课用双向电泳技术

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2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类
3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的影响因素
① 溶液中SDS单体的浓度
② 二硫键是否完全还原 ③ 缓冲系统的选择
④ 凝胶浓度的选择
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凝胶电泳的操作要点
1.凝胶制备 2.电极缓冲液 3.样品处理及加样 4.电泳 5.染色与固定 6.脱色 7.分析
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第四节 双向电泳
其中R代表羧基或第三氨基。分子一端的双键可以在聚合过程中共价键合 镶嵌到聚丙烯酰胺介质中。所以它是固相的，即使是在电场中也不会漂移 。分子另一端的R基团为弱酸或弱碱性的缓冲基团，利用缓冲体系滴定终 点附近一段pH范围就可形成近似线性的分布在pH3～10范围的缓冲体系。 所以固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的区别在于前者的分子不是 两性分子，在凝胶聚合时候便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改 变，后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成pH梯度。
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一、基本原理
1、蛋白质的等电点：取决于其氨基酸的组成。
组成每一种蛋白质或多肽的氨基酸的数目和比例是 不同的，故蛋白质的等电点范围很宽，这使得可以利用 它来分离和分析蛋白质。
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2、聚焦效应
3、等电聚焦的分辨率
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二、载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳
1、载体两性电解质应具备的条件
① 在等电点处有足够的缓冲能力，以便能控制pH梯度，而 不致被样品的缓冲能力而改变pH梯度。 ② 在等电点处有足够高的电导，以便使一定的电流通过， 具备不同pH的载体有相同的电导系数，是整个体系中的 电导均匀。 ③ 分子质量小，便于与被分离的高分子物质分离。 ④ 化学组成不同于被分离物质，不干扰测定。 ⑤ 应不与分离物质反应或使之变性。
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从上式看出，带电颗粒的泳动速度同电场强度E和分子本身所 带的净电荷量Q成正比，与颗粒半径r和介质黏度η成反比。 蛋白质是一种两性电解质。其泳动速度取决于蛋白质 分子所带电荷的性质、数量以及颗粒的大小和形状。
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二、影响电泳速度的因素
1、电场强度；2、缓冲溶液的pH；3、缓冲溶液的离子强度；4、 电渗；5、焦耳热
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3、固相pH梯度等电聚焦原理
蛋白质分子按照自己的pI位臵在固相pH梯度中迁移， 知道达到自己的等电点，停止迁移。
4、固相pH梯度的优点和注意事项
固相pH梯度可窄至pH0.1的范围，因此分辨率极高，可 达0.001pH；pH梯度稳定，不漂移；灵活性大，可随意选 择pH梯度和斜率；重复性好；加样容量大；样品中盐的干 扰小；对碱性蛋白质也能很好的分离，无边缘效应，故可 用很窄的胶条（如5mm宽）聚焦，特别适合于双向电泳的 第一相，但固相 pH梯度灌胶技术复杂，只能使用聚丙烯 酰胺凝胶，电泳时候需要高电压，电泳时间长，窄范围pH 测定困难，只能计算。 注意事项：温度：20-30℃ ；电压：梯度上升。
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利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，
在一个稳定的、连续的、线性的（或非线性）pH梯度 中进行蛋白质的分离和分析。分析对象只限于蛋白质 和其他两性分子。 根据建立pH梯度原理不同，可分为载体两性电解
质pH梯度（carrier ampholyte pH gradient)和固
相pH梯度(immobilized pH gradient, IPG)。
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1809年俄国物理学家Peйce首次发现电泳现 象。 *1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中 的移动称为电泳。 他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶 和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。
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*1937年瑞典乌普萨拉 （Uppsala）大学的Tiselius对电泳仪器作了 改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方 法，并首次证明了血清是由白蛋白及 α、β、γ球蛋白组成的，由于 Tiselius 在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了 1948 年的诺贝 5 尔化学奖
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5、等电聚焦中应注意的事项
三、固相pH梯度等电聚焦电泳技术
固相pH梯度等电聚焦是80年代建立起来的一种等电 聚焦技术。固相pH梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更 高的分辨率，更大的上样量，其分辨率可达到0.001pH， 是目前分辨率最高的电泳方法之一。
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1、固相pH梯度的介质
其所用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺 衍生物，它们与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有相似的聚合 行为。
70年代以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染 胶三大环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。 各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领 域。
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第一节 蛋白质电泳的基本原理
一、电泳的基本原理
1 、电泳是在电场作用下产生的物质运动，不同 的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不 同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速 度不同进而达到分离目的，称为电泳 （electrophoresis)。
