溶血素制备.
综合性实验二、溶血素的制备与应用实验
西安医学院教案（专业课程）课程名称临床免疫学与检验班级检本1008 专业，层次检验，本科教师武永红专业技术职务讲师授课方式（大，小班，实习）实验学时9学时授课题目（章，节）溶血素的制备与应用实验基本教材或主要参考书王兰兰，许化溪主编.临床免疫学检验.第5版：人民卫生出版社，2012 刘辉．临床免疫学与检验实验指导第3版：人民卫生出版社，2009 曹励民．免疫学检验实验指导．自编教材，2011教学目的：1.掌握：溶血素制备的一般程序，CH50测定实验的操作，动物实验的常见操作如皮内注射及静脉注射法，耳缘静脉颈内动脉及心脏采血法。
2.熟悉：溶血素滴定及补体活性测定的实验原理。
教学内容：1．溶血素的制备2．溶血素滴定实验3．总补体活性测定实验教学方法：启发式教学；讲授重点内容。
教具：板书示教教学重点、难点：1. CH50测定实验教研室审阅意见（教研室主任签名）年月日教 学 内 容 教学手段 时间分配溶血素的制备与应用实验（一）溶血素的制备（二）溶血素滴定实验（三）总补体活性测定实验（一）溶血素的制备Ag ：SRB C →抗血清：溶血素所用的免疫原，8个人以上的混合血清，其中要包括ABO 的所有血型。
（血清1:2稀释）与福氏———二者1:1注射器混合，按照一定程序对家兔进行免疫注射，SRBC 的免疫程序： 日序（天） 免疫剂量（ml ） 免疫途径 1 1 皮内五点注射 3 1.5 皮内五点注射 5 2.0 皮内五点注射 7 2.0 皮内五点注射 10 1 耳缘静脉注射 13 1.5 耳缘静脉注射 放血方法：颈动脉采血试血方法：凝集试验（二）溶血素滴定实验 1．SRBC 的制备 将脱纤维或Alsver 液保存的SRBC 用生理盐水洗3次，每次离心2000r/min10min ，最后取压积红细胞，用巴比妥缓冲液配成2×108/ml （2%）SRBC 悬液。
2．滴定用补体的准备 取豚鼠2~3只，心脏采血，分离出血清后混匀备用，适用前用生理盐水作1：40~1：60稀释。
绵羊红细胞溶血素制备方法的改进及其在教学实验中的应用
doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2020.12.014㊃免疫学技术与方法㊃绵羊红细胞溶血素制备方法的改进及其在教学实验中的应用①孙元杰 国 航② 唐 康 马 樱 张春梅(空军军医大学基础医学院免疫学教研室,西安710032) 中图分类号 R310.99 文献标志码 A 文章编号 1000⁃484X (2020)12⁃0000⁃03①本文受陕西省高校科协青年人才托举计划项目(No.20170206)资助㊂②共同第一作者,空军军医大学基础医学院四大队,西安710032㊂作者简介:孙元杰,女,硕士,实验师,主要从事医学免疫学教学和研究工作,E⁃mail:syjfly@㊂通讯作者及指导教师:张春梅,女,博士,高级实验师,主要从事医学免疫学教学和研究工作,E⁃mail:461607521@㊂[摘 要] 目的:制备高效价㊁具有较高应用价值的绵羊红细胞(SRBC)溶血素㊂方法:采用两种免疫方法制备绵羊红细胞溶血素:A 组采用传统SRBC 悬液兔耳缘静脉注射的免疫方法,B 组采用SRBC 悬液加弗氏佐剂作为免疫原皮下注射的免疫方案㊂结果:用SRBC 溶血实验及酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价㊂结果表明,B 组抗体效价均比A 组高4倍,在溶血实验中获得了良好的教学效果㊂结论:SRBC 悬液加弗氏佐剂的免疫方案对制备高效价的SRBC 溶血素具有较高的应用价值㊂[关键词] 绵羊红细胞;溶血素;溶血实验;效价Improvement of preparing SRBC hemolysin and its application in teaching ex⁃perimentSUN Yuan⁃Jie ,GUO Hang ,TANG Kang ,MA Ying ,ZHANG Chun⁃Mei .Department of Immunology ,School of Basic Medical Science ,the Air Force Military Medical University ,Xi′an 710032,China[Abstract ] Objective :To prepare sheep red blood cell (SRBC)hemolysin with high titer and