老年性痴呆动物模型

老年性痴呆（AD）动物模型的制作
一、简介
二、前言
1. AD的病理和症状
2. AD的分子标志和危险因子
三、AD动物模型的分类
1. 前脑胆碱能系统损害模型
2. 自然衰老认知障碍模型
3. 转基因动物模型
4. 其它损害造成的AD模型
四、AD动物模型的制作
1. 穹窿-海马伞切断模型
2. IBO损害模型
3. 免疫毒素选择性损害模型
4. 老年认知障碍鼠模型
5. 长期脑供血不足痴呆模型
6. Okadaic酸损害模型
7. App转基因动物模型
五、AD动物模型的应用
六、参考文献
一、简介
本节介绍Alzheimer’s型老年痴呆（AD）的动物模型的制作，首先介绍AD的病理特征和模型的制作原理，然后着重介绍三类AD模型的制作方法。

前脑胆碱能系统损害模型是用机械的、化学的或免疫的方式损害前脑胆碱能系统，造成动物前脑胆碱能系统病变和相关的认知缺失；自然衰老认知障碍模型是用行为筛选的方式，将老年灵长类或鼠类认知能力下降较严重的个体选择出来，它们通常表现出较为严重的脑老化的病理特征；转基因动物模型是用实验方法将外源性App 基因（野生或突变型）导入，使动物过多地表达App基因或突变产物，引起中枢神经系统的Aβ
的沉积和相关病理损害或临床症状。

二、前言
老年性痴呆是导致老年人生活质量低下和死亡的主要疾病，其中以Alzheimer’s型老年性痴呆（Alzheimer’s disease, AD）最为常见。

AD是一种中枢神经系统退变性疾病，65岁以上人口发病率约5～10%，其主要症状为记忆力减退，认知能力低下和思维迟钝，且进行性加重，最后生活不能自理而死亡，病程一般8～10年。

随着人口老年化趋势的加重，AD困扰着许多老年人，带来了严重的社会、经济和家庭问题。

因此，积极研究AD的发病机制和寻找有效的治疗方法是临床和基础医学面临的急迫课题。

但由于AD的病理学机制尚不清楚，要研究其发病机制和试验新的治疗方法，一个重要的突破口是制作AD的动物模型，即在动物上模拟AD的病理改变和临床症状。

制作AD动物模型的前提是对AD的病理和行为变化的充分认识。

(一) AD的病理改变
AD的主要病理学改变是患者脑组织出现大量神经纤维缠结（Neurofibrillary Tangles，NFT）、老年斑（Senile plaque），突触和神经元丢失。

NFT是出现在易感神经元胞体和突起内的丝状物，可以通过镀银染色或免疫组化的方法将其显示。

电子显微镜下NFT是由配对缠绕的螺旋丝或15nm的直丝所组成。

老年斑是神经细胞外的斑块状沉积，它同样可以通过镀银或免疫组化方法显示。

NFT和老年斑在正常老年人脑组织也可出现，但在AD患者脑内其数量显著增多。

它们主要沉积在额、颞叶皮质、海马、杏仁等脑区。

累及上述脑的易感神经元，使其功能丧失或死亡。

例如基底前脑胆碱能神经元、新皮质和海马的投射神经元丢失，导致靶的突触输入的减少和失支配，这些病理改变构成了AD认知障碍和记忆减退的神经基础[1-4]。

(二) AD的分子标志和危险因子
近年来，随着分子生物学技术的渗入，对AD发病的分子机制的认识有了长足的进步，其中最突出的成就是发现了AD有关的二大分子标志物：Tau蛋白和β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）。

Tau是组成细胞骨架的微管相关蛋白（Microtubule associating protein）之一，由于某种原因引起Tau的异常磷酸化，使其从微管上解离，从面导致细胞骨架解聚，干扰了神经细胞功能，进而使受累神经元死亡。

而过磷酸化的Tau本身相互缠绕形成了NFT[5]；Aβ是一个由39～43个氨基酸组成的多肽，它来自于含695～770个氨基酸的前体蛋白（Amyloid procursor-like protein，App）。

