反向解析法在盐酸普萘洛尔片一致性评价中的应用

反向解析法在盐酸普萘洛尔片一致性评价中的应用柏植政1，周卫2，丁逸梅1，3*1南京工业大学药学院，南京210009;2中国药科大学，南京210009；3南京工业大学江苏省药物研究所有限公司，南京210009盐酸普萘洛尔是一种合成的β-肾上腺素能受体阻断剂，于1966年由阿斯利康公司开发上市，广泛用于治疗高血压、心绞痛、心律失常，作为辅助治疗甲状腺毒症，以及降低心肌梗死急性期的心血管死亡风险。

根据国家食品药品监督管理总局（CF -DA ）对于仿制药一致性评价的要求，盐酸普萘洛尔属于CFDA 发布豁免生物等效性（BE ）的药品。

药物辅料的种类及用量可能会影响药物的吸收速率和吸收程度，特别对低渗透性药物的吸收影响更显著。

因此，仿制制剂研究者通常采用与参比制剂保持相同的辅料组成和用量的策略。

根据前期对盐酸普萘洛尔片原研产品的处方研究，获知硬脂酸/硬脂酸镁比例为体外溶出一致的关键参数。

本研究旨在利用衍生化气相色谱和原子吸收测定硬脂酸与硬脂酸镁比例，反向解析原研产品处方，为盐酸普萘洛尔仿制药通过一致性评价提供参考。

1仪器与试药气相色谱仪（岛津GC-2014）；溶出仪（RC806，紫外分光光度计）。

硬脂酸对照品（批号：BCBP3246V ，纯度≥98.5%），棕榈酸对照品（批号：SLBQ8869V ，纯度≥99%），镁对照溶液（批号：BCBL4523V ）均为Sigma公司产品；盐酸普萘洛尔总混颗粒（批号：20170301），盐酸普萘洛尔自制片[0301-1批（0.5+2.0），0302-1批（0.5+1.5），0302-2批（0.4+2.0）]均由中国药科大学药剂教研室提供；盐酸普萘洛尔参比片（日本AstraZeneca 公司，10mg ，04360）；甲醇为色谱纯；正己烷、氯化钠、硫酸钠及三氟化硼-甲醇均为分析纯。

2方法与结果2.1衍生化气相色谱法（测定总硬脂酸含量）[1，2]2.1.1溶液配制对照品溶液的配制：精密称取硬脂酸对照品约10mg 、棕榈酸对照品约10mg ，置锥形瓶中，精密加入三氟化硼-甲醇溶液5mL ，振荡溶解，水浴回流20min ，放冷，加入正己烷15mL ，完全转移至分液漏斗中，加入10mL 水，加入10mL 饱和氯化钠溶液，振摇至分层，弃去下层（水层），正己烷层加入无水硫酸钠6g ，振摇，静置3min ，正己烷层完全转移至25mL 量瓶中，用正己烷稀释定容。

供试品溶液的配制：精密称定原研片粉约800mg ，置锥形瓶中，精密加入三氟化硼-甲醇溶液5mL ，振荡溶解，水浴回流20min ，放冷，加入正己烷15mL ，完全转移至分液漏斗中，加入10mL 水，加入10mL 饱和氯化钠溶液，振摇至分层，弃去下层（水层），正己烷层加入无水硫酸钠6g ，振摇，静置3作者简介柏植政,男,在读硕士生E-mail:2656397589@ 通讯作者丁逸梅,女,研究员E-mail:jsyws@ 收稿日期2017-04-19修回日期2018-03-15*179min ，正己烷层完全转移至25mL 量瓶中，用正己烷稀释定容[3，4]。

2.1.2色谱条件色谱柱：HP-INNOWAX （30m ×0.32mm ，0.25μm ）；载气：氮气；流速：1.0mL ·min -1；进样口温度为250℃，检测器温度为260℃，升温程序：起始温度为170℃，维持2min ，以每分钟10℃的速率升温至240℃，保持，使色谱图记录至除溶剂峰外第二个主峰保留时间的3倍，硬脂酸甲酯峰与棕榈峰甲酯峰分离度应大于5.0；进样体积：1μL 。

[5]2.1.3专属性试验取对照品溶液和供试品溶液，在“2.1.2”色谱条件下进样。

见图1。

2.1.4线性范围分别精密称定硬脂酸与棕榈酸对照品各7、8、10、12、13mg ，置锥形瓶中，按照“2.1.1”项下操作配制成含硬脂酸与棕榈酸56~104μg ·mL -1系列浓度对照品溶液。