application value.Methods :Two immune methods were used to prepare SRBC hemolysin,group A in which SRBC suspensions were injected into marginal ear vein of rabbits,and group B in which the immunization protocol with subcutaneous injection of SRBC suspensions plus Freund adjuvant was em⁃ployed.Results :Results indicated that hemolysin titer of group B was four times higher than that of group A detected by SRBC hemolytic test and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Morever,satisfactory results were acquired in hemolytic test using the antiserum from group B.Conclusion :The results suggest that immunization protocnol of SRBC suspension plus Freund adjuvant is valuable for preparing SRBC hemolysin with higher titer in rabbit.[Key words ] SRBC;Hemolysin;Hemolytic test;Titer 在医学免疫学实验教学中,溶血素参与的溶血实验常作为补体系统中起到重要生物学功能的溶细胞的一个教学实验㊂国内有教学组用不同动物红细胞制备溶血素,并对溶血实验的效果进行了对比[1,2]㊂本教研室曾用全细胞加佐剂免疫小鼠的方法,用免疫组织化学方法筛选针对肿瘤相关抗原的抗体,发现全细胞加佐剂组筛选到阳性抗体的比率明显增加㊂据此,本文尝试用绵羊红细胞(sheep redblood cell,SRBC)加佐剂方法免疫家兔制备溶血素,发现其ELISA 效价和溶血效价均明显高于常规SRBC 经耳缘静脉免疫组,并在教学实验中取得满意效果㊂1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要材料与试剂 酶标板购自康宁公司;酶标仪购自伯乐公司;四甲基联苯胺(TMB)显色剂购自碧云天生物公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 购自Sigma 公司㊂1.1.2 实验动物 实验用动物均由空军军医大学实验动物中心提供㊂新西兰家兔4只,雌性,体重2~3kg /只,随机分为A㊁B 两组,每组2只㊂豚鼠心脏取血分离新鲜血清,将3只豚鼠血清混合作为补体来源㊂㊃8741㊃中国免疫学杂志2020年第36卷1.2 方法1.2.1 SRBC悬液制备 选用健康绵羊,颈静脉无菌取血,将羊血放入有玻璃珠的无菌三角烧瓶中,同一方向均匀用力摇动,充分混合,去除纤维蛋白,直至血液不会凝固㊂将抗凝血置离心管中,2000r/min,离心5min,用生理盐水洗涤5次后,配成20%或10%SRBC悬液,置4℃冰箱保存备用㊂1.2.2 免疫方案A组(常规耳缘静脉注射组) 首次剂量为每只家兔1ml20%SRBC悬液,第2~5次采用10%SRBC,每次间隔6d,末次注射后第7天取免疫兔血,分离血清检测效价㊂B组首次剂量1ml20%SRBC悬液和1ml完全弗氏佐剂混合,制备成 油包水”乳状液,2ml/只家兔,腋下多点注射,第2~5次免疫用10%SRBC和不完全弗氏佐剂体积按1∶1混合制备成 油包水”乳状液,2ml/(只㊃次),注射次数和间隔时间同A组(见表1)㊂1.2.3 免疫血清效价的检测 于末次免疫后一周进行兔颈动脉无菌取血,4℃冰箱过夜,次日收集血清,分装,置于-80℃冰箱保存㊂采用补体溶血实验和间接ELISA方法分别检测两种不同免疫方案所制备的免疫血清效价㊂1.2.4 溶血实验 溶血素稀释度及各种试剂的量,见表2㊂1.2.5 间接ELISA测定免疫血清效价 用包被缓表1 A组、B组制备家兔SRBC溶血素的免疫方案Tab.1 Immunization protocols for