PCR技术的原理与应用

多重PCR的用途主要有两方面：
1.多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应 管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。 可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。
2.病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定:某些病原 微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失 存在多个突变部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其 型别及突变等。
dNTP的质量与浓度：注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配 制)。如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错 配；浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结 合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键 环节之一。传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的 脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离 细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白 酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再 用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用
多重PCR的特点有：
①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或 对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检 测多种病原体；
②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒， 肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细 菌战剂的同时侦检；
③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大 大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多 更准确的诊断信息。
锚定PCR原理示意图
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利用同位 素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测靶基因 是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR， CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧光染料标记 引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物 5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光 的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可用来检 测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的 型别鉴定等。
③引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下， 以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的 5’→3’方向延伸，合成DNA新链。重复循环变性--退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这 种新链又可成为下次循环的模板。
PCR反应五要素：
即参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模 板和Mg2+。
不对称PCR：
不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR 扩增后产生大量的单链DNA。这对引物分别称为非限制引物 与限制性引物，其比例一般为50～100∶1。在PCR反应的最初 10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性 引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导 的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键是控制限 制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。还有 一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链DNA，然后 以此双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR， 制备单链DNA。不对称PCR制备的单链DNA，主要用于核酸序 列测定。
乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶 解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基 因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫 氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
2.PCR技术的主要类型及其应用
原位PCR技术:
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具 有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的 优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力 的新技术。
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出 靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的 发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值。其 特异性和敏感性高于一般的PCR 。
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列， 而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这 些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多 个基因序列杂交。
锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
多重PCR：
一般PCR仅用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段， 主要用于单一致病因子等的鉴定。多重PCR(multiplex PCR)， 又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加 上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其 反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已 知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子 克隆，建立全长的DNA探针。适用于基因游走、转位因子和已 知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。
反向PCR原理示意图
反向PCR的不足：
①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种 合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这 种选择不能在非酶切位点切断靶DNA；
PCR技术的原理及其应用
PCR技术简史
最早，Korana于1971年提出核酸体外扩增的设想：“经 过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物， 并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。
1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明 了聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试 管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件—模板DNA，寡 核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复 性及延伸的温度与时间。
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取 决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一 段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物， 利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
酶浓度：催化PCR反应约需酶量1ul(总反应体系为100ul时)， 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
反向PCR ：
反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就 是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成 DNA ，用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列。 这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物 3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA， 然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增 引物的上游片段和下游片段。
存在特异性抗原。
免疫PCR优点为：
①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础 上；
②敏感度高，PCR具有惊人的扩增能力，免疫PCR比ELISA敏 感度高105倍以上，可用于单个抗原的检测；
③操作简便，PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一 般实验室均能进行PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：即在高温（93℃左右）下，待扩增的 靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；
②模板DNA与引物的退火(复性)：在低温（37～55℃）情况 下，两条人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补 序列配对结合；
免疫-PCR：
免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一种灵敏、特异的 抗原检测系统。它利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反 应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测。
免疫-PCR试验的主要步骤有三个：①抗原-抗体反应，②与 嵌合连接分子结合，③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA(一般 为质粒DNA)。该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备。在 免疫-PCR中，嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位 点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒DNA 结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之处在 于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中形成抗 原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来判断是否