关于猪卵母细胞孤雌激活技术概述

关于猪卵母细胞孤雌激活技术概述

摘要：孤雌激活随着近年来体细胞克隆技术的兴起而成为了又一研究热点，而猪由于其生理结构与人的相似性，所以其卵母细胞的孤雌激活更具有特别的研究价值，文章就孤雌激活的概念、机理、方法、影响因素等方面全面论述了猪卵母细胞孤雌激活的研究概况。

关键词：猪；卵母细胞；孤雌激活

孤雌生殖(parthenogenesis)作为一种生殖方式在无脊椎动物和低等脊椎动物中较为常见，在鱼类、两栖类、爬行类和鸟类等脊椎动物中也存在孤雌生殖的现象，但哺乳动物在自然状态下则未见有孤雌生殖现象。孤雌生殖的关键是提高卵母细胞的激活率，通过人工模拟自然条件下卵母细胞的自然激活机理(卵母细胞的自发激活和精子穿入引起卵母细的激活)创造更多更好的激活方法，从而进一步提高卵母细胞的孤雌激活率，一直是孤雌生殖研究的重点内容，具有重要的研究价值。一方面可把卵子活化的各个过程(如皮质反应、减数分裂的恢复和发育到第l次卵裂过程)分开来研究，对于阐明哺乳动物卵激活过程的信号偶联过程、细胞周期阻滞的恢复、受精机制和发育机理具有重要意义。另一方面，卵母细胞激活是细胞核移植和胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的关键环节，卵母细胞的激活率的高低直接关系到ICSl技术的效率，目前，卵母细胞激活率很低是核移植和胞质内单精子注射成功率低的重要原因之一。同时，由于猪的生理结构与人的诸多相似，被医学界认为是人类器官移植的最佳提供者，且猪的数量充足，妊娠周期短，产仔多，容易饲养，取材容易，充分满足临床需要，未来在生物医学方面有潜在的重要应用前景，这使猪的孤雌激活技术成为近年来的研究热点，这对于畜牧业和生物医学具有重大理论和实践意义。

1. 卵母细胞孤雌激活的概念

孤雌生殖是指无雄性配子的任何作用，由雌性配子产生个体的繁殖[1]。孤雌生殖的关键是提高卵母细胞的激活率，而卵子在自然条件下的激活是由精子穿入刺激引起的，即由于精子的进入启动M Ⅱ期卵母细胞继续发育，这一过程称为卵母细胞的激活。卵母细胞的激活分为3种，即为自发激活(常见于行孤雌生殖的动物和老化卵母细胞)、精子激活(自然条件下有性生殖动物的精卵结合)和人工激

活。通过人工模拟自然条件下卵母细胞的激活机理，在体外也可以通过各种理化刺激使处于MⅡ期的卵母细胞激活，即为卵母细胞的人工孤雌激活。

2. 卵母细胞孤雌激活的机理

自然条件下，受精引起卵母细胞激活后的主要事件包括细胞质内游离Ca2+浓度的升高、皮质颗粒胞吐和阻止多精受精、减数分裂的恢复和第二极体(PB2)释放、雌性染色体转化为雌原核、精子去致密转化为雄原核、雌雄原核内DNA 复制、雌雄原核在卵子中央部位相互靠近、核膜破裂及染色质混合等。钙离子振荡和钙波是激活过程的初始信号，随后引起包括皮质颗粒(CG)释放、细胞内pH 改变、母源mRNA的补充等一系列激活反应，最终导致原核形成、DNA合成起始和卵裂。卵母细胞MⅡ期的维持与高水平的成熟促进因子(MPF)活性有关[2]。MPF的活性是由对Ca2+非常敏感的细胞静止因子(CSF)来维持的，CSF的作用是抑制停滞于MⅡ期卵母细胞内的CyclinB的降解。卵母细胞受精或人工激活后，细胞内Ca2+浓度迅速增加，使CSF的活性消失，cyclinB被降解，从而引起MPF 的活性降低或消失，细胞离开M期，完成减数分裂并进行卵裂。不论是受精激活或人工激活MⅡ期卵母细胞都会发生的Ca2+顺时性升高，也就是说Ca2+的震荡引发的Ca2+是卵母细胞激活的特征性事件，由此通过相关信号转导路径并最终引发相关蛋白质的磷酸化和去磷酸化反应，从而启动发育。