业已发现，Aβ沉积和老年斑形成有着密切的关系，Aβ是老年斑的主要成份之一。

用A β的抗体免疫组化方法可显示老年斑。

App基因定位于第21号染色体，在一些早发的家族性AD 的患者其App基因突变已被证实[6-8]。

除上述两种分子物质与AD发病有着密切联系外，与AD发病有关的其它危险因子，主要有年龄、遗传和载脂蛋白E4（Apolipoprotein E4，ApoE4）。

年龄因素是指AD的发病年龄通常在60岁以上，且随着年龄的增大发病率增加；遗传因素是指约20～30%的AD患者有家族遗传性，其中的一部份已发现了基因的改变。

ApoE4是存在于血浆和脑脊液的脂蛋白成份之一，由人类19号染色体长臂上ApoE4基因位点上多个等位基因（ε4、ε3、ε2）所编码。

最近的研究发现AD 患者ε4等位基因频率比对照组显著增高，且AD的病变程度与ε4的等位基因频数有关。

这些资料表明ApoE等位基因的多形性与AD的发病有着密切的联系[9]。

三、AD动物模型的分类和制作原理
AD动物模型是在实验动物身上模拟AD患者脑组织的病理变化和行为异常，这是研究AD 发病机制的重要手段，也可为试验和判断治疗AD的药物和疗法提供试验对象。

尽管完全理想的AD动物模型目前尚不存在，但随着神经生物学和分子生物学的进步，许多种AD动物模型相继被制作，并在研究中得到广泛的应用，这些模型为理解AD的病理机制和试验新的药物发挥了重要作用。

现有的AD动物模型是根据不同实验目的所设计的，大多是只能模拟AD的某些病变或症状，根据其制作方法和作用机制，AD动物模型可分为如下几种（表1）：
（一）前脑胆碱能系统损害模型
该模型是建立在“AD认知障碍的胆碱能假说“的基础上，已知基底前脑的胆碱能细胞发出轴突广泛地投射到新皮质和海马等高级脑区，这一投射与学习记忆和认知功能有着密切的联系。

在任何一个环节阻断或损坏这一投射系统都可导致动物认知障碍和学习记忆能力的损害（图1）。

病理检查发现AD患者基底前脑的胆碱能细胞出现严重溃变，其细胞丢失的程度和患者的认知能力成负相关关系[10]。

因此，这一类AD模型主要着眼于模拟AD的认知缺失和前脑胆碱能系统损害。

根据损害方式的不同，这一类模型又可分为穹窿-海马伞损伤模型、Ibotenic酸损害基底前脑细胞模型以及基底前脑胆碱能细胞免疫切除模型（表1）。

图 1
图1 基底前脑胆碱能投射损害示意图
A. 切断穹窿的切点；
B. 损毁内侧隔核；MS. 内侧隔核；HP. 海马；C
C. 胼胝体；FF. 穹窿海马伞
（二）自然衰老认知障碍AD动物模型
AD是一个年龄相关的疾病，衰老因素在AD发病过程中扮演着重要角色，衰老所特有的病理生理变化及其它病变的影响，是用年轻动物制作的动物模型所不能替代的。

近年来比较流行的模型之一是用老年的灵长类（弥猴、恒猴、罗猴）或鼠类，通过行为筛选的方式，选择带有认知和记忆严重缺失的个体，它们的行为损害与老年人和AD患者的认知损害相类似，同时还可出现某些相应的脑组织病理改变[11]。

（三）转基因动物模型
转基因AD动物模型是建立在App基因突变导致Aβ沉积是AD病理改变的中心环节的学说的基础上。

用实验的方法将外源性App基因（野生或突变型）导入，使其在染色体基因组中稳定整合、表达，并遗传给后代。

动物过多地表达App基因或其突变基因产物，引起Aβ的沉积和相关的病理损害或临床症状。

转基因的方法能够直接试验是否野生型或突变型的App，或者Aβ包含片段的过度表达是AD的病因，近年来这一领域的研究非常活跃[11]。

（四）其它损害造成的AD动物模型
其它AD动物模型尚有老年动物慢性脑缺血痴呆模型、Okadaic acid（OA）损害模型、铝中毒模型和β-半乳糖损害模型。

慢性缺血痴呆模型是通过结扎老年大鼠的双侧颈总动脉和一侧椎动脉或者一侧锁骨下动脉，造成老年脑的长期供血不足和相应的脑损害，这些脑损害与AD的临床表现和病理改变有一定相似性[12]；OA损害模型是利用OA对丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸化酶（1A 和2A）的特异性抑制作用，以及它对蛋白激酶C（PKC）的激活作用。