分别以硬脂酸、棕榈酸浓度C （μg ·mL -1）为横坐标，以峰面积A 为纵坐标，进行线性回归。

结果表明，该方法检测的硬脂酸与棕榈酸均在56~104μg ·mL -1范围内，峰面积线性关系良好[2]，见表1。

为最低检测限，信噪比为S/N=10为定量限。

结果表明硬脂酸、棕榈酸在本色谱条件下最低检测限为0.2μg ·mL -1。

2.1.6进样精密度、稳定性和重复性试验取对照品溶液，连续进样5次，计算得硬脂酸峰面积的RSD 为3.68%，棕榈酸峰面积的RSD 为4.15%。

取对照品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8h 进样，计算得硬脂酸面积的RSD 为4.36%，棕榈酸面积的RSD 为4.65%，结果表明，本品溶液在8h 内稳定。

取供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8h 进样，计算得硬脂酸峰面积的RSD 为5.87%，棕榈酸峰面积的RSD 为5.71%，结果表明，本品溶液在8h 内稳定。

精密称取盐酸普萘洛尔参比片粉（04360批）6份，按“供试品溶液制备”方法操作，分别进样测定，计算得硬脂酸含量的RSD 为4.89%，棕榈酸含量的RSD 为3.62%。

2.1.7回收率试验精密称取盐酸普萘洛尔参比片粉约400mg 共9份，分别精密加入硬脂酸、棕榈酸对照品适量，配制成低、中、高浓度溶液（70%、2.1.8样品的含量测定精密称取盐酸普萘洛尔参比片粉（10mg/片）约800mg ，按照“2.1.1”项下操作，测得硬脂酸含量为1.253%，棕榈酸含量为1.24.%。

从硬脂酸和棕榈酸的比例可以判断本品采用的是硬脂酸50。

图1棕榈酸及硬脂酸HPLC 图(A )对照品;(B )供试品;(C )空白组溶液180图2不同处方的溶出结果2.2原子吸收法（测定镁离子的含量）2.2.1光学参数镁灯，波长（nm）：285.2；狭缝宽（nm）：0.7；点灯方式：BGC-D2；原子化器/气体流量设定：燃气流量（L·min-1）：1.8；助燃气流量（L·min-1）:15.0；火焰类型：Air-C2H2；燃烧头高度（mm）：7.0[6]。

2.2.2溶液配制对照品溶液的配制：精密量取1mg·mL-1镁离子标准溶液适量，用0.01mol·L-1盐酸分别稀释配制成0.5、2.0、5.0、10、20μg·mL-1的系列标准溶液。

供试品溶液的配制：精密称取样品粉末约12mg，缓缓炽灼至完全炭化，放冷，加硫酸0.5~1.0mL恰使润湿，低温加热至硫酸除尽，加硝酸0.5mL，蒸干，至氧化氮蒸气除尽后，放冷，在500~600℃炽灼至完全灰化，放冷，用0.01mol·L-1盐酸完全转移至50mL量瓶中，稀释定容[7]。

2.2.3线性范围取镁离子系列标准溶液，依法测定，以镁离子浓度C为横坐标，以吸收值A为纵坐标，进行线性回归。

结果表明，该方法检测的镁离子在0.5~20μg·mL-1范围内线性关系良好，线性方程为A=1.2527×C+3.6714×10-3，γ=0.9992。

2.2.4镁离子的含量测定精密称取盐酸普萘洛尔参比片粉约12mg，依法制备供试品溶液，测定镁离子含量为0.02125%。

由硬脂酸、棕榈酸及镁含量测定结果判断，辅料硬脂酸50使用为1.5%~2.0%，硬脂酸镁的使用量为0.4%~0.5%。

2.3不同硬脂酸与硬脂酸镁比例处方溶出曲线的比较2.3.1不同比例处方设计根据反向解析结果，设计不同硬脂酸与硬脂酸镁比例处方进行压片。

见表3。

2.3.2溶出曲线的测定选择日本橙皮书“盐酸普萘洛尔片”项下最具区分力的pH1.2溶液为溶出介质条件，对上述处方片剂进行溶出曲线比较。

溶出条件为：桨法，50r·min-1；500mL介质；37℃水温；溶出介质：pH1.2溶液（精密称取氯化钠14.01g，加水7000mL，加盐酸49mL），分别于5、10、15、20、30、45min取样，以紫外分光光度法进行测定，波长为290nm。