preparation of rabbit SRBC hemolysin in group A and group BTimes of immunization Group A(ear marginal vein injection)Antigen(SRBC)Volume(ml)Group B(Freund adjuvant was employed)Antigen(SRBC+Freund adjuvant)Volume(ml)120%suspensions120%suspensions+FCA2210%suspensions110%suspensions+FIA2310%suspensions110%suspensions+FIA2410%suspensions110%suspensions+FIA2510%suspensions110%suspensions+FIA2表2 溶血素效价的测定Tab.2 Determination of hemolysin titerTiters Volume(ml/test)Hemolysin Physiological saline Complement(1∶40)2%SRBC 1∶1000.20.20.20.2 1∶2000.20.20.20.2 1∶4000.20.20.20.2 1∶8000.20.20.20.2 1∶16000.20.20.20.2 1∶32000.20.20.20.2 1∶64000.20.20.20.2 1∶128000.20.20.20.2冲液将抗原(10%SRBC悬液反复冻融5次)1∶100稀释,100μl/孔加入ELISA板,加封口膜后置4℃过夜㊂用PBST缓冲液洗板3次后,每孔加入1%BSA 封闭液200μl,37℃孵育㊂PBST洗涤3次,依次加入倍比稀释的免疫兔血清(1∶1000㊁1∶2000㊁1∶4000㊁1∶8000㊁1∶16000㊁1∶32000㊁1∶64000㊁1∶128000㊁1∶256000和1∶512000),100μl/孔,置于37℃孵育1h,PBST洗涤5次,甩干后,加入1∶1000稀释HRP标记的羊抗兔IgG100μl(同上孵育及洗涤),加入TMB底物显色液,100μl/孔, 37℃避光反应20min后,450nm处读取结果㊂同时设空白对照和阴性对照孔㊂2 结果2.1 两种免疫方法溶血素效价的比较 A组家兔溶血素效均价为1∶800;B组溶血素效价均为1∶3200㊂B组溶血素比A组效价高4倍(见表3)㊂2.2 两种免疫血清间接ELISA效价的比较 经间表3 两组溶血素效价的测定结果Tab.3 Hemolysin titers of two groupsTiters Group ANo.1No.2Group BNo.1No.2 1∶100++++1∶200++++1∶400++++1∶800++++1∶1600--++1∶3200--++1∶6400----1∶12800----表4 两组溶血素ELISA的测定结果Tab.4 Immunoserum titers of two groups detected by ELISATiters Group ANo.1No.2Group BNo.1No.2 1∶1000++++1∶2000++++1∶4000++++1∶8000++++1∶16000++++1∶32000++++1∶64000++++1∶128000--++1∶256000--++1∶512000----㊃9741㊃孙元杰等 绵羊红细胞溶血素制备方法的改进及其在教学实验中的应用 第12期接ELISA检测免疫家兔的效价,A组效价均为1∶64000,B组效价均为1∶256000㊂见表4㊂3摇讨论补体参与的溶血实验是以绵羊红细胞为抗原,在体外与相应的IgG和/或IgM抗体(溶血素)结合形成抗原抗体复合物,通过经典途径激活补体,在红细胞膜上形成攻膜复合物(MAC),引起红细胞的溶破,发生溶血反应㊂由于该实验可验证补体细胞毒的生物学功能,并与临床上常见的输血反应㊁新生儿溶血症和自身免疫性溶血性贫血密切相关,成为医学免疫学中经典的实验之一㊂采用SRBC悬液作为抗原,经耳缘静脉免疫家兔制备溶血素是经典的制备溶血素方法[3]㊂本实验室单抗平台研究组在制备抗肿瘤相关抗原抗体的免疫过程中,设计了完整细胞加佐剂免疫组,其获得阳性克隆的比例明显高于单纯细胞免疫组㊂受此启发,本研究以常规耳缘静脉免疫途径制备溶血素方法为对照,采用SRBC 悬液加佐剂免疫方法制备溶血素,通过比较溶血实验和间接ELISA两种方法,得出结果,加佐剂免疫方法比常规方法制备溶血素效价高4倍,值得推广㊂溶血素效价的判断可能和实验系统有关㊂李洱花等[1]和张淑莉等[4]溶血试验中采用0.1ml1% SRBC抗原检测溶血素效价达到1∶4800和1∶3000㊂为了方便学生观察实验结果,本溶血实验采用0.2ml2%SRBC作为抗原,抗原量比有些院校的溶血实验高4倍,这可能是SRBC悬液经耳缘静脉免疫家兔制备溶血素造成效价差别的原因㊂参考文献:[1] 李洱花,叶吉云,邹 浩,等.