1A和2A抑制可以使Tau 蛋白过磷酸化，导致NFT的形成。

同时，PKC激活，1A和2A的活性抑制，可剌激Aβ产生，进而引起Aβ的沉积和老年斑的形成[13]。

表1 老年性痴呆动物模型的分类和制作原理
──────────────────────────────────────类型方式原理
──────────────────────────────────────
前脑胆碱能系统损害模型
穹窿－海马伞切断模型机械离断损伤隔-海马胆碱能投射
IBO损害模型IBO脑内注射损毁基底前脑神经元胞体
免疫毒素损害型脑室投递选择性损毁基底前脑的胆碱能
细胞
自然衰老认知障碍模型迷宫筛选从衰老鼠中筛选出有学习记忆
损害的个体
慢性脑缺血痴呆模型结扎脑供血动物脑长期供血不足，造成认知缺失
和病理损害
OA损害模型脑室投递OA 抑制蛋白磷酸化酶1A和2A
剌激PKC的活性
转基因动物模型App基因转染App／Aβ蛋白过渡表达
───────────────────────────────────────
四、AD动物模型的制作方法
（－）。

穹窿海马伞损害模型[14,15]
1．实验动物：用雄性大白鼠（SD或Wistar鼠种），3～5个月龄，体重250～300克。

2. 材料和试剂：脑立体定位仪，特制刀片，注射器，开颅钻。

3. 操作程序：动物经腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，固定于脑立体定位仪上，颅顶区被皮常规消毒手术区皮肤，无菌下操作，沿颅顶中线作长2cm切口，用湿棉球分离骨膜。

于前囟后2.0mm，中线旁1mm处，用牙科钻或自制颅钻打开颅骨，仔细切开硬脑膜，暴露大脑皮质，用特制的宽2mm双刃刀片（剃须刀片制作）按照脑立体定位仪图谱（Paxinos G and Watson C），于前囟后2mm，中线左侧1mm处置刀于脑表面，然后操作定位仪降刀
4.1mm，并向外向内各移动1mm和0.5mm。

然后再降刀1mm，外移1.5mm，此时上下抽动刀片数次，依次切断胼胝体缘、扣带回、背侧穹窿-海马伞（图1，右侧）。

留刀三分钟后退出刀片。

手术中要避免损伤上矢状窦，并观察有否出血现象，关闭头皮。

另一种损害方法是分离和移除一部分大脑皮质，直接暴露穹窿，直视下切断穹窿或移除一段（1mm长）穹窿。

动物存活1周至2周，灌注杀死动物，取基底前脑组织切片，用胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫组化方法验证，损伤同侧内侧隔核胆碱能神经元较对照侧减少50～60%左右，斜角带垂直支约减少40%。

同时，损伤侧海马内胆碱能纤维（AchE 染色）明显减少。

迷宫测试显示该模型鼠的获取能力和记忆能力匀较对照组明显降低。

（二）鹅膏蕈氨酸（Ibotenic acid, IBO）损害模型
IBO是一种谷氨酸受体激动剂，具有强烈的神经兴奋毒性作用，通过与神经元胞体或树突上的NMDA受体相结合导致神经元中毒性损伤而溃变。

