质粒DNA的提取和PCR技术

PCR的反应动力学 PCR的反应动力学 ：
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反 应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。平均扩增效率的理 论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应曲线：反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随 着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加， 而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应 称平台期数（原因：PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和 活性及非特异性产物的竟争等因素）。
PCR技术
基本原理 反应动力学 使用步骤及注意事项 反应参数要素 PCR优化 优化
PCR技术
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是 80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有 特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易 自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目 的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百 万倍,使肉眼能直接观察和判断 。-可以用于基因克隆， 目的基因检测等。 发展：Taq DNA聚合酶：分离于温泉菌中，耐高温。 PCR和TaqDNA聚合酶被美国《科学》杂志1989年的 “年度分子”，并被列为80年代10项重大科学发明之 首
质粒DNA的提取和 质粒DNA的提取和 PCR技术 PCR技术
质粒提取
基本原理 操作步骤 注意事项 实验室安全
基本原理
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至 200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独 立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份.质粒百度文库 成为目前最常用的基因克隆的载体分子，碱裂解法是 最常用的方法。 基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时， 当菌体在NaOH 溶液中裂解时 白质与线性DNA发生变性，质粒释放到上清中。 DNA发生变性 白质与线性DNA发生变性，质粒释放到上清中。当加 入中和液后，因为闭环的质粒DNA DNA分子虽然氢键破坏 入中和液后，因为闭环的质粒DNA分子虽然氢键破坏 但双链并不分离。能够迅速复性，呈溶解状态， 但双链并不分离。能够迅速复性，呈溶解状态，离心 时留在上清中；蛋白质与染色体DNA变性相互缠绕成 时留在上清中；蛋白质与染色体DNA变性相互缠绕成 DNA 大分子复合物而呈絮状被SDS覆盖， SDS覆盖 大分子复合物而呈絮状被SDS覆盖，当加入溶液三后 形成PDS被离心时可沉淀下来。 PDS被离心时可沉淀下来 形成PDS被离心时可沉淀下来。
剩余蛋白。 剩余蛋白。
7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入0.5~0.7 倍体积的异丙醇，混匀，4℃离心12000g，10min。-可
以用两倍体积的无水乙醇，室温放置2 离心。 以用两倍体积的无水乙醇，室温放置2-5min 离心。不要沉淀太 久
8.1ml 75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心，弃上清，将 沉淀在室温下晾干。-不要太干，否则不易溶解。 不要太干， 9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃ 水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。 10.琼脂糖电泳检测。检测，定量。
溶液二中NaOH不要暴露在空气中太久。可能会与空气中的CO2 与 NaOH作用,减弱了其碱性。
3。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时 如果能看到三条带，这三条
带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间 体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提 得到质粒样品中应不含线性DNA ，另外如果发现运动得较慢的 带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。
其它注意事项：
1。质粒质量： 首先实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提
取，因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。其次操作 过程注意：避免基因组断裂，除净蛋白，盐离子清洗干净。 质粒数量：同量摇菌量中质粒量取决于质粒拷贝数。低拷贝 数质粒可以通过添加氯霉素来增大拷贝数。
2。阳性菌破壁裂解比较困难，可以先用溶菌酶处理。
4）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有 显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度 为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。 （5）引物：PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度。最佳的引物浓度一般在0.1到 0.5μM。以最低引物量产生所需要的结果为好，引物 浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物 之间形成二聚体的机会。 引物设计的好坏是决定PCR成功与否最重要的因素。
注意问题：
1。防止核酸污染：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高
的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳 性的产生。
吸样枪:吸样枪污染值得注意.由于操作时不慎将样品或模板核酸 吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源。吸头、小离心管应 一次性使用 。 开关盖时注意不要接触到内壁，并且不要开盖时间太长，以免 污染。 2。预混和分装PCR试剂:PCR反应液应预先 配制好，然后小量 分装。节省时间并保证各管成分平行 。最好在加样时都在冰上 低温进行，以防止加入酶后反应立即开始。 3。阳性对照与阴性对照的设立。-重要！ 阳性对照与阴性对照的设立。 重要！ 阳性对照与阴性对照的设立 重要 有利于问题的解决， 有利于问题的解决，对于优化条件以及排除污染可能性都很有 用！
基因组DNA会慢慢断裂 混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试 基因组DNA会慢慢断裂 。混匀动作要轻柔 既保证细菌沉淀在试 DNA 剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基 剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒 和染色体基 因组DNA 。 因组
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀， 见白色絮状沉淀，冰上放置3-5min。-中和溶液，此时质 中和溶液，
粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物， DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物， 复性 同时K+ SDSK+使 同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6.12000g离心10min取上清，加入等体积的苯酚/氯仿 /异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g10min。-抽提掉
操作步骤注意事项： 操作步骤注意事项
