两种处理方法对精子顶体完整性和DNA损伤的影响_黄茜

表 １ 处理前后精液常规参数、精子顶体完整率及精子 ＤＦＩ 值 的变化（ｎ＝９０） Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｒｍ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ａｃｒｏｓｏｍｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｒｍ ＤＦＩ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ（ｎ＝９０）
参数
处理前
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ （ｓｗｉｍ－ ｕｐ ａｎｄ ｐｕｒｅ ｓｐｅｒｍ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）ｏｎ ｓｐｅｒｍ ｒｏｕｔｉｎｅ ｔｅｓｔ，ａｃｒｏｓｏｍｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ａｎｄ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｅｍｅｎ ｓａｍｐｌｅ ｏｆ ９０ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｗｉｍ－ ｕｐ ａｎｄ ｐｕｒｅ ｓｐｅｒｍ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｒｏｕｔｉｎｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ｓｐｅｒｍ ａｃｒｏｓｏｍｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｍａｒｋｅｄｌｙ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ａｎｄ ｓｐｅｒｍ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ （P＜０．０１）．Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｓｐｅｒｍ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｃｒｏｓｏｍｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（P＜０．０５）． Ｔｈｅ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｍａｒｋｅｄｌｙ（P＜０．０１）． Ｎｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｎｏｔｉｃｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ａｃｒｏｓｏｍｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｑｕａｌｉｔｙ ｃａｎ ｂｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ．
ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ｓｗｉｍ－ｕｐ ｍｅｔｈｏｄ，P＜０．０５
３ 讨论 精子体外处理中主要手段是对精液进行离心，而
离心过程对精子来说是不良刺激。有研究认为精子优 选中的离心技术若使用过度，Hale Waihona Puke Baidu显著提高活性氧 （Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉａｌｓ，ＲＯＳ）生成［５］，加之去除了含 抗氧化物质的精浆，也很容易造成精子的氧化应激损 伤。蒋彦等［６］认为，高相对离心力影响精子形态。本研 究中两种处理方法均依据世界卫生组织（ＷＨＯ）第五 版标准进行，通过处理前后对比，认为这两种方法在
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Ｃｈｉｎａ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａｐｒｉｌ ２０１３ Ｖｏｌ ． １３ Ｎｏ ．３ 中国热带医学 ２０１３ 年第 １３ 卷第 ３ 期
·论 著·
两种处理方法对精子顶体完整性和 ＤＮＡ 损伤的影响
黄茜，丘映 *，史秋雯，许常龙