基于基底前脑神经元丢失在衰老和AD有关的认知缺失中的重要作用，以谷氨酸类似物微量注射到基底前脑导致其神经元溃变和认知缺陷，在大鼠和猴都已被模拟了。

制作AD模型最常用的谷氨酸类似物主要有海仁酸（Kainic acid，
KA）、IBO和使君子氨酸（quisqualic，QUIS）。

其中以IBO最为首选，尽管IBO和QUIS都能造成基底前脑胆碱能神经元溃变，但只有IBO能恒定地损害动物与学习记忆有关的行为执行。

基底前脑细胞对KA的敏感性较低，故用量较大，易引起动物死亡，并往往在导致基底胆脑细胞损害的同时引起其它部位神经元（如海马锥体细胞）的死亡[16,17]。

1. 实验动物：以SD、Wistar或Long-Evant等纯种大鼠皆可，鼠龄以3～5个月或18～22个月为宜，体重300克左右。

2. 材料和试剂：脑立体定位仪，微量注射器，Ibotenic acid。

3. 操作程序：动物经戊巴比妥钠（40mg／kg）腹腔麻醉后，固定于脑立体定位仪，头皮被皮，切口和开颅同前，参照立体定位坐标，耳杆＋0.2，中线外0.3，颅骨下7.0推进微注射针，每点注射IBO 0.5μl（0.05M），注射时间持续2～3min，留针5min，以防扩散，缓慢退针后缝合头皮，动物存活一周后以相同座标行对侧损害注射。

对照组取同样座标，但深度座标减1mm，进针后不注射任何物质。

(三) 自然衰老认知障碍鼠模型──行为筛选
1. 自然衰老认知障碍大鼠[18,19]
（1）实验动物：鼠的平均寿命在30个月左右，通常大鼠24个月，小鼠18～20个月以上视为老年鼠，选择22～24个月纯种同性大鼠50只左右，雌雄皆可，3～6个月青年鼠为对照，15只左右。

正常光暗周期饲养。

（2）行为检测工具：Morris水迷宫装置如图2。

Morris水迷宫主要由水池和记录系统两大部分组成。

水池直径130cm，高50cm，池内水深30cm，水温保持在24±2℃，水面覆盖一层直径0.5cm大小塑料泡沫颗粒。

水池放置在房间的中央。

池壁上依次标上N、E、S、W字母，将水池分为四个象限，任选一象限放置平台（平台与圆心和池壁等距）。

平台由透明有机玻璃制作，圆形，直径10 cm，高28 cm，没于水下2 cm，记录系统包括摄象机、监视器和录像系统，摄像机装在水池上方3米处，小录音机提供固定的背景音乐，减少噪音干扰。

图 2
图2 Morris水迷宫示意图
（3）行为测试
①定位航行试验（Place navigation）：试验前一天将大鼠放入水池（不含平台）自由游泳2分钟，让其熟悉迷宫环境及游泳，试验共历时5天，每天分上、下午两时间段。

训练开始时，将平
台置于一个固定的象限，每个时间段分别从池壁四个起始点将大鼠面向池壁放入水池，记录每次找到平台的时间（逃壁潜伏期，escape latency）和游泳路径。

如大鼠在120秒内找不到平台，由实验者将其引上平台，潜伏期记为120秒，每次间隔4分钟让大鼠休息，再行下次试验。

②空间探索试验（Spatial probe test）：第5天上午时间段撤除平台将大鼠从任选的非平台象限入水点面向池壁放入水中，记录2分钟内大鼠在池中的游泳路径。

然后，分析大鼠在平台象限游泳路径长度占总路径长度的百分比。

以年青组大鼠平均逃避潜伏期均数＋2倍标准差值为下限，＋1倍标准差值为上限，将老年大鼠化为二组。

平均逃避潜伏期大于均数＋2倍标准差的为老年痴呆组，小于均数＋1倍标准差为老年正常组。

潜伏期介于上下限之间的老年鼠因不能确定它们的组属，为避免混淆，从实验中剔除（图3）。

图 3
图3 行为筛选统计学分组示意图
每一个点代表一只鼠的平均逃避潜伏期。

上虚线代表青年组平均潜伏期＋2倍标准差，下虚线为青年组平均潜伏期＋1倍标准差。

上虚线以上的鼠为老年痴呆鼠，下虚线以下的鼠为老年正常鼠。

2. 衰老的非人灵长类（猴）
灵长类在神经生理、结构和行为上最为接近人类，用非人灵长类制作AD模型，猴是较为适宜的[20]。

罗猴的平均寿命是35岁，行为学研究表明10岁以上罗猴即开始出现认知和记忆能力的减退，到15～20岁时上述认知和记忆的缺失变得更为明显，与衰老的人类和AD患者的认知障碍相类似。

