质粒DNA的提取和PCR技术
提取质粒dna的方法
提取质粒dna的方法提取质粒DNA的方法是一种从生物样品中提取DNA的方法，用于分析基因组学、遗传学或其他基因相关的研究。
它是所有DNA技术的基础。
提取质粒DNA的方法主要包括三个步骤：破解细胞壁、提取DNA片段和提取DNA片段。
第一步，破解细胞壁。
为了提取细胞内的DNA，必须先破坏细胞壁。
这一步可以通过使用植物激素、酶和其他破坏细胞壁的物质来完成。
第二步，提取DNA片段。
在破坏细胞壁之后，生物样品中的DNA就可以从细胞内被提取出来。
这一步通常是将样品加入一定的溶液，如洗涤溶液，然后用放大器去提取DNA片段。
第三步，提取DNA片段。
在提取DNA片段之后，必须对其进行纯化处理，以便提取的DNA片段不会受到其他物质的干扰。
一般情况下，这一步是通过使用离心机将DNA 片段从溶液中分离出来，然后用水冲洗去除其他物质，最后得到纯净的DNA片段。
提取质粒DNA的方法也可以用来提取植物细胞内的DNA。
与提取动物细胞中的DNA不同，植物细胞内的DNA要更加困难，因为植物细胞周围可能有多层细胞壁，而这些细胞壁很难被破坏。
因此，植物细胞内的DNA提取一般都是采用化学方法，即使用碱性有机溶液，以破坏细胞壁，然后再用放大器提取DNA片段。
此外，还有一些无细胞DNA提取的方法，如PCR法、小RNA测序、质粒提取等。
PCR法是用来检测和检验DNA的一种技术，可以扩增微量DNA，从而获取充足的DNA材料进行检测。
小RNA测序是一种新型的基因测序技术，可以检测植物和动物体内特定的RNA，检测特定靶基因的表达。
最后，质粒提取是一种从生物样品中提取DNA质粒的技术，可以用于分子生物学研究，如基因克隆、DNA测序等。
总之，提取质粒DNA的方法是一种常用的DNA提取技术，也是所有DNA技术的基础。
它可以用于从动物和植物样品中提取DNA片段，以及从无细胞DNA中提取DNA质粒，以用于各种基因组学、遗传学和分子生物学研究。
实验一、质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳
三、仪器、材料与试剂
(一)仪器 1．恒温培养箱 2．恒温摇床 3．台式离心机 4．高压灭菌锅 (二)材料 1．含连接外源基因质 粒的E. coli 2．1.5mL Eppendorf管 3．吸头、微量移液器
(三)主要试剂
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl度,减少抽提过程中的 机械剪切作
四、实验步骤
• (一)、称取0.5g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入50 mL 0.5xTAE 缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，温度降至60 ℃左 右时加入少许EB溶液，摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。 • (二)胶板的制备
1．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 2．将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，加入EB后，缓缓倒入有 机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(不要形成 气泡)。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操 作，并小心污染环境。
Solution III
5mol／L 乙酸钾 冰乙酸 水 60 mL 11．5mL 28．5mL
TE缓冲液 10mmo1／L Tris· HCl 1mmo1／L EDTA(pH8.0) 胰RNA酶溶液
将RNA酶溶于10mmo1/L Tris· HCl(pH7．5)和 15mmo1/L NaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100℃加热 15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。
3．待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。
4．加入电泳缓冲液至电泳槽中。
• (三)加样 • 用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品 加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。 • (四)电泳
1．接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极， DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速 度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
质粒DNA的提取定量PCR鉴定
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定量PCR：使用定量PCR仪进行定量PCR反应，获取质粒DN的拷贝数
提取质粒DN：使用碱裂解法或柱层析法等方法提取质粒DN
数据分析：使用定量PCR软件分析定量PCR结果，获取质粒DN的拷贝数
结果验证：使用电泳法或荧光定量PCR等方法验证定量结果
定量注意事项
确保样品的纯度和完整性
PCR反应需要四种主要成分：模板DN、引物、DN聚合酶和dNTP
PCR反应可以快速复制特定的DN片段，用于基因克隆、突变检测、基因表达分析等领域
PCR反应体系
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模板DN：提供待扩增的DN序列
DN聚合酶：催化DN复制
Mg2+：稳定DN聚合酶活性
酶抑制剂：防止非特异性扩增
电泳试剂：用于电泳分析的试剂，如溴化乙锭、琼脂糖等
荧光定量PCR仪：用于定量PCR分析的仪器
实验步骤和实验操作
质粒DN提取：选择合适的菌株，培养至对数生长期，然后进行质粒DN的提取。
