基因组测序ppt

基因组学
杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和
技术路线
将双链DNA样品变为单链 ↓ 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素 标记,以便显示DNA条带 ↓ 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的 降解DNA群体 ↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序
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化学法测序

优点：克隆片段可达10kb以上。
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PCR产生单链DNA
引物决定模板链的测序起点
Maxam-Gilbert化学降解法：
化学修饰DNA测序法，是美国哈佛大学的A.M.Maxam 和W.Gilbert于1977年发明的。化学降解法主要用于测 定短片段DNA的序列。
1980年诺贝尔奖金获得者F. Sanger
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Sanger 双脱氧链终止DNA 测序法的基本原理：
•聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分 长度只差一个核苷酸的DNA分子。 • 利用DNA聚合酶不能够区分 dNTP和ddNTP的特性，使 ddNTP参入到寡核苷酸链的3’末端。因为ddNTP 3’不是-OH， 不能与下一个核苷酸聚合延伸， 从而终止DNA链的增长。
Maxam-Gilbert化学降解法的原理： 用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，造成碱基 的特异性切割。由此产生的一组具有各种不同长度的 DNA链的反应混合物，经凝胶电泳和放射自显影后，直 接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。
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碱基特异的化学切割反应
技术路线与要求
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位臵读出基因序列
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在每一反应试管中，都加入 一种互不相同的ddNTP和 全部4种dNTP，其中 ddNTP带有32P同位素标记。 反应混合物样品加在聚丙烯 酰胺凝胶中，按片段大小进 行电泳分离。谱带的判读是 从胶的底部开始，所得的核 苷酸碱基顺序，与模板链为 互补链。
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§4 基因组测序
§4.1 基因组测序的方法 DNA测序的两种方法： 链终止法（the chain termination method）
单链DNA分子的序列由与之互补的多核苷酸链的酶促合 成来判定，互补链在某一特定的核苷酸位臵终止。
化学降解法（chemical degradation method）
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LI-COR 4300 DNA 遗传分析系统
LI-COR 4300 DNA 遗传分析系统单向测 序能力可达1.2kb， 测序准确率99%， 是目前测序长度最长、 准确性最高的测序仪。
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非常规DNA测序 光点测序（pyrosequencing) 又叫焦磷酸测序。链合成反应体系中没有ddNTP， 各种dNTP分别加入，当dNTP连接到DNA 3’-末 端时会释放1个焦磷酸(PPi) ,焦磷酸在磷酸化酶的 作用下转化为化学能,并发出光亮.由此,往反应液 中每次只加入1种核苷酸,当加入的核苷酸结合时, 反应液发出亮点,并记录核苷酸种类;当核苷酸未 结合时,反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸, 由此来测定DNA序列。
利用基因芯片进行杂交测序的原理
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第三代DNA测序技术新突破—— 单分子DNA纳米孔测序技术

来自美国华盛顿大学等处的研究人员利用纳 米生物学技术获得了新一代测序技术的突破， 这种新方法能为癌症、糖尿病或某些成瘾患 者量身绘制个性化基因测序蓝图，提供更加 高效的个体医疗。这一研究成果公布在 PNAS杂志上。
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自动化测序的改进 毛细管电泳DNA自动化测序
用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳，可
使DNA的测序速度更为迅速。这种电泳装臵有
96个泳道，每次可同时进行96次测序，每轮实验
不到2小时，1天可完成近千次反应。
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链终止反应要求单链作为模板 如何得到单链DNA ？

将DNA克隆到质粒载体 这种方法是获得测序模板DNA最常用的方法。 获得的DNA通过热变性或者碱变性转变为单链DNA进 行测序。

优点：可双向测序。

缺点：样品可能有少量细菌的DNA或者RNA污染，会
干扰测序。
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DNA 样 品 TATGCAATCTAG 与基因芯片上 65,000 种可能的 八聚体进行杂交从而形成特定 的结合图形 1 ATACGTTA CGTTAGAT 22 GTTAGATC
4 CGTTAGAT 4 ACGTTAGA 33 TACGTTAG ACGTTAGA 5 GTTAGATC 1 ATACGTTA 3 4 2 5 TACGTTAG ACGTTAGA CGTTAGAT GTTAGATC 计算机分析杂交图象 并由探针的重叠情况 推导样品的核酸序列 互补序列为：ATACGTTAGATC 样品序列为：TATGCAATCTAG
将DNA克隆到M13噬菌体载体