病理学分析表明大于20岁的老年猴脑组织出现Aβ淀粉样沉淀、溃变的神经轴突和特异性神经递质紊乱，如Ach和去甲肾上腺素的减少。

这些改变通常较衰老的人类和AD患者要轻，但有较大的个体差异。

就个体而言其认知能力损害的程度与其病变程度呈相关关系。

因此，用行为检查的方式筛选出带有认知损害的老年猴子作为AD模型有其特有的优势。

但用20岁以上猴子为实验对象，其来源、经济成本和实验周期长等因素限制了该模型的应用。

（四）免疫毒素切除基底前脑胆碱能细胞模型
免疫毒素（immunotoxin）192-IgG-SAP能够选择性地破坏基底前脑的胆碱能细胞，而留下基底前脑的其它化学属性的细胞成份，如GABA、P物质和丙苷肽等阳性神经元。

192-IgG-SAP是由抗大白鼠的低亲和神经营养因子受体（p75）的抗体Mab（192-IgG）与Saporin相结合而成，SAP是一种来自植物种子（Saponaria officinalis）的核糖体失活蛋白。

192-IgG能够被BF胆碱能
神经元选择性的摄取，进入细胞后Saporin逃漏出细胞的内化池，通过破坏蛋白合成酶系统杀死胆碱能细胞[21,22]。

1. 实验动物：选用纯种SD、Wistar或Long-Evants大鼠均可，体重250～300克。

2. 材料和试剂：脑立体定位仪，微量注射器，免疫毒素，192-IgG-SAP，商品代号是MAB390（chemicon communications）。

使用前溶解在pH7.4的PBS，贮存-70℃冰箱备用。

3. 操作程序：腹腔注射戊巴比妥钠（40mg／kg）麻醉后，固定于脑立体定位仪上，门齿线在耳杆水平下3.3mm，行双侧侧脑室注射192-IgG-SAP，每侧100ng，1μl，脑室注射座标为：前囟-0.3，旁1.3，深3.6。

也可直接行内侧隔核内注射10ng／0.03μl。

注射时间持续2min，留针5分钟。

5～7天后杀死动物，制作基底前脑切片，用胆碱乙酰转移酶免疫组化方法显示胆碱能神经元破坏情况。

图4显示脑室投递MAB390后第五天，内侧隔核ChAT的染色情况。

A.腹腔注射MAB390内侧隔核胆碱能细胞完好。

B.脑室注射MAB390后第5天内侧隔核ChAT阳性细胞绝大多数丢失。

行为测试显示经192-IgG-SAP处理的大鼠学习记忆能力受到明显损害。

图 4
图4 脑室注射免疫毒素后内侧隔核胆碱能细胞ChAT免疫组化染色
A.对照组；
B.MAB390注射后第5天胆碱能细胞消失
（五）Okadaic acid慢性损害AD模型
Okadaic acid（OA）是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸化酶（1A和2A）的特异性抑制剂，OA 的长期脑室投递可引起动物的记忆严重缺失，同时导致脑内Aβ淀粉样沉积斑块形成以及NFT 样磷酸化Tau蛋白出现。

投递装置用ALZA公司的ALZET微渗透泵（Model 2004），使用前充填OA溶液。

1. 实验动物：用SD或Wistar大鼠，体重250～300克。

2. 材料和试剂：脑立体定位仪，微量注射器，颅钻。

OA选用Sigma公司产品，产品编号是0-1506，以pH7.4的磷酸缓冲的人工脑脊液配制，置4℃冰箱备用。

3. 操作程序：动物麻醉后固定于脑立体定位仪。

参照脑立体定位图谱的侧脑室座标，颅骨钻孔，装置微渗透泵的投递针，使针管头端置于侧脑室，用牙科水泥将其柄部固定在颅骨上，泵体埋在动物项部皮下，输送管经头皮下传送。

平均投递速度0.25±0.02μl／小时，通常一次埋泵可维持4周，如需要长时间的投递，更换一次新充填的微渗透泵即可。

2～3周后进行行为试验，动物将出现工作记忆和参考记忆的损害。

术后6周免疫组化分析可见经OA处理的大鼠脑的纹状体、
海马和皮质等部位出现高磷酸化Tau蛋白免疫阳性神经元、App免疫阳性星形胶质细胞和Aβ淀粉样蛋白免疫阳性斑块[13]。