PCR鉴定：设计特异性引物，进行PCR反应，然后进行电泳分析。
实验操作：按照实验步骤进行实验操作，注意操作规范和实验安全。
质粒DN提取：用于基因克隆、基因表达和基因功能研究
PCR鉴定：用于基因突变、基因表达和基因功能研究
质粒DN提取和PCR鉴定：用于药物开发和生物制药
在基因工程中的应用
质粒DN提取：用于基因克隆、基因表达和基因编辑等实验
PCR鉴定：用于检测基因突变、基因表达和基因拷贝数等实验
基因工程：通过改变生物的基因来改变其性状，如抗病、抗虫、抗除草剂等
质粒的提取及酶切实验报告
质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒，通过酶切实验检测质粒DNA片段长度，并处理实验结果。
二、实验原理
1、质粒DNA提取：使用特定的提取试剂，先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA；
2、质粒DNA酶切：采用酶切的方法，对质粒DNA进行切割，形成小片段；
3、质粒DNA测序：采用测序仪对质粒DNA片段进行测序，从而确定其长度。
三、实验材料
1、提取试剂：主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成；
2、PCR反应液：主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成；
3、酶：主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成；
4、测序仪：用于测序质粒DNA的片段长度；
四、实验步骤
1、提取质粒DNA：将实验样品放入提取试剂中，加热30分钟，然后用混合物洗涤一次，最后离心得到清澈的液体，含有提取的质粒DNA；
2、进行PCR反应：将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中，在适当温度下反应10分钟；
3、酶切：将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中，在规定温度下酶切1小时；
4、离心质粒DNA片段：将酶切后的反应液离心，以得到质粒DNA片段；
5、进行测序：将质粒DNA片段放置于测序仪中，逐一测序后得到结果；
五、实验结果及分析
实验结果：
质粒DNA片段长度：
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。
遗传学 实验四 质粒DNA的提取与鉴定
实验四质粒DNA的提取与鉴定一、实验目的1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。
2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。
二、实验原理质粒广泛存在与原核细胞中，大多是双联的共价闭合环状DNA分子，长度可以从1kb 到200kb不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。
在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用松弛型（其复制受宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。
从大肠杆菌中分离质粒的方法很多，常见的有煮沸法和碱变性抽提法。
碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。
在pH高达12.5的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，变形的质粒DNA又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
在抽屉过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型：①超螺旋型，即共价闭合环状DNA（cccDNA）；②一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环DNA（ocDNA）；③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。
在这三种构型中，cccDNA由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度较慢；线状DNA受到的阻力最大，迁移速度最慢。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，除受分子构型的影响，还受所带净电荷多少的影响。
因此在鉴定质粒DNA纯度时，应尽量减少电荷效应。
增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应，分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异，由此将不同构型的质粒DNA 分开。
质粒DNA的提取和PCR技术
试剂准备 ：
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡渗透压，调节PH值，有利悬浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 调节PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和离子 抑制DNase活性 高压灭菌15min ，贮存于4℃ 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解细菌，变性线性DNA 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并与SDS
溶液二中NaOH不要暴露在空气中太久。可能会与空气中的CO2 与 NaOH作用,减弱了条
带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间 体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提 得到质粒样品中应不含线性DNA ，另外如果发现运动得较慢的 带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。