1。配置反应体系。 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 1ul 4种dNTP混合物 200umol/L 引物 各1～10pmol 模板DNA 10～200ng Taq DNA聚合酶 0.25u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 10ul 2。 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 50℃ 1分钟， 72℃ 1.5分钟， 共30轮循环。 3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。 4. 电泳结束，观察
试剂准备 ：
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡渗透压，调节PH值，有利悬浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 调节PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和离子 抑制DNase活性 高压灭菌15min ，贮存于4℃ 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解细菌，变性线性DNA 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并与SDS
作用沉淀
4.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）苯酚变性抽提蛋白，为
tris-base平衡酚。氯仿防止苯酚与水互溶。异戊醇的作用是降 低表面张力，可以减少泡沫
5.异丙醇，乙醇（无水乙醇、70%乙醇）沉淀质粒 6.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。 RNase A：10mg/ml
基本原理：
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互 补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤 构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使 之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板 DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度 降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③ 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下， 以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制 原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循 环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”， 而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～ 4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
反应参数要素： 反应参数要素
1。PCR反应五要素
（1）Taq酶：酶量：催化一典型的PCR反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特 异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。保真性： rTaq-1~2kbp,LaTaq-~20kbp,Pfu（Pyrobest）-. 吸取时注意，保存在甘油中故比较粘稠。 （2）dNTP的质量与浓度 ：在PCR反应中，一般反应 中每种dNTP的终浓度为20-200µmol/L 。4种dNTP的 浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同 于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。 （3）模板；模板可以是DNA片断，基因组，质粒， 噬菌体，菌液等任何含DNA生物样品。可以是单链分 子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状 分子 一般反应中的模板数量为102 -105 拷贝。模板纯 化程度影响扩增效率。
操作步骤及注意事项
1挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中， 于37℃振荡培养14～18 h。-培养时间不能太长，否则细 培养时间不能太长，
菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。 菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。
2取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心 12000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可 能流尽。 3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振 剧烈振 使菌体分散混匀。 荡，使菌体分散混匀 4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要 剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞 放置时间不能太长。 膜裂解,DNA变性。-放置时间不能太长。因为在碱性条件下
2。PCR反应条件的选择：温度、时间和循环次数
温度与时间： 变性温度：一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性 。太低解 链不完全，太高影响酶活。 退火(复性)温度与时间 ：退火温度影响PCR特异性的。太高不能 很好复性，太低会有非特异结合。提高退火温度可以提高特异 性。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度， 还有靶基序列的长度。选择合适的温度 ：Tm值(解链温 度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在此范围内进行优化。提高退火温度可以提高特异性。 复性时间一般为30～60sec 延伸温度与时间 ：一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃。 延伸速度一般1kb/min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的 出现。对低浓度模板的扩增，时间要稍长些。 循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决 于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环 次数越多，非特异性产物的量亦随之增多
实验室安全： 1。培养细菌的容器用过后都要及时进行灭菌，细菌培养基上清
不要随便丢弃，应存放在一起进行灭菌处理，以免污染环境。 2。吸取苯酚时应注意安全。苯酚腐蚀性很强。吸取氯仿 异戊 醇时要在通风橱中进行，氯仿 可引起神经系统功能紊乱要引起 肝脏损害 。异戊醇其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有 刺激作用 3。电泳时注意避免EB污染。
引物设计原则： 引物设计原则
1)引物长度约为18-30bp。 2)引物中G+C含量通常为40%-60%, G+C太少扩增效果不好，G+C过 多易出现非特异条带。GC含量决定引物的解链温度 Tm＝ 4(G+C)+2(A+T). 3)四种碱基应随机分布，在3‘端不存在连续3个G或C,因这样易 导致错配。 4）引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核 苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。 5)在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。 6)两引物之间尤其在3‘端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少 产量。 7)引物5‘端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶 位点，通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳 定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。 引物设计软件： Primer5.0, 6.0