（六）慢性缺血痴呆模型
脑的供血不足可以导致脑损伤和一系列的临床症状，加拿大学者Torre报告用老年动物慢性脑缺血模型引起的行为缺失和脑组织病理生理改变在许多方面与人类的老年期痴呆包括AD相类似[12]。

1. 实验动物：用14～16个月雄性SD或Wistar大鼠。

2. 材料和试剂：脑立体定位仪，手术显微镜，单极或双极电凝器，显微手术器械。

3. 操作程序：大鼠经戊巴比妥钠腹腔麻醉（40mg／kg），固定于脑立体定位仪。

硅胶管或橡皮栓扎鼠尾轻轻牵引，使颈椎伸展，翼孔呈水平位，便于观察。

消毒头皮后，枕骨下第一颈椎水平正中切口，仔细分离一侧第一颈椎横突，暴露第一颈椎横突翼孔，翼孔下有椎动脉通过。

用小的单极或双极电凝器插入翼孔烧灼闭塞一侧椎动脉。

然后，动物取背位，取颈部正中切口，分离颈总动脉，注意避免损伤迷走神经和鞘后方的颈交感干。

结扎和切断一侧的颈总动脉，用外科缝线套住另一侧颈总动脉（不结扎），将线头藏于皮下，简单关闭切口。

待动物麻醉清醒后送回饲养笼，自由饮水，但禁食。

12～24小时后，将动物于清醒状态下取背位，分别用绳子固定四肢和门齿，以控制动物挣扎。

小心分离颈前部的切口，辩认套在未结扎侧颈总动脉上的缝线，轻轻牵起，结扎和切断该侧的颈总动脉，缝合皮肤切口。

对照组动物经历同样的手术程序和血管暴露，但未行椎动脉烧灼和颈总动脉结扎。

术后动物存活10～12周，此时皮质和海马的脑血流分别较对照组减少20%和60%。

Morris 水迷宫测试显示空间记忆能力缺失明显，组织学检查证实，海马神经元丢失，胶质纤维酸性蛋白免疫反应增强，以CA1区最明显。

虽然经历了慢性缺血，但受缺血动物脑内并未发现梗塞灶。

（七）转基因动物模型
转基因动物的制作是一个复杂的专门技术，本节不能将其技术全面介绍。

鉴于各种转基因的制作的基本程序相似，详细细节请参阅有关文献[23]。

AD转基因的动物模型近年来的进展非常迅速，各种AD转基因模型不断被报道。

现有的模型大多数是将不同结构的App基因转移到受精卵，但真正理想的转基因模型尚不多见。

Games D等（1995）报道了App突变体（Val717-Phe）转基因小鼠，显示了老年斑、Aβ沉积等AD的病理改变，该模型认知能力尚不清楚。

转基因鼠（JU）表达人野生型App751，显示了空间记忆的损害，但只有4%的转基因鼠饲养到12个月以上才展示了Aβ的沉积，且Aβ沉积的量很少，不能被刚果红染色[24]。

最近Hsiao K等报道用人的App595基因进行转染，该App595是来自瑞士一个家庭性AD，含有双突变点（lys970-Asn，Met671-Leu）。

将突变基因的DNA插入到金黄地鼠的prion蛋白（hamster prion protein，PrP）质粒载体，其PrP 开放读码框架（ORF）被改变的App ORF所替代，结果TG+（HuAPP695、K670N-M671L）2576鼠饲养到14个月时出现了空间学习和记忆的损害，同时Aβ（1-40）表达量较Tg-鼠高出4倍，大量Aβ阳性斑在脑组织内沉积。

提示这一转基因AD模型在很大的程度上模拟了AD的临床症状和病理改变[25]。

转基因动物制作的简单程序如下：
①引物设计App或Aβ区段的靶基因的制备
②重组靶基因显微注射小鼠受精卵
a. 对C57BL／6雌鼠（供体）腹腔注射孕马血清，诱发卵巢滤泡发育；
b. 48小时后注射HCG，然后与雄鼠交配，使之超数排卵；
c. 翌晨观察雌鼠阴道栓形成，从见栓雌鼠输卵管回收原核受精卵；
d. 向受精卵雄原核内显微注射入线性化的App或Aβ区段的靶基因；
e. 体外培养转基因的受精卵至晚期桑椹胚。