反应参数要素： 反应参数要素
1。PCR反应五要素
（1）Taq酶：酶量：催化一典型的PCR反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特 异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。保真性： rTaq-1~2kbp,LaTaq-~20kbp,Pfu（Pyrobest）-. 吸取时注意，保存在甘油中故比较粘稠。 （2）dNTP的质量与浓度 ：在PCR反应中，一般反应 中每种dNTP的终浓度为20-200µmol/L 。4种dNTP的 浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同 于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。 （3）模板；模板可以是DNA片断，基因组，质粒， 噬菌体，菌液等任何含DNA生物样品。可以是单链分 子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状 分子 一般反应中的模板数量为102 -105 拷贝。模板纯 化程度影响扩增效率。
注意问题：
1。防止核酸污染：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高
质粒DNA的提取、定量、PCR鉴定
1. 菌液煮沸10min 2、取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各
四、结果分析
1、用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定; 2、加5uLPCR产物进行电泳; 3、预期PCR产物大小约400~500bp;
五、实验原理
* 由1985年穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获得了 1993年的诺贝尔化学奖。
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应， 是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物 为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复 制DNA的过程。
保存：-20 ℃
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
Taq酶
72℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80
活 性
60
40
20
40 50 60 70 80 90
温度(℃)
（四）dNTP
• dNTP浓度取决于扩增片段的长度 • 四种dNTP浓度应相等 • 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产 量 • dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA 聚合酶的活性。
变性充分：变性温度越高，时间越长变性就越充分。 变性温度、时间要适应：温度过高、时间过长又会影响 Taq DNA 聚 合酶的活性， 变性温度90-95 ℃为宜。
质粒DNA的提取、定量、 与PCR鉴定
质粒DNA提取、定量、酶切与PCR鉴定
限制性内切酶
影响酶切反应的因素
➢ 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等 均能抑制酶反应; ➢ 反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适 离子强度可以激发酶切反应; ➢ 反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%; ➢ 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;
DNA样品较纯,符合实验要求 RNA污染 有蛋白质或其它杂质的污染
实验仪器
核酸蛋白检测仪(Eppendorf BioPhotometer plus)
比色杯
数据处理
测量次数 1 2 3
平均值
质粒DNA浓度
(μg/ml)
Ratio值
(A260/A280)
定量检测
第三部分 酶切鉴定
DNA Restriction Enzyme Digestion
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用下，以dNTP 为原料，引物 为复制起点， 模板DNA的一 条单链在解链 和退火之后延 伸为一条双链
延伸
72˚C
实验原理
变性
95˚C
加热使模板DNA 在高温下90℃-95 变性，双链解链
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的5℃ 左右），与 模板DNA互补 退火形成部 分双链
✓ 注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光 度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度 和Ratio值.
实验方法
2.根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的 纯度（Ratio=A260/A280）
• Ratio= 1.8 • Ratio＞1.9 • Ratio＜1.6
全质粒pcr基本原理
全质粒pcr基本原理
全质粒PCR（Plasmid PCR）是一种用于检测和鉴定质粒的方法。
质粒是存在于细菌中的环状DNA分子，常用于基因克隆、表达和传递等研究中。
全质粒PCR的基本原理如下：
1. 提取质粒：首先需要从细菌中提取质粒DNA。
通常使用碱裂解法或商业DNA提取试剂盒来提取质粒DNA。
2. 选择引物：根据需要检测的质粒序列，设计合适的引物。