不同动物红细胞制备实验教学用溶血素的方法探讨[J].国际检验医学杂志,2017,38(14): 1921⁃1924.Li EH,Ye JY,Zou H,et al.To explore the preparation method of different animal erythrocyte hemolysin in experimental teaching of medical immunology[J].Int J Lab Med,2017,38(14): 1921⁃1924.[2] 虞上宠,马益炳,唐丹燕,等.绵羊红细胞与鸡红细胞制备溶血素在免疫学溶血反应中的运用比较[J].杭州师范学院学报(医学版),2008,28(2):87⁃89.Yu SC,Ma YB,Tang DY,et parison and application of hemolysin in the preparation of sheep red blood cells and chicken red blood cells in the immunological hemolysis reaction[J].J Hangzhou Normal Univ(Med Sci),2008,28(2):87⁃89. [3] 徐存来,赖登明,陈海波,等.两种免疫方法制备兔抗绵羊红细胞溶血素的效价观察[J].健康研究,2011,31(2):91⁃93.Xu CL,Lai DM,Chen HB,et parison of two types of rabbit anti⁃sheep RBC hemolysin antiserum titers from different immunization procedures[J].Health Res,2011,31(2):91⁃93.[4] 张淑莉,李 妮,邵明明,等.高效价兔抗羊免疫血清制备及其在实验教学中的应用[J].山西医药杂志,2015,44(11): 1241⁃1243.Zhang SL,Li N,Shao MM,et al.Preparation of high titer rabbit anti⁃sheep immune serum and its application in experimental teaching[J].Shanxi Med J,2015,44(11):1241⁃1243.[收稿2019⁃06⁃20](编辑 张晓舟 陈 阳)(上接第1477页)[12] Yu QQ,Wu H,Huang X,et al.MiR⁃1targets PIK3CA andinhibits tumorigenic properties of A549cells[J].BiomedPharmacother,2014,68(2):155⁃161.[13] Liu J,Li Q,Li R,et al.MicroRNA⁃363⁃3p inhibits papillarythyroid carcinoma progression by targeting PIK3CA[J].Am JCancer Res,2017,7(1):148⁃158.[14] Thorpe LM,Yuzugullu H,Zhao JJ.PI3K in cancer:Divergentroles of isoforms,modes of activation and therapeutic targeting[J].Nat Rev Cancer,2015,15:7⁃24.[15] Courtney KD,Corcoran RB,Engelman JA.The PI3K pathway asdrug target in human cancer[J].J Clin Oncol,2010,28:1075⁃1083.