摘要：目的 研究上游法和密度梯度离心法处理对精液常规参数、顶体完整性及 ＤＮＡ 损伤的影响。 方法 ９０ 例男性精液标本用上游法和密度梯度离心法处理，检测处理前后精液常规参数、精子顶体完整率及精子 ＤＮＡ 碎片指 数。 结果 两种方法处理后，精子浓度明显下降（P＜０．０１），精子活率、活力明显提高（P＜０．０１）；正常形态精子比例和 顶体完整率显著提高（P＜０．０５），ＤＮＡ 碎片指数显著降低（P＜０．０１），两种处理方法比较差异无统计学意义。 结论 两 种处理方法均可以使顶体完整精子比例较处理前明显提高，ＤＮＡ 损伤精子比例较处理前明显降低，但两法之间无统 计学差异。两种处理方法均可以不同程度优化精液质量，实验室可根据精液情况选择处理方法。
精子体外处理中是安全有效的。 本研究显示，两种处理方法都能显著提高活动精
子与前向运动精子的百分率，以上游法提高更显著， 而密度梯度离心法回收的精子浓度明显高于上游法。 上游法是根据精子的游动能力来选择精子，活力好的 精子能游出精浆，但精子必须克服重力作用才能游到 上层培养液中，故回收到的精子浓度低。辅助生殖技 术中在对精子浓度低的标本进行优选时，可以选择密 度梯度离心法，以提高精子回收率。
ａ＋ｂ 级精子（％）（ａ＋ｂ）ｓｐｅｒｍ（％） ３６．６１±８．６０ ６５．０９±８．３４＊ ５４．３６±８．７０＊Δ
正常形态精子（％）
８．５０±４．２７ １２．３５±３．９５＊ １１．０３±４．７１＊
Ｓｐｒｅｍ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ（％）
顶体完整精子（％）
７９．６５±５．４６ ８７．２２±３．７９＊ ８４．３８±４．９６＊
上游法
梯度离心法
Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
Ｂｅｆｏｒｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｕｐｗａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ
浓度（１０６／ｍｌ）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（１０６／ｍｌ） ７３．１６±３９．２５ ２３．１９±１０．３６＊ ４１．２２±１３．１０＊Δ
活动率（％）Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒａｔｅ（％） ５０．８７±１２．４１ ７３．８５±１１．３７＊ ６４．４１±１０．９８＊Δ
Ｍｉｃｒｏｐｔｉｃ 公司产品；精子培养液为 Ｅａｒｌｅ’ｓ（Ｑｕｉｎｎ’ｓ 公司）溶液， 加入人血清白蛋白（ＳＰＳ，美国）使蛋白浓 度达到 １０％；ＳｐｅｒｍＧｒａｄ 使用 Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ 产品，加入人血 清白蛋白、Ｈｅｐｅｓ 液（Ｑｕｉｎｎ’ｓ 公司），配制成 ９０％和 ４５％溶液，所含蛋白浓度均为 １０％；Ｄｉｆｆ－Ｑｉｃｋ 染液由 瑞典 ＤＢ 公司提供；植物凝集素荧光染液由美国 Ｓｉｇｍａ 公司提供；精子 ＤＮＡ 损伤检测试剂盒，为西班 牙 ＨａｌｏｓｐｅｒｍＲ 公司产品。 １．３ 上游法和梯度离心法 精液液化后，依据世界 卫生组织（ＷＨＯ）第五版标准进行［２］。 １．４ 精液常规参数检测 应用 ＳＣＡ 精子质量分析仪 对处理前后精液常规参数的检测，包括精子浓度、活 动率、活力。仪器参数设置及操作方法等严格按照产 家规定进行。对精子密度过高的标本进行稀释，方法 参照文献［３］。 １．５ 精子形态分析 采用 Ｄｉｆｆ－Ｑｉｃｋ 快速染色法，人 工计数分析方法参照文献［４］。 １．６ 精子顶体完整率检测 采用植物凝集素（Ｐｉｓｕｍ
作者单位：广西医科大学第三附属医院生殖中心，广西 南宁 ５３００３１ 作者简介：黄茜（１９７６￣），女，广西，汉族，本科，主管技师，主要从事男性生殖医学研究。 ＊ 通讯作者：Ｅｍａｉｌ：ｎｎｑｙｉｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
中国热带医学 ２０１３ 年第 １３ 卷第 ３ 期 Ｃｈｉｎａ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａｐｒｉｌ ２０１３ Ｖｏｌ ． １３ Ｎｏ ．３
正常形态比例是评价精子功能的重要指标，精子 形态也对辅助生殖技术具有重要意义，形态正常精子 数目与体外受精率呈正相关［７］，精子形态也是 ＩＣＳＩ 时 选择精子的指标之一［８］。两种处理方法都能显著提高 正常形态精子的百分率（P＜０．０５），这对提高精子的受 精能力是有利的。
精子顶体缺陷与男性不育有密切关系，顶体完整 率是反映精子顶体缺陷与否的重要指标［９］。在精子 － 透明带结合中，顶体结构异常的精子完全丧失了受精 功能，精子拥有正常顶体形态比正常形态本身更为重 要。本实验的结果表明两种方法处理后顶体完整精子 比例显著提高。形态正常精子的顶体也多是正常完整 的，处理后显著提高正常形态精子的同时，顶体完整 精子比例也提高了。说明在体外经过多次洗涤、离心 处理，并没有对精子顶体造成损伤。