引物应分别位于质粒DNA的两个不同区域上，使得PCR扩增产物能够覆盖整个质粒序列。
3. PCR扩增：将提取的质粒DNA作为模板，与引物一起进行PCR 扩增。
PCR反应包括多个循环，每个循环包括DNA变性、引物结合和DNA复制等步骤。
扩增的温度和时间参数需要根据具体的引物设计和PCR仪器的要求进行设定。
4. 分析PCR产物：将PCR扩增产物进行电泳分析。
可以使用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等方法，将扩增产物与DNA分子量标准进行比较，确定质粒是否存在以及扩增的效果如何。
全质粒PCR通过对质粒DNA进行特异性扩增，可以快速、准确地检测和鉴定质粒的存在。
这种方法在基因工程和分子生物学研究中广泛应用，可用于确认克隆的质粒是否正确、筛选质粒带有特定序列的变体等。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告(2020年整理).pptx
实验一、质粒 DNA 的提取及检测
【实验目的】 1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术 3、学会 PCR 操作的基本技术
第一部分 质粒DNA 的提取
一、实验原理： 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差
二、仪器与试剂 1、仪器 恒温摇床、台式离心机 2、试剂 溶液 I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE 缓冲液、胰 RNA 酶、酚、氯仿
三、实验步骤 1、 将 2mL 含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的 LB 液体培养基加入到试管中，接入含 pUC19
质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。 2、 取 1.5mL 培养物倒入微量离心管中，4000r/min 离心 2min。 3、 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4、 将细菌沉淀悬浮于 100μL 溶液 I 中，充分混匀，室温放置 10 min。 5、 加 200μL 溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上 5min。 6、 加入 150μL 溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置 15min。 7、 12000r/min，离心 15min，将上清转至另一离心管中。 8、 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心 5min，
变性
94℃
45s
退火
56℃
45s
延伸
72℃
45s
完全延伸
72℃
3min
（3）PCR 结束后，取 10μl 产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
在紫外灯（254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色荧光条带。
第三部分 PCR 扩增制备目的基因
质粒dna提取实验报告
质粒dna提取实验报告质粒DNA提取实验报告引言：质粒DNA提取是分子生物学研究中常用的技术手段之一。
通过提取质粒DNA，我们可以获得特定的基因片段，进一步进行基因克隆、转染、PCR扩增等实验。
本实验旨在探究质粒DNA提取的方法和步骤，并验证提取的质粒DNA是否纯度高、浓度适宜。
材料与方法：1. 细菌培养：选择含有目标质粒的细菌菌株，如大肠杆菌。
2. 培养基制备：制备含有适当抗生素的LB培养基。
3. 菌液培养：在培养基中接种细菌菌液，培养至适当的生长期。
4. 细菌收获：离心细菌培养液，收集菌体沉淀。
5. 细胞裂解：使用裂解液将细菌细胞壁破裂，释放细胞内的DNA。
6. 蛋白质沉淀：通过加入盐溶液，将蛋白质沉淀下来。
7. DNA沉淀：加入酒精，使DNA沉淀出来。
8. 洗涤：使用乙醇洗涤沉淀的DNA，去除杂质。
9. 干燥：将洗涤后的DNA干燥至无水状。
结果与讨论：经过以上步骤，我们成功提取到了质粒DNA。
下面将对实验结果进行分析和讨论。
首先，我们需要评估提取的质粒DNA的纯度。
常用的方法是使用比色法或分光光度法测量DNA溶液的吸光度比值（A260/A280）。
纯度较高的DNA溶液其吸光度比值通常在1.8-2.0之间。
如果比值低于1.8，说明可能存在蛋白质、RNA 或其他杂质的污染，需要进一步纯化处理。
其次，我们需要评估提取的质粒DNA的浓度。
常用的方法是使用比色法或分光光度法测量DNA溶液的吸光度（A260）。
通过测量吸光度并使用标准曲线，我们可以计算出DNA的浓度。
在实验中，我们可以根据需要调整DNA的浓度，以适应后续实验的要求。
此外，我们还可以通过琼脂糖凝胶电泳来评估提取的质粒DNA的完整性。
将DNA样品与DNA标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，经电泳分离后，通过比较DNA带的大小和形态，我们可以初步判断提取的质粒DNA是否完整。
在实验过程中，需要注意的是避免DNA的降解。
DNA在裂解液中容易受到核酸酶的降解，因此在裂解过程中应尽量避免长时间的暴露。
构建质粒原理
构建质粒原理
质粒原理是指质粒的特性和功能原理，质粒作为一种圆环状的DNA分子，常存在于细菌和其他一些生物体中。
质粒含有自
我复制的基因序列，通常可以独立于细菌染色体复制和遗传。
质粒的构建主要包括以下几个步骤：
1. DNA提取：从某个生物体中提取目标DNA序列，可以通过PCR扩增等方法得到所需基因片段。
2. 寻找适合的质粒：根据目标基因片段的大小、复制起始位点以及所需表达的细菌菌株等条件，选择合适的质粒。
3. 质粒预处理：将质粒以及目标DNA片段进行酶切，选择适
当的限制酶将目标DNA片段插入到质粒的多克隆位点上。
4. 连接：通过DNA连接酶将目标DNA插入到质粒上，得到
重组质粒。
5. 质粒转化：将重组质粒导入到一种适合的宿主细菌中，通过热激冷冻法、电穿孔法等方法使质粒在细菌中稳定复制。