2.3.3溶出曲线比较分别测定盐酸普萘洛尔参比片（04360批）、盐酸普萘洛尔自制片（中国药科大学药剂教研室提供）0301-1批（0.5+2.0）、0302-1批（0.5+1.5）、0302-2批（0.4+2.0）溶出曲线，计算f2值。

f2值分别为：83.74、77.31和90.0。

拟合度均大于50，其中0302-2批处方最佳，溶出行为与参比制剂基本一致。

溶出曲线见图2。

2.44种介质条件下0302-2（0.4+2.0）批自制片与原研片溶出曲线的比较pH1.2溶液：桨法，50r·min-1；900mL介质；37℃水温；溶出介质：pH1.2溶液（精密称取氯化钠14.01g，加水7000mL，加盐酸49mL，即得）。

pH4.0溶液：桨法，50r·min-1；900mL介质；37℃水温；溶出介质：pH4.0溶液（取3.0g乙酸，用水稀释至1000mL，称取三水乙酸钠3.4g用水稀释至500mL，用该溶液调节乙酸液pH4.0±0.05，即得）。

pH6.8溶液：桨法，50r·min-1；900mL介质；37℃水温；溶出介质：pH6.8溶液（取磷酸二氢钾1.7g和无水磷酸氢二钠1.775g，加水溶解并定容至1000mL，测定pH值，调节pH值至pH6.8±0.05，即得）。

水：纯水900mL，37℃；桨法，50r·min-1。

分别于5、10、15、20、30、45min取样，以紫外分光光度法进行测定，波长为290nm。

分别测定盐酸普萘洛尔参比片、盐酸普萘洛尔自制片溶出曲线，见图3，f2值见表4。

拟合度均大于50，溶出行为与参比制剂基本一致。

3讨论与小结实验中甲酯化试剂三氟化硼-甲醇溶液在空气中遇湿气立即水解，分解时生成剧毒的氟化物烟雾，毒性大、配制过程中须在毒气柜中操作。

硬脂酸镁呈疏水性，颗粒表面是凸凹不平的，硬脂酸镁会填充到小坑中，包裹在药物的表面，起到了润滑的作用。

由于其疏水性，混合时间过长，阻滞药物从固体剂型中溶出，影响药物崩解和溶出。

本文以反向解析法确定参比制剂中硬脂酸与硬脂酸镁的比例，181图3不同介质条件下自制片与原研片的溶出曲线(A )pH1.2;(B )pH4.0;(C )pH6.8;(D)水Application of Reverse Analytical Method in the Evaluation of Propranolol Hydrochloride Tablets ConsistencyBAI Zhizheng 1,ZHOU Wei 2,DING Yimei 1,3*1School of Pharmacy,Nanjing University of Technology,Nanjing 210009,China ;2China Pharmaceutical U 鄄niversity,Nanjing 210009,China ;3Jiangsu Institute of Pharmaceutical Research,Nanjing University of Technology,Nanjing 210009,ChinaABSTRACT Objective :To determine the ratio of magnesium stearate/stearic acid in the prescription of propranolol hydrochloride tablets by a reverse analytical method,and to guide the consistency evaluation of prescription.Methods:A derivative gas chromatography -atomic absorption method was used to reversely analyze the original prescription.The ratio of magnesium stearate/stearic acid was determined and the prescription was studied.Results:The specificity of the derivatized gas chromatography was good.The linearity was good for stearic acid in the range of 56-104μg ·mL -1(γ=0.9991)with the average recovery at 90.06%(RSD=4.02%),and for palmitic acid in the range of 56-104μg ·mL -1(γ=0.9992)with the average recovery at 90.12%(RSD=3.97%).With the atomic absorption method,magnesium ion concentration was linear in the range of 0.5-20μg ·mL -1.The dissolution profile of self-made tablets based on the reversely analyzed ratio of stearic acid/magnesium stearate was comparable to that of the original ones with f 2value up to 90.0.Conclusion:The reverse analysis of the key indicators of stearic acid/magnesium stearate ratio can effectively guide the prescription of propranolol hydrochloride tablets.KEY WORDS reverse analytical method;propranolol hydrochloride;derivatization gas chromatography;AAS;stearic acid;magnesium stearate此方法可运用于仿制药的处方工艺摸索,为其处方制定开拓新的思路。