定570nm波长处的A来定量分析PA生物膜形成能力;(6)统计学方法:用SPSS19.0软件对数据进行分析,所有检测结果的组间比较采用非参数检验中的两相关样本的秩和检验。
结果:(1)诱导前菌株的MIC值结果:环丙沙星的敏感率最高,为77.78%;左氧氟沙星的敏感率次之,为66.67%;氧氟沙星的敏感率为61.11%;莫西沙星虽无判断标准,但是依据左氧氟沙星和氧氟沙星的折点标准,计算出为38.89%。
(2)0.5倍MIC值一次诱导培养四代后菌株的MIC值变化:与诱导前相比,环丙沙星诱导后原来敏感的12株细菌的MIC值均有不同程度的升高,其中2株菌变化的最明显,MIC值升高了8倍;左氧氟沙星诱导后原来敏感的12株细菌的MIC 值也均有不同程度的升高,其中1株菌的MIC值甚至升高了64倍;莫西沙星诱导后原来敏感的12株细菌的MIC值亦均有不同程度的升高,其中6株菌变化的最明显,MIC值升高了8倍;氧氟沙星诱导后原来敏感的12株细菌的MIC值也均有不同程度的升高,其中6株菌的MIC值变化的最明显,升高了8倍;原来对四种喹诺酮类药物非敏感的6株菌中有相同的1株经过诱导后MIC值升高。
亚抑菌浓度β-内酰胺类抗生素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响研究
亚抑菌浓度β-内酰胺类抗生素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响研究目的：研究亚抑菌浓度(subminimal inhibitory concentration,sub-MIC)抗生素对细菌生物膜形成的影响,为探讨细菌生物膜形成的调控机制及发现新的药物靶点提供理论及实验依据。
方法：选取铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的临床分离菌株(PA.11、 PA.12、PA.14)和标准菌株(PAO1、ATCC27853)。
采用微量肉汤稀释法测定亚胺培南西司他丁钠(IM/CI)、头孢他啶(CAZ)、哌拉西林舒巴坦钠(P/S)、头孢曲松钠(CRO)、头孢噻肟(CTX)、阿莫西林氟氯西林钠(A/F)的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。
分别将1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC抗生素作用于PA,通过细菌黏附力试验了解抗生素对细菌黏附力的影响。
选用1/4MIC抗生素作用于PA.12,通过运动试验、菌落计数法、结晶紫染色法及激光共聚焦显微镜(Confocal LaserScanning Microscope, CLSM)观察1/4MIC抗生素对PA.12生物膜形成的影响,同时采用RT-PCR对生物膜形成相关基因algC、alg D进行检测分析。
结果：1.细菌黏附力试验结果显示：(1)1/2MIC IM/CI、CAZ、P/S、CRO、CTX能增强PA.11的黏附力,1/2MIC CAZ、CTX能增强PAO1的黏附力,1/2MIC A/F均能增强5株PA的黏附力(p≤0.05)。
(2)除1/4MIC CAZ对PA.14黏附力无影响外,其余1/4MIC、1/8 MIC抗生素均能增强PA黏附力(p≤0.05)。
2.选取1/4MIC抗生素作用于PA.12,与无药对照组比较：(1)运动试验结果显示：1/4MIC IM/CI、CRO、CTX能增强PA.12的游动能力(p≤0.05);1/4MIC M/CI、CAZ, P/S、CRO、A/F能增强PA.12的群集运动能力(p≤0.05)。
铁离子对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响及其机制探讨的开题报告
铁离子对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响及其机制探讨的开题报告题目：铁离子对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响及其机制探讨一、研究背景和意义在医院和其他医疗环境中，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种具有重要致病性的细菌，它可以引起各种感染，如呼吸道感染、尿路感染、创伤感染等。
这种细菌广泛存在于自然界中，很难被完全消灭，因此需要深入了解其生物被膜形成的机制，为其治疗提供理论依据。
生物被膜是一种细胞表面的复杂结构，由细胞外聚集的多种生物材料构成，包括蛋白质、多糖、脂质等，它们相互作用形成了一种黏附性的三维结构。
生物被膜在微生物中具有很强的黏附性和生物降解性，因此能够保护细菌免受光线、化学物质和机械力学等外部影响，同时也能影响细菌与宿主细胞及免疫系统的相互作用。
铁离子作为细菌生存不可缺少的基础元素之一，对细菌的生长、代谢、信号转导等方面都起着关键作用。
铁离子通过调节生物体内铁离子浓度及其利用率，影响了细菌能量代谢、耐受性、攻击性及免疫逃逸性。
另一方面，铁离子还对膜蛋白、脂质类物质等膜相关分子的合成和分解等产生直接或间接的影响。
因此，对铜绿假单胞菌生物被膜形成机制及其对铁离子的响应机制进行研究，可以更好地揭示细菌与宿主间的相互作用规律，同时为抗细菌感染提供新的思路和策略。
二、研究内容和方案1.铁离子影响铜绿假单胞菌生物被膜形成的实验研究通过变化铁离子的浓度以及添加吸铁菌素（siderophore）等方法，研究铁离子浓度对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响。