6. 表达：通过适当的诱导剂或选择性培养基，促使质粒在细菌中大量复制和表达目标基因。
通过质粒构建，可以实现目标基因的研究和表达。
质粒原理的核心是质粒的自主复制和传递，通过构建重组质粒，可以将外源基因有效地导入到宿主细菌中，实现目标基因的放大和表达。
质粒dna的提取实验报告
质粒dna的提取实验报告质粒DNA的提取实验报告。
实验目的，通过实验，掌握质粒DNA的提取方法，了解质粒DNA的结构和特点。
实验原理，质粒DNA是细菌细胞内的一种环状双链DNA，具有自主复制的能力。
提取质粒DNA的方法一般包括细胞破裂、蛋白质和RNA的去除、质粒DNA的纯化等步骤。
实验材料，细菌培养物、质粒DNA提取试剂盒、离心管、离心机、PCR仪等。
实验步骤：1. 取细菌培养物1ml，进行细菌离心，将菌体沉淀。
2. 加入细菌破裂液，使菌体破裂释放质粒DNA。
3. 加入蛋白酶和RNase，去除蛋白质和RNA。
4. 用离心机离心，将沉淀物中的DNA纯化。
5. 用PCR仪进行PCR扩增，验证提取的质粒DNA。
实验结果：经过实验，成功提取到了质粒DNA。
通过PCR扩增，验证了提取的质粒DNA 的完整性和纯度。
实验结论：通过本次实验，我们成功掌握了质粒DNA的提取方法，了解了质粒DNA的结构和特点。
质粒DNA的提取是分子生物学研究中的重要步骤，掌握了这一技术，将为我们今后的科研工作提供有力支持。
实验注意事项：1. 在实验过程中要注意细菌培养物的处理和离心操作的安全性。
2. 实验中使用的试剂盒要按照说明书操作，注意避光和保存条件。
3. 实验过程中要注意保持实验环境的清洁和整洁，避免外源DNA的污染。
4. 实验结束后要及时清理实验台和设备，保持实验室的整洁。
通过本次实验，我们不仅掌握了质粒DNA的提取方法，还培养了实验操作的技能和实验室的安全意识。
这对我们今后的科研工作具有重要的指导意义。
质粒提取方法及原理
质粒提取方法及原理质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，当前通常用其来特指细菌、真菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的 DNA分子。
在基因工程领域，质粒常常被当做基因的载体使用。
在分子生物学中，质粒 DNA被当做基因运载工具具有非常广泛的应用。
在质粒DNA的应用过程中，其纯度对于酶切、PCR扩增等实验结果有着比较大的影响，因此需要保证质粒DNA提取的纯度和效率。
在细菌中提取质粒DNA通常按照以下步骤进行:第一步，培养细菌，使质粒扩增;第二步，进行细菌的收集和裂解;第三步，质粒 DNA的分离和纯化。
在质粒DNA的提取过程中，其提取效果和其大小呈现出正比例关系，越小越容易进行提取，这主要是由于，如果质粒DNA比较大的话，其特性机会和染色体DNA比较接近，这样想要将二者分离开来难度就会变大。
在进行质粒DNA的分离时，适宜的条件是非常重要的，主要包括pH值、SDS浓度、时间和溶菌温度等，在适宜的条件下质粒DNA和染色体DNA 才能够更好的分离开来。
细菌浓度对于质粒 DNA的提取也是非常重要的，如果细菌的浓度比较高，那么在溶菌时，溶菌液很难和细菌液充分混合，导致溶菌不彻底的问题，这样会造成质粒的回收率比较低；而如果细菌溶度比较低，溶菌液和菌液均分混合，会造成溶液中含有较多的蛋白质、染色体以及菌体碎片，在这样的情况下，沉淀时质粒回合这些物质共沉，进而导致质粒的回收率也会比较低。
在生物学的相关研究之中，细菌质粒DNA的提取是比较常规的技术和操作，主要的方法有碱裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等，下面对碱裂解法进行介绍。
碱裂解法碱裂解法是当前应用比较广泛的质粒 DNA提取方法，这种方法的优点在于提取的质粒DNA纯度高，操作便捷，缺点是需要较长的提纯时间。
研究人员在缩短这一方法的提纯时间方面做了大量的研究，但是没有得到理想的效果，当前这一方法提取 DNA 的时间都在1.5h 以上。
碱裂解法提取质粒DNA的基本原理:首选，在菌液中加入溶液Ⅰ，细菌细胞悬浮，同时其中的EDTA会和Ca2+以及Mg2+鳌合，起到抑制DNase活性的作用；然后，加入溶液Ⅱ，将细胞裂解，在这个过程中蛋白质和少量质粒将会变质；再次，加入溶液Ⅲ，使多数蛋白质以及染色体DNA被沉淀，并使得质粒DNA复性。
质粒dna的提取实验报告
质粒dna的提取实验报告引言：DNA是生命的基本遗传物质，研究DNA的结构和功能对于理解生命的本质具有重要意义。
在分子生物学实验中，质粒DNA的提取是一项关键步骤，它能够帮助我们获得足够纯度和数量的DNA样本，以便进行后续的实验分析。
本实验旨在提取质粒DNA，并验证提取效果和纯度。
材料和方法：1. 细菌培养：选择含有目标质粒的菌落进行预培养，接种至100ml含有适当抗生素的LB培养基中，37℃摇床培养过夜。
2. 提取质粒DNA：使用质粒DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。
主要步骤包括细菌离心、细菌裂解、质粒DNA与蛋白质分离、质粒DNA沉淀和洗涤等。
3. DNA质量和浓度检测：使用紫外分光光度计检测提取得到的DNA样品的260nm吸光度值，计算DNA浓度。
结果和讨论：量和浓度的检测。
质检测结果显示，提取得到的质粒DNA纯度较高，吸光度比值（A260/A280）在1.8-2.0之间，说明DNA中没有明显的蛋白污染。
这对于后续实验如聚合酶链式反应（PCR）等有着重要的影响。
同时，我们还测定了DNA的浓度，得到了大致的目标值，为1μg/μl左右。
在实验过程中，我们需要注意一些关键点，例如细菌的培养条件、细菌离心和裂解的时间和速度、蛋白质分离的温度等。
这些因素都会对质粒DNA的提取效果产生影响，需要精确控制，保证实验结果的准确性。
质粒DNA的提取是分子生物学实验的常见步骤之一，其应用广泛。
例如，可以将提取得到的DNA用于质粒转染、DNA测序、基因克隆等研究中。
同时，提取得到的质粒DNA也可以用于分子诊断、疾病基因检测等临床应用。
结论：提取效果和纯度。
提取得到的DNA可以广泛应用于分子生物学及医学研究领域，为后续的实验工作提供了坚实的基础。
总结：质粒DNA的提取是分子生物学实验中不可或缺的一环。