3. 常见卵母细胞孤雌激活的方法

卵母细胞孤雌激活方法可归纳为物理刺激、化学刺激和物化联合处理3类。物理刺激包括机械刺激、温度刺激以及电刺激处理等；化学刺激包括酶刺激、离子载体处理、麻醉剂处理以及蛋白磷酸化抑制剂处理等；物化联合处理有电刺激联合A23187(Ca2+载体)；乙醇(EH)联合放线菌酮(CHX)、离子霉素(Ion)联合

6-DMAP(6-二甲氨基嘌呤)等。目前，电刺激是应用最广泛的卵母细胞激活方法，此外乙醇、钙离子载体、6-DMAP、CHX(放线菌酮)等也用于卵母细胞激活。对于猪卵母细胞的激活而言，有使用化学试剂激活卵母细胞的报道，但大多学者仍倾向于使用电激活，并认为电激活足以使猪卵母细胞充分激活。但是采用单纯电刺激激活的卵母细胞孤雌胚大多为单倍体，影响其发育。因此，为了提高孤雌激活胚胎的发育率，常常将电刺激与化学激活联合起来，使得孤雌激活胚胎为二倍体。

3.1 物理激活

物理激活方法中，机械刺激和温度刺激，因其操作繁琐，稳定性和重复性差，且孤雌激活率偏低，较少被人们采用。相对而言，电刺激激活方法因简便易行、稳定性、重复性较好，且集激活和融合为一体，而被广泛应用。其原理是卵母细胞在短暂高压直流电脉冲的作用下，膜的磷酸二酯双分子结构的稳定性发生改变，细胞膜上形成很多可恢复的微小孔洞．使细胞内外（介质)中Ca2+进入细胞，并使胞质内Ca2+浓度升高，从而引起卵母细胞的激活。电脉冲引起的微孔大小受电脉冲强度、脉冲宽度、电脉冲次数、电激液类型等条件的影响。Vitullo等[3]

提出，控制电脉冲参数，模拟出正常受精过程中Ca2+浓度节律性脉冲升高，可复制出正常受精过程中的一系列变化。据张德福等[4]报道，在猪卵母细胞激活过程中，进行一次电脉冲，其激活率和激活后孤雌胚发育效果均高于施以多次电脉冲刺激。Sin等[5]则发现通过培养液调节Ca2+浓度水平比通过改变电脉冲强度和持续时间更有效。吴中红等[6]通过用电激活得出其最佳场强和脉冲时程为

130V/mm，作用80us的情况下，其囊胚发育率为(20．12±8.18)％，而且发现多次脉冲并不比单次脉冲的激活效果好。李光鹏等[7]以体外成熟的猪卵母细胞为材料，以乙醇、电脉冲和氯化锶为人工刺激条件，研究了蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)对猪卵母细胞的孤雌激活效果的影响。结果表明，乙醇、电脉冲和SrCl2，均可使猪母细胞激活，而电脉冲的激活效果最好。当分别与CHX联合使用时，激活率显著高于单独的乙醇、电脉冲或SrCl2刺激。说明，CHX与乙醇、电脉冲及SrCl2，联合使用对猪IVM卵母细胞激活具有显著的协同促进作用。

3.2 化学激活

乙醇是发现较早的一种化学激活剂，其机理在于乙醇可以改变卵母细胞膜的稳定性，使钙库的Ca2+释放出来，同时增加细胞外Ca2+的渗入，从而胞质内Ca2+浓度升高引起卵子活化。乙醇对卵母细胞的激活主要是引起细胞膜IP3的形成，通过IP3受体介导Ca2+释放。目前经过大量的实验己经证实：乙醇激活卵母细胞一般采用了7％～8％的培养液作用5～7 min可取得较好的激活效果，长时间处理会降低激活率[8-9]。大量研究表明，单纯的乙醇刺激激活率较低，只有联合其他激活方法后，激活率才会有所提高。离子霉素(Ionmycin,Ion)近年来发现的一种高效Ca2+载体，已被广泛地应用于哺乳动物卵母细胞的激活中。Ion与钙离子载体