同时，采用光学显微镜、电子显微镜等观察手段，探究铁离子对细胞表面低表现型菌群（LPS）分布、荧光素染色等形态结构的影响。
2.铁离子对信号通路的调节作用通过构建不同水平的靶标基因敲除及表达，在浓度尺度上解析了铜绿假单胞菌采用的抗氧化氧化途径在感应铁代谢及建立生物被膜时的相对重要性。
3.铜绿假单胞菌参与的铁代谢通路通过对比在线生物信息学相关文献及其他感染菌类资料库的分析，阐述了铜绿假单胞菌中铁代谢相关基因在表达途径、途径功能上的相互作用和差异性，以及在线沙赞（GO）分类学及基因调节网络分析中相关基因在病原菌细胞功能上的重要性。
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・论 著・铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素的研究谢红梅,胡必杰,周昭彦,何礼贤(复旦大学附属中山医院,上海200032)摘要:目的 检测各种因素对铜绿假单胞菌(PA E)生物膜形成的影响。
方法 采用恒化器结合改良Robbins装置培养铜绿假单胞菌生物膜,用超声振荡2活菌计数法检测不同条件下形成的生物膜内的活细菌数。
结果 固定其他条件不变,8、24、72h的生物膜内活菌数分别为4.01±0.26、4.59±0.49、5.20±0.47log10CFU/引导片, P<0.01;固定其他条件不变,23、37℃形成的生物膜内活菌数分别为5.12±0.43、5.30±0.42log10CFU/引导片,P<0.05;固定其他条件不变,分别以玻璃和硅胶为生物膜引导片所形成生物膜内活菌数分别为5.49±0.59、6.21±0.40log10CFU/引导片,P<0.01;固定其他条件不变,分别以30、90ml/h的培养基流速,其生物膜内活菌数依次为5.44±0.58、5.83±0.52log10CFU/引导片,P<0.01;固定其他条件不变,分别以M63、M2H和LB 作为培养基,生物膜内活菌数依次为6.01±0.75、6.24±0.42、6.66±0.12log10CFU/引导片,P<0.01。
结论延长培养时间、培养温度为37℃、粗糙的黏附材料、高流速和营养丰富的培养基均有利于铜绿假单胞菌生物膜的形成。
关键词:生物膜;铜绿假单胞菌;影响因素;超声振荡;活菌计数中图分类号:R378.99+1 文献标识码:A 文章编号:100524529(2007)1221475204Impact F actors of Pseudomonas aer ugi nosa Biof ilms FormationXIE Hong2mei,HU Bi2jie,ZHOU Zhao2yan,H E Li2xian(Zhon gs han Hos pit al,Fu d an Universit y,S hang hai200032,Chi na) Abstract:OB JECTIVE To compare the difference of Pseudomonas aeruginosa(PA E)biofilms formation in different conditions including incubated time,temperature,attaching materials,and flowing speed.METH ODS PA E biofilms were established in a chemostat2coupled MRD and detected with the method of viable bacteria counting.The number of CFU/disc was measured in different culture time(8h,24h or72h),different temperature(23℃or37℃),different adherent materials(glass or silicone),different flow velocities(30ml/h or 90ml/h)and different culture media(M63medium,M2H broth or LB broth).RESU LTS Keeping the other conditions invariable,the log10CFU/disc of viable bacteria in8h,24h or72h biofilms were4.01±0.26,4.59±0.49or5.20±0.47,respectively(P<0.01),the log10CFU/disc of the viable bacteria in biofilms in23℃or37℃were5.12±0.43or5.30±0.42,respectively(P<0.05),the log10CFU/disc of viable bacteria in biofilms grown on the surfaces of glass or silicone were5.49±0.59or6.21±0.40,respectively(P<0.001),the log10CFU/disc of viable bacteria in biofilms grown in the flow velocities of30ml/h or90ml/h were5.44±0.58or5.83±0.52, respectively(P<0.01),and the log10CFU/disc of viable bacteria in the biofilms grown