本实验通过严谨的操作步骤和质量检测，成功地提取了高纯度、适量的质粒DNA。
在今后的实验工作中，我们将继续基于这些DNA 样本，进一步开展相关研究，推动科学的发展和创新。
枯草芽孢杆菌质粒DNA的提取方法与PCR的设计
枯草芽孢杆菌质粒DNA的提取方法与PCR的设计班级：生物制药122 姓名：张泽伟学号：12243247一、枯草芽孢杆菌质粒DNA的提取1)菌体的培养与收集：挑取枯草芽孢杆菌的单菌落于2~10mlLB液体培养基中28~35℃振荡培养10~15小时，0.5~5wt%转接到40~150ml新鲜LB液体培养基中继续振荡培养，至细菌生长密度为OD600＝0.5~1.2，收集40~150mg菌体于离心管中；2）原生体的制备：向收集的菌体中加入1~1.5ml预冷的洗涤液A悬浮细胞，离心弃上清，菌体重悬于200~300μl细胞裂解液B，37℃温育1.5~2h；3）细胞的裂解和质粒的提取：向制备好的上述溶液中加入200~300μl溶液C，缓慢混匀，68℃处理10min，裂解细胞，向裂解液中加入100~150μl溶液D，轻轻混匀，于20℃中放20~30min；4℃离心，将上清液转移至新离心管内，加入无水乙醇，20℃过夜；4℃离心，弃上清，70wt%乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀，加入无菌纯水溶解沉淀；4）质粒的纯化：将制备好的上述溶液转移到一个干净的离心管中，加入25倍体积DNA联接液E到离心管中，用手颠倒15分钟混匀；将联接混合液加入一个含结合柱的收集管中，室温放置15分钟，3000~10000rpm离心1~3分钟，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入离心管中，再次加入联接混合液离心，直至所有联接混合液离心完毕；将含结合柱的收集管放置在一个新的离心管中，加入300~700μl洗涤液F到结合柱中，离心，倒掉收集管中的废液；将结合柱重新放回收集管，8000~18000rpm离心15分钟；将结合柱装入新的离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30~50μl洗脱液G，不戳破膜，室温放置，8000~15000rpm离心1~3分钟，离心管中即为分离的DNA，贮存于20℃；其中洗脱液G为0.1mM的HCl，pH=9.0。
质粒的工艺流程
质粒的工艺流程质粒是一种重要的生物学工具，用于在基因工程中携带和传递外源的DNA序列。
工艺流程是指质粒的制备和改造过程，涉及到质粒的提取、限制酶切、连接、转化和筛选等步骤。
下面将详细介绍质粒的工艺流程。
1. DNA提取：质粒通常从菌株中提取。
首先，将选定的菌株进行培养扩增，获得大量的细菌。
然后，将培养液离心，以获得含有细菌和质粒的沉淀。
利用化学方法或商用DNA提取试剂盒可以提取质粒DNA。
2. 限制酶切：质粒DNA通常被限制酶切为片段，以便进行后续的连接和分析。
限制酶是一种酶，可以识别和切割特定的DNA序列。
将限制酶加入质粒DNA 溶液中，按照酶切反应条件进行反应。
酶切反应通常在适当的温度和酶缓冲液下进行。
酶切反应后，通过琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA片段的分离和检测。
3. 连接：在限制酶切的质粒DNA片段和外源DNA片段之间进行连接。
这一步通常需要将两者暂时性地“黏合”在一起，然后使用DNA连接酶将它们永久性地连接。
连接方法有多种，常用的是T4 DNA连接酶，具体方法是将质粒DNA 片段和外源DNA片段与连接酶和连接缓冲液一起反应，通常在适当的温度下进行。
4. 转化：连接后的质粒需要转移到宿主细胞中进行进一步的繁殖和表达。
转化是将质粒DNA导入到细胞中的过程。
主要有三种转化方法：自然转化、电转化和化学转化。
其中，自然转化是将质粒DNA和细胞混合，利用细胞壁的微小孔洞和质粒DNA的负电荷相互作用，使DNA进入细胞。
电转化是利用电场刺激，使质粒DNA通过细胞壁和细胞膜进入细胞。
化学转化则是通过特定的化学条件使细胞膜通透性增加，从而实现质粒DNA导入细胞。
5. 筛选：在转化后，需要对细菌进行筛选，以确定哪些细菌取得了质粒。
通常利用抗生素筛选，即在培养基中添加抗生素，只有带有抗生素抗性基因的细菌才能存活下来。
在含抗生素的培养基中生长的细菌通常被认为是成功转化并带有外源DNA的细菌。
此外，还可以使用其他标记方法，如荧光蛋白标记、酶标签标记等来筛选质粒。
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3。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时 如果能看到三条带，这三条
带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间 体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提 得到质粒样品中应不含线性DNA ，另外如果发现运动得较慢的 带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。
操作步骤注意事项： 操作步骤注意事项
1。配置反应体系。 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 1ul 4种dNTP混合物 200umol/L 引物 各1～10pmol 模板DNA 10～200ng Taq DNA聚合酶 0.25u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 10ul 2。 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 50℃ 1分钟， 72℃ 1.5分钟， 共30轮循环。 3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。 4. 电泳结束，观察
注意问题：
1。防止核酸污染：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高