③转基因桑椹胚移植入假孕受体
a. 结扎雄性小鼠的输精管后使之多次交配，令残存精子排尽并经检测精液证实无活精
子存在；
b. 在供体C57BL／6雌鼠配种后一天，用结扎雄鼠与昆明雌鼠交配，见阴道栓形成的
雌鼠留作假孕受体之用；
c. 将体外培养的转基因桑椹胚植入假孕受体雌鼠子宫角。

④转基因鼠的组织检测
子鼠出生后三个月从鼠尾取血提取DNA以PCR检测App基因筛选转基因体。

然后，进行非同胞间交配，使其后代进行遗传学观察。

用第一代或第二代鼠饲养到10个月以后，行为学测试分析其学习记忆能力，取脑组织作下列检测：a. Southern杂交检测App cDNA的整合；b. Northern 杂交和RT-PCR检测App RNA转录；c. 免疫组化检测App表达和脑组织内Aβ免疫阳性斑块的形成情况。

五、AD动物模型的应用和评价
（一）前脑胆碱能系统损害模型
该模型通过手术、化学或免疫切除的方式损伤基底前脑-海马胆碱能投射，从而模拟AD的前脑胆碱能系统的损害。

这一类模型主要用于：1. 研究前脑胆碱能系统选择性损害与AD的记忆减退和认识障碍等临床症状的关系和机制；2. 拟胆碱药物治疗AD的药物筛选、疗效评价和作用
机制的研究；3. 胚胎基底前脑胆碱能细胞脑内移植治疗AD的实验研究；4. 神经营养因子如NGF 等脑室投递治疗AD的研究以及NGF或其它神经营养因子基因修饰细胞脑内移植对AD进行基因治疗的研究等。

胆碱能损害模型的三种损害方式在用于上述不同研究目的时其作用又有所不同。

实验时应根据需要选择。

比如，研究NGF或转基因细胞对AD的治疗应选择隔-海马切断模型。

因为该模型前脑胆碱能神经元胞体尚存，NGF可以促进其修复、轴突再生或抽芽。

如果研究胆碱神经元选择性损害与AD认知障碍的关系则应选择免疫毒素切除模型较理想，因为这样可以排除其它化学属性神经元损害对结果的干扰。

（二）自然衰老认知障碍模型
自然衰老认知障碍模型是基于不同的个体对衰老的易感性不同，通过行为筛选的方式将衰老并具有明显认识障碍的个体选出。

该模型的特点是自然衰老，其神经系统的损害亦属自然发生，因此我们认为该模型适合于中药治疗AD的筛选和疗效评价，如果将此模型和其它损害模型相结合适用于其它方法治疗AD的研究。

（三）慢性脑缺血痴呆模型
该模型的二个特点是：1. 脑组织长期供血不足；2. 只有老年动物长期缺血才出现恒定的行为损害和病理改变，年轻动物长期缺血造成的损伤是一过性的。

基于该模型的制作机理和特点，考虑到临床上有不少AD患者同时合并有脑血管型痴呆和脑供血不足，我们认为这一模型适用于研究混合性老年期痴呆的发病机制和有关药物治疗的研究。

（四）OA损害模型
由于OA对蛋白磷酸化酶1A和2A的抑制作用和提高PKC的活性，并能同时复制出AD 的二大分子标志有关的病理改变──老年斑和NFT，该模型具有明显的优势主要适用于：①研究AD发病的病理机制，Aβ和Tau蛋白代谢异常与AD病理的关系，以及Aβ和Tau在AD病变中的相互作用。

②从另一角度验证现有AD治疗方法和药物的疗效。

（五）转基因动物模型
App的表达和代谢型异常是AD发病的中心环节,该模型主要用于研究：①是否App（野生或突变）或者含Aβ片段基因的过渡表达与AD的病理改变有关；②AD患者App或Aβ异常表达的分子机制；③AD时App或Aβ的代谢发生了什么变化及其与老年斑形成的关系；④试验新的AD治疗药物。

总之，AD的动物模型有多种类型，大致可概括为损害模型、自然衰老模型和转基因动物模型三大类。

每一种模型都在一定的程度上或某些方面模拟了AD的症状和病理改变。

它们各自具有自己的适用范围和作用，又各有优势和不足。

因此，每一个需要应用AD动物模型的研究者，。