in M63,M H broth or LB broth were6.01±0.75,6.24±0.42or6.66±0.12,respectively(P<0.01).CONC L USIONS Prolonging the incubating time,at the temperature of37℃,coarse surface material and high flow velocities and rich nutritious culture medium do good for PA E biofilms formation.K ey w ords:Biofilms;Pseudomonas aeruginosa;Impact factors;Viable bacteria counting 细菌生物膜(B F)可定植于植入物、留置导管或人体组织表面引起机体的慢性难治性感染。
随着近年来各种人工器官和留置导管的广泛使用,生物膜相关感染在迅猛地增多[1,2]。
生物膜在形成过程中易受许多因素的影响,而恒化器结合改良Robbins收稿日期:2007208205; 修回日期:2007210215装置这一体外生物膜形成模型的出现,使上述问题得到了有效地解决,它可在维持其他因素恒定的条件下,研究一种因素对生物膜形成的影响。
本研究采用恒化器结合改良Robbins装置研究不同的培养时间、培养温度、生物膜引导材料、培养基流经速度和培养基种类对生物膜形成的影响。
・5741・中华医院感染学杂志2007年第17卷第12期1 材料与方法1.1 材料 黏液型铜绿假单胞菌,为复旦大学附属中山医院临床微生物中心临床分离株。
改良Rob2 bins装置,恒化器(4孔烧瓶),贮液瓶(2000ml单孔烧瓶)均于中科院上海有机所定制。
超声细胞粉碎机为宁波科生公司产品。
生物膜引导片,分别为直径6mm的硅胶片和玻璃片,硅胶片自制,玻璃片在中科院上海有机所定制。
营养肉汤培养基购自上海市疾病预防控制中心。
LB肉汤:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl10g,完全溶解后用5mol/L NaO H(约0.2ml)调节到7.0,加双蒸水至总体积1000ml,121℃高压蒸汽灭菌20min。
M63培养基:KH2PO43g、K2HPO47g,(N H4)2SO42g, FeSO40.0005g,MgSO40.2464g,甘油20ml, 5mg/ml维生素B120ml,加水至总体积1000ml, 121℃高压蒸汽灭菌20min。
1.2 方法1.2.1 生物膜流动培养装置的建立 挑取纯培养的铜绿假单胞菌菌落溶于10ml生理盐水中,使菌液浓度为(2～3)×108CFU/ml,再将其稀释至(2～3)×105CFU/ml。
取7ml稀释液加入含700 ml无菌培养基的恒化器中,至终浓度为(2～3)×103CFU/ml。
连接贮液瓶和已加入菌液的恒化器, 35℃培养8h至对数生长期,检测此时的细菌浓度;接入营养肉汤,调节蠕动泵使流速为120ml/h,经过一定的时间后恒化器中的细菌浓度达到稳定状态,约为(2～3)×108CFU/ml。
将含有无菌引导片的改良Robbins装置与恒化器连接,调节蠕动泵,使菌液以恒定速度流入改良Robbins装置。
每间隔8h测定菌液浓度及维持恒化器的稳定状态[3]。
1.2.2 超声振荡2活菌计数法 将培养一定时间的生物膜引导片从改良Robbins装置中取出,于20ml 无菌生理盐水中轻轻漂洗3次,去除浮游菌,置于含20ml无菌生理盐水的培养瓶中,超声波振荡1.5min,输出功率为180W(超声时间和强度均为实验获得的最佳时间和强度),旋涡振荡5min,使生物膜细菌混合均匀。
将此菌液以10倍梯度连续稀释3次,分别取每个稀释度菌液0.1ml加入血琼脂平皿中,涂布均匀,35℃孵育20～24h;计数活菌数,计算每个膜片上生物膜内的细菌数。
1.2.3 统计分析 数据输入SPSS11.5,采用随机区组方差分析进行统计和分析。
2 结 果2.1 培养时间 在培养过程中,当培养温度为23℃,流经速度为60ml/h,生物膜引导片为玻璃及培养基为营养肉汤时,不同培养时间的生物膜活菌数,差异有统计学意义(F=38.916,P<0.01),生物膜活菌的比较见表1。
表1 不同培养时间、温度、黏附材料和培养基流速的生物膜活菌(log10CFU/引导片)的比较项 目 实验次数(次)1234x±s时间(h)8 4.08±0.10 4.11±0.16 3.86±0.13 3.94±0.54 4.01±0.26 24 4.16±0.66 4.63±0.51 4.74±0.23 4.90±0.13 4.59±0.4972 5.51±0.53 5.42±0.36 4.75±0.28 5.29±0.40 5.20±0.47温度(℃)23 5.01±0.16 4.82±0.30 5.51±0.40… 5.12±0.43 37 5.50±0.23 4.79±0.16 5.62±0.19… 5.30±0.42黏附材料玻璃 5.90±0.26 5.07±0.53…… 5.49±0.59硅胶 6.57±0.09 5.85±0.11…… 6.21±0.40培养基流速(ml/h)30 4.69±0.08 5.96±0.14 5.60±0.22… 5.44±0.58 90 5.51±0.59 6.29±0.12 5.67±0.39 5.83±0.52…2.2 培养温度 当流经速度为60ml/h,生物膜引导片为玻璃,培养基为营养肉汤及培养时间为72h, 37℃较23℃更适于生物膜的形成,前者活菌数高于后者(F=4.559,P<0.05)(表1)。