谷丙转氨酶活性的测定

实பைடு நூலகம்注意事项
1.在呈色反应中，2,4-二硝基苯肼与含有酮基的化合 物反应形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸可以与2,4二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。因此在 制备标准曲线的时候需要加入一定量的底物以抵 消α-酮戊二酸的影响。 2.严格按照实验步骤进行，温度和时间均要严格控 制。
A.取干净试管6支，编号后按照下表添加试剂。 B.将试管置于37℃水浴中保温10min，然后向每管中加入0.5ml2,4-二 硝基苯肼，再继续保温20min。 C.然后分别向各管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml，室温下静止10min。 D.用“0”号管作为空白对照，与520nm下测定吸收值。 E.以各管吸收值为纵坐标，丙酮酸的浓度为横坐标做标准曲线。
2,4-二硝基苯肼（ml） 二硝基苯肼（ ） 二硝基苯肼 GPT底物溶液（ml） 底物溶液（ ） 底物溶液 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
37 ℃水浴加热 水浴加热20min（丙酮酸与 二硝基苯肼反应） （丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应） 二硝基苯肼反应
0.4mol/L氢氧化钠溶液 氢氧化钠溶液 （ml） ） 5.00 5.00 5.00 5.00
谷丙转氨酶活性的测定
原
理
丙转氨酶（GPT）能催化丙氨酸和α-酮戊 二酸生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸在酸性 条件下与2，4－二硝基苯肼可缩合生成丙 酮酸二硝基苯腙，其在碱性条件下呈现棕 红色，在一定的浓度下，颜色的深浅符合 比尔定律，在520nm处有最大吸收。根据 颜色的深浅，通过比色法可计算出酶活性。
各管反应完成后混匀，室温静止10min后，以对照管1或者对照2调 节零点，测定1和2号管的吸收值。
实验数据计算
由标准曲线查出1号和2号反应管中的丙酮 酸的量，根据下面的公式计算GPT的活性。 GPT活力（单位）=反应管中丙酮酸的量（mM）
0.5小时×0.25ml
GPT活力单位的定义：单位时间（每小时）内，单位体积（每ml）的酶反应 生成的产物的量（mM）。
实验方法
2.GPT活性的测定：取干净试管4支，按照下表添加试剂。
试剂 鱼肌肉匀浆液（ ） 鱼肌肉匀浆液（ml） GPT底物溶液（ml） 底物溶液（ ） 底物溶液 测定1 测定 0.25 0.50 对照1 对照 0.25 测定2 测定 0.25 0.50 对照2 对照 0.25
37 ℃水浴加热 水浴加热30min（转氨基反应） （转氨基反应）
应
用
GPT在肝脏中含量最多，当某种药物对肝脏 早晨损害或病毒肝炎的急性阶段，由于肝细 胞受损，GPT就释放到血液中，使血清中此 酶水平明显升高。因此测定血清谷丙转氨酶 的活性可作为诊断肝病的重要指标。
实验方法
1.标准曲线的制备
0 2mM丙酮酸标准溶液 0.00 丙酮酸标准溶液 （ml） ） 磷酸缓冲液（ ） 磷酸缓冲液（ml） 0.25 GPT底物溶液（ml） 0.50 底物溶液（ ） 底物溶液 1 0.05 0.20 0.50 2 0.10 0.15 0.50 3 0.15 0.10 0.50 4 0.20 0.05 0.50 5 0.25 0.00 0.50