的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳 性的产生。
吸样枪:吸样枪污染值得注意.由于操作时不慎将样品或模板核酸 吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源。吸头、小离心管应 一次性使用 。 开关盖时注意不要接触到内壁，并且不要开盖时间太长，以免 污染。 2。预混和分装PCR试剂:PCR反应液应预先 配制好，然后小量 分装。节省时间并保证各管成分平行 。最好在加样时都在冰上 低温进行，以防止加入酶后反应立即开始。 3。阳性对照与阴性对照的设立。-重要！ 阳性对照与阴性对照的设立。 重要！ 阳性对照与阴性对照的设立 重要 有利于问题的解决， 有利于问题的解决，对于优化条件以及排除污染可能性都很有 用！
粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物， DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物， 复性 同时K+ SDSK+使 同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6.12000g离心10min取上清，加入等体积的苯酚/氯仿 /异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g10min。-抽提掉
剩余蛋白。 剩余蛋白。
7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入0.5~0.7 倍体积的异丙醇，混匀，4℃离心12000g，10min。-可
以用两倍体积的无水乙醇，室温放置2 离心。 以用两倍体积的无水乙醇，室温放置2-5min 离心。不要沉淀太 久
8.1ml 75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心，弃上清，将 沉淀在室温下晾干。-不要太干，否则不易溶解。 不要太干， 9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃ 水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。 10.琼脂糖电泳检测。检测，定量。
质粒DNA的提取和 质粒DNA的提取和 PCR技术 PCR技术
质粒提取
基本原理 操作步骤 注意事项 实验室安全
基本原理
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至 200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独 立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份.质粒已 成为目前最常用的基因克隆的载体分子，碱裂解法是 最常用的方法。 基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时， 当菌体在NaOH 溶液中裂解时 白质与线性DNA发生变性，质粒释放到上清中。 DNA发生变性 白质与线性DNA发生变性，质粒释放到上清中。当加 入中和液后，因为闭环的质粒DNA DNA分子虽然氢键破坏 入中和液后，因为闭环的质粒DNA分子虽然氢键破坏 但双链并不分离。能够迅速复性，呈溶解状态， 但双链并不分离。能够迅速复性，呈溶解状态，离心 时留在上清中；蛋白质与染色体DNA变性相互缠绕成 时留在上清中；蛋白质与染色体DNA变性相互缠绕成 DNA 大分子复合物而呈絮状被SDS覆盖， SDS覆盖 大分子复合物而呈絮状被SDS覆盖，当加入溶液三后 形成PDS被离心时可沉淀下来。 PDS被离心时可沉淀下来 形成PDS被离心时可沉淀下来。
4）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有 显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度 为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。 （5）引物：PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度。最佳的引物浓度一般在0.1到 0.5μM。以最低引物量产生所需要的结果为好，引物 浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物 之间形成二聚体的机会。 引物设计的好坏是决定PCR成功与否最重要的因素。
基因组DNA会慢慢断裂 混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试 基因组DNA会慢慢断裂 。混匀动作要轻柔 既保证细菌沉淀在试 DNA 剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基 剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒 和染色体基 因组DNA 。 因组
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀， 见白色絮状沉淀，冰上放置3-5min。-中和溶液，此时质 中和溶液，
PCR的反应动力学 PCR的反应动力学 ：
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反 应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。平均扩增效率的理 论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应曲线：反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随 着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加， 而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应 称平台期数（原因：PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和 活性及非特异性产物的竟争等因素）。