两种方法处理后精子浓度明显下降（P＜０．０１），以 上游法下降更为显著； 精子活动率、前向运动精子 （ａ＋ｂ 级精子）比例在处理后明显提高（P＜０．０１），以上 游法提高更显著（P＜０．０１）；正常形态精子比例和顶体 完整精子比例显著提高（P＜０．０５），ＤＮＡ 碎片指数显著 降低 （P＜０．０１），两种处理方法比较差异无统计学意 义。见表 １。
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Ｓａｔｉｖｕｍ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＰＳＡ，）荧光标识法，依据世界卫生 组织（ＷＨＯ）第五版标准进行［２］。正常完整的精子顶体 占头部前 １／２￣３／４，呈现出明亮的半球型均匀绿色荧 光，边缘完整。荧光显微镜下（×１００）计数 ２００ 条精 子，计算出顶体完整精子比率。 １．７ 精子 ＤＮＡ 损伤的检测 采用精子染色质扩散 实 验（Ｓｐｅｒｍｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ，ＳＣＤ），操 作 步 骤 严 格按照说明书进行。在高倍镜（×４０）下计数大于 ５００ 条精子，并计算 ＤＮＡ 存在损伤精子所占比例，即精子 ＤＮＡ 碎片指数（ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ，ＤＦＩ）。 １．８ 统计学分析 采用 ＳＰＳＳ１３．０ 统计软件进行分 析，各组数据以（x±ｓ）表示，均值比较采用 t 检验。以 P＜０．０５ 为差异有统计学意义。 ２ 结果
Ｓｐｅｒｍ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ａｃｒｏｓｏｍｅ（％）
ＤＮＡ 碎片指数（％）ＤＦ（Ｉ ％）
２１．５３±５．４１ ９．５８±３．４６＊ １２．０６±３．０９＊
＊ 与处理前比较 P＜０．０５；Δ 梯度离心法与上游法比较 P＜０．０５
＊Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ P＜０．０５；Δｃｏｍｐａｒｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ
关键词：上游法；密度梯度离心法；顶体；ＤＮＡ 损伤；辅助生殖技术 中图分类号：Ｒ４４６．１９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９－９７２７（２０１３）３－３４０－０３
Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｗｏ ｓｐｅｒｍ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｎ ｓｐｅｒｍ ａｃｒｏｓｏｍｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ａｎｄ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ． ＨＵＡＮＧ Ｑｉａｎ，ＱＩＵ Ｙｉｎｇ，ＳＨＩ Ｑｉｕ－Ｗｅｎ，ｅｔ ａｌ（． Reproductive Center，The Third Affiliated Hospital of GuangXi Medical University， Nangning 530031，Guangxi，P.R.China; Correspondding author：QIU Ying，Email：nnqying@sina.com）
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓｗｉｍ－ ｕｐ； Ｐｕｒｅ ｓｐｅｒｍ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ； Ａｃｒｓｏｍｅ； ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ； ＡＲＴ
辅助生殖技术中需要用人工方法将精子从精液 中有效地分离出来，用于临床治疗。目前，实验室常用 的精液体外处理方法是上游法和密度梯度离心法，经 体外优选处理后，精子浓度、活力、形态等均可得到很 大程度的改善。但是不同方法处理后对精子顶体的影 响，尚少有报道；对精子 ＤＮＡ 损伤的影响目前尚存在 争议［１］。为此，本研究通过观察这两种方法处理前后对 精子常规参数、顶体完整性及 ＤＮＡ 碎片指数的变化， 旨在综合评价两种方法的优选效果，为男性不育患者 的治疗提供参考资料。 １ 资料与方法 １．１ 标本来源和处理 ９０ 例样本均来自 ２０１２ 年 １ 月 ￣６ 月在广西医科大学第三附属医院生殖中心就诊 的男性患者，年龄 ２５￣４２ 岁，平均（３２．５±４．８）岁。患者 禁欲 ２￣７ｄ，以手淫法取精液于专用取精杯中，置 ３７℃ 恒温箱中待液化，同一标本分别用上游法和密度梯度 离心法处理，处理前后进行各种参数分析。 １．２ 仪器和试剂 ＳＣＡ 精子质量分析仪为西班牙