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③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一 层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用， 但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大， 很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦， 分辨率低，实验室中已很少使用。 ④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔 径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及 检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。
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3、载体两性电解质分离原理
等电聚焦样品可放于任何位臵。
4、载体两性电解质的缺点
① ② ③ ④ ① ② ③ ④ ⑤ 载体两性电解质合成过程复杂，影响蛋白质点的位臵，从而影响 了重复性； 负极漂移现象，使pH梯度不稳定； 负极漂移现象使碱性蛋白质无法聚焦； 凝胶灌制重复性差，凝胶机械稳定性差，影响重复性。 pH梯度的选择； 添加中性载体两性电解质； 电流降到最小切恒定时尽快结束IEF; pH梯度测定：电泳结束后，用微电机检测凝胶表面pH; 蛋白质在pI处形成沉淀。添加表面活性剂。
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浓缩效应
连续电泳 不连续电泳
凝胶层 缓冲液离子成分 pH 电位梯度
浓缩效应 电荷效应 分子筛效应
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2、影响凝胶聚合的因素
① 形成凝胶试剂的纯度 ② 凝胶浓度 ③ 温度和氧气的影响：23-25℃
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点
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二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
1、基本原理 ① 聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulphate)SDS，蛋白电泳迁移率取决于其分子量， 而与形状及所带电荷无关。 ② 加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白的二硫键还原， SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成蛋白SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定， 长轴长度正比于蛋白分子量。 ③ 分离测定： ④ 测分子量(与标准蛋白比较) ⑤ 鉴定样品纯度(条带数目) ⑥ 测定样品蛋白含量：扫描定量(比色)
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2、固相pH梯度的建立
固相pH梯度等电聚焦技术的突破要归功于Immobilines试剂 （Amersham Pharmacia Biotech, APB）的基础上开发的固相pH梯度（IPG） 技术。Immobilines（固相试剂）是一系列性质稳定的具有弱酸弱碱性质 的丙烯酰胺衍生物，与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有类的聚合行为。每个 分子都有一个单一的酸性或碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连，其结构式为：
PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物 分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测 定分子量、等电点等。
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1、丙烯酰胺凝胶有以下优点：
①几乎无电渗作用。
②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH和温度 变化较稳定。 •在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，机械性能好， 易观察。
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第二节 蛋白质等电聚焦电泳
1966年，瑞典科学家Rible和Vesterberg建立。 等电聚焦：isoelectric focusing,IEF。 1.电泳系统中加进两性电解质载体，当通直流电时，两性电 解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。蛋 白进入时，不同的蛋白移动到与其等电点相当的pH位臵上， 从而使不同等电点的蛋白得以分离。 2.优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性 好，可测定蛋白或多肽的等电点。 3.缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性 的蛋白。
一、基本原理
IEF-SDS-PAGE
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双向电泳的分类
非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的 等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的； 非变性 /SDS-2D-PAGE ：第一向采用非变性 IEF，之后在 2%SDS溶液中平 衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白 －蛋白间的相互作用。 非变性 /还原/SDS-2D-PAGE ：非变性条件下 IEF聚焦，之后用 8M尿素＋ 5%β-ME＋2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS-PAG电泳。此时分离的蛋 白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、 MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供 关于断裂二硫键连接的多肽的信息。 变性 2D-PAGE ：样品先用 2%SDS ＋ 5%β-ME ＋ 95℃变性 5min， IEF 在 8M 尿 素＋1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS＋5%β-ME平衡，然后进行 SDS-PAGE。该技术适于DNA序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连 接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大 于100Kd的蛋白质点少于第三种方式
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另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分 为：薄层电泳、板电泳、柱电泳。������ 根据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定 量电泳、免疫电泳。 按pH的连续性不同，可分为：连续pH电泳，不连 续pH电泳。