试剂准备 ：
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡渗透压，调节PH值，有利悬浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 调节PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和离子 抑制DNase活性 高压灭菌15min ，贮存于4℃ 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解细菌，变性线性DNA 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并与SDS
反应参数要素： 反应参数要素
1。PCR反应五要素
（1）Taq酶：酶量：催化一典型的PCR反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特 异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。保真性： rTaq-1~2kbp,LaTaq-~20kbp,Pfu（Pyrobest）-. 吸取时注意，保存在甘油中故比较粘稠。 （2）dNTP的质量与浓度 ：在PCR反应中，一般反应 中每种dNTP的终浓度为20-200µmol/L 。4种dNTP的 浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同 于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。 （3）模板；模板可以是DNA片断，基因组，质粒， 噬菌体，菌液等任何含DNA生物样品。可以是单链分 子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状 分子 一般反应中的模板数量为102 -105 拷贝。模板纯 化程度影响扩增效率。
基本原理：
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互 补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤 构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使 之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板 DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度 降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③ 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下， 以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制 原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循 环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”， 而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～ 4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
作用沉淀
4.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）苯酚变性抽提蛋白，为
tris-base平衡酚。氯仿防止苯酚与水互溶。异戊醇的作用是降 低表面张力，可以减少泡沫
5.异丙醇，乙醇（无水乙醇、70%乙醇）沉淀质粒 6.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。 RNase A：10mg/ml
PCR技术
基本原理 反应动力学 使用步骤及注意事项 反应参数要素 PCR优化 优化
PCR技术
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是 80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有 特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易 自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目 的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百 万倍,使肉眼能直接观察和判断 。-可以用于基因克隆， 目的基因检测等。 发展：Taq DNA聚合酶：分离于温泉菌中，耐高温。 PCR和TaqDNA聚合酶被美国《科学》杂志1989年的 “年度分子”，并被列为80年代10项粒质量： 首先实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提
取，因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。其次操作 过程注意：避免基因组断裂，除净蛋白，盐离子清洗干净。 质粒数量：同量摇菌量中质粒量取决于质粒拷贝数。低拷贝 数质粒可以通过添加氯霉素来增大拷贝数。
2。阳性菌破壁裂解比较困难，可以先用溶菌酶处理。
操作步骤及注意事项
1挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中， 于37℃振荡培养14～18 h。-培养时间不能太长，否则细 培养时间不能太长，
菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。 菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。