M13噬菌体载体是专 为得到单链DNA测序模板而设 计的。 M13噬菌体本来含有单链DNA基因组，感染大肠杆 菌的M13可转变为双链复制型。 M13噬菌体载体是 双链的，相当于M13噬菌体的复制型。 用含有待测序片段的M13噬菌体载体感染大肠杆菌， 大肠杆菌分泌的噬菌体就含有单链DNA基因组。 缺点：只能用于短片段DNA，大于3kb的片段在克隆 过程中会发生缺失和重排。
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领导这一研究的是华盛顿大学的Jens H.Gundlach，其它研 究人员包括：Ian Derrington, Tom Butler, Elizabeth Manrao 和Marcus Collins等人。 接二连三的个人基因组图谱绘制陆续完成，说明了第二代测 序技术的强大力量，但是第二代测序技术很快就遇上了强劲 的对手——第三代测序技术，也就是被称为下下一代的测序 （next-next-generation sequencing）的直接测序方法。这 一测序技术是基于纳米孔（nanopore）的单分子读取技术， 不同于之前的两代技术（需要荧光或者化学发光物质的协助 下, 通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链 上过程中释放出的光学信号而间接确定的），可以直接读取 序列信息，简洁快速。
化学修饰法的测序过程
（a）利用32P标记DNA片段的末端；
（b）将32P末端标记的DNA片段分成4个反 应管，进行化学切割反应；
（c）在聚丙烯酰胺测序胶上电泳，经放射 自显影，根据带谱可读出相应的序列。
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高通量自动化测序 DNA 序列分析自动化包括两个方面的内容，一 方面是指“分析反应”的自动化，另一方面是 指“读片过程”的自动化。 自动化的DNA 序列分析，也是根据Sanger 双脱 氧链终止DNA测序法的基本原理发展起来的。
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光 点 测 序 原 理 图 示
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杭州师范大学生命： 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播 的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位臵.待检测的 DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确 定位臵发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺 序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序. 缺点：每次测序的长度受寡核苷酸数目的限制。
可用双链DNA做模板；
模板用量少，不必克隆； 可实现高通量自动化。
由激光发射器产生的激 光束，通过精密的光学 系统后被导向凝胶表面 的检测区。在此，激光 束垂直射向凝胶，同经 过检测孔的DNA片段发 生作用，并提供能量激 发荧光发色基团发射出 具特异性波长的荧光。 这些荧光通过聚焦镜集 中后传给滤光镜/棱镜组 件，以便四种碱基产生 的不同标记波长区别开 来。经成像透像最后由 高灵敏度的相机分段收 集信号，传送给计算所 分析处理。
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第一代测序技术是双脱氧链末端终止法——根据核苷酸在某 一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A， T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的 PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。第二代测序 技术是焦磷酸测序法——由4种酶催化的同一反应体系中的 酶级联化学发光反应，适于对已知的短序列的测序分析。而 第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术，这种方 法读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的 前景。这一技术的研发是系统工程，涉及生物、半导体、计 算机、化学、光学等多个领域，需要不同学科顶尖力量的合 作。
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自动化测序原理
自动化测序类似于PCR反应，但只用 一条引物，反应混合物中含有不同荧 光标记的ddNTP与4种dNTP。由于 每种ddNTP带有各自特定的荧光颜 色,而简化为由1个泳道同时判读4种 碱基。产物条带经过检测仪时给出特 定信号，由计算机判读并记录。 优点 ：
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将DNA克隆到噬粒

这是一种改造过的质粒克隆载体，含有两个复制起点，