[16] Faes S,Dormond O.PI3K and AKT:unfaithful partners in cancer[J].Int J Mol Sci,2015,16(9):21138⁃21152. [17] Wang Z,Liu Z,Fang X,et al.miR⁃142⁃5p suppressestumorigenesis by targeting PIK3CA in non⁃small cell lung cancer[J].Cell Physiol Biochem,2017,43(6):2505⁃2515. [18] Angadi PV,Patil PV,Angadi V,et al.Immunoexpression ofepithelial mesenchymal transition proteins E⁃cadherin,β⁃catenin,and N⁃cadherin in oral squamous cell carcinoma[J].Int J SurgPathol,2016,24(8):696⁃703.[19] Qie S,Diehl JA.Cyclin D1,cancer progression,and opportunitiesin cancer treatment[J].J Mol Med,2016,94(12):1313⁃1326.[收稿2019⁃05⁃31 修回2019⁃07⁃01](编辑 倪 鹏 周文瑜)㊃0841㊃中国免疫学杂志2020年第36卷。
医学免疫学溶血实验实验报告
溶血实验实验报告一．实验原理绵羊红细胞SRBC为抗原，与相应的特异性抗体反应形成免疫复合物，通过经典途径激活补体，MAC在SRBC上打孔导致SRBC溶解二．实验器械无菌注射器酒精棉球碘酒无菌玻璃瓶止血带镊子手术剪无菌棉签移液枪移液管锥形瓶量筒离心机试管无菌生理盐水甘油水浴锅冰箱记号笔酒精灯三．实验步骤1．在绵羊颈静脉剪毛备皮，用止血带扎住颈部，用碘酒消毒，再用酒精棉球脱碘，无菌注射器抽血，去除止血带，用无菌棉签止血，把抽出的血液放入无菌玻璃瓶注意要拔去针头。
2．在无菌实验室内，打开无菌玻璃瓶在酒精灯前晃动几下防止细菌感染，取5毫升绵羊血，配平离心，取出弃上清液，再加入生理盐水洗涤，配平离心2至3次，弃上清得到绵羊红细胞。
3．制备20%绵羊红细胞悬液，用移液枪取两毫升绵羊红细胞到锥形瓶，在用移液管取八毫升无菌生理盐水至锥形瓶振荡混匀。
制备2%绵羊红细胞悬液，用移液枪取一毫升绵羊红细胞之锥形瓶，再往量筒中倒入四十九毫升无菌生理盐水，倒入锥形瓶中振荡混匀。
4．免疫接种。
第1天，家兔多点皮内注射绵羊全血0.5毫升。
第3天，家兔多点皮内注射绵羊全血1毫升。
第5天，家兔多点皮内注射绵羊全血1.5毫升。
第7天，家兔多点皮内注射绵羊全血2毫升。
第9天，家兔多点皮内注射绵羊全血2.5毫升。
第12天，家兔耳缘静脉注射20%SRBC1毫升。
第15天，家兔耳缘静脉注射20%SRBC1毫升。
5．18天后试血。
家兔耳缘静脉处脱毛，用血管夹夹住，用注射器抽血观察效价是否合适。
6．心脏取血。
手术剪剪毛备皮，胸骨左缘34肋间搏动最强处垂直进针取血20毫升分别放入两试管内。
7．溶血素制备与保存。
配平离心，取上清放入另一个试管内水浴30分钟，加入等体积甘油灭活补体，记号笔写上标签。
再放入零下二十度冰箱冷藏。
8．。
溶血素的收集和溶血素单位的滴定
1 2 3
自动化和智能化
随着科技的发展，溶血素活性测定方法将越来越 趋向于自动化和智能化，提高检测效率和准确性。
多参数联合检测
未来溶血素活性测定可能会与其他生物标志物联 合检测，为疾病的早期诊断和治疗提供更全面的 信息。
新型标记技术的应用
新型标记技术如量子点、荧光纳米材料等在溶血 素活性测定中的应用将进一步提高检测的灵敏度 和准确性。
注意事项与误差分析
注意事项
在实验过程中需要保持操作规范，避免交叉污染；观察凝集反应时要迅速、准确，避免 时间过长导致凝集程度发生变化；实验结束后要及时清洗器材，避免残留物对下次实验
造成影响。
误差分析
误差可能来源于器材的精度和准确性、操作过程的规范性、环境温度和湿度等因素。为 了减小误差，可以采用多次重复实验取平均值的方法，同时尽量保持实验环境的稳定性。
溶血素的收集和溶血素单位的滴定
contents
目录
• 溶血素基本概念与性质 • 溶血素收集方法与步骤 • 溶血素单位滴定原理及操作规范 • 溶血素活性测定方法比较 • 溶血素在医学领域应用前景 • 安全生产管理与环境保护要求
01 溶血素基本概念与性质
溶血素定义及作用
溶血素是一种能够破坏红细胞并释放 出血红蛋白的生物活性物质。
微孔板法
灵敏度高，样品用量少，但设备成本较高。
流式细胞仪法
准确度高，可重复性好，但设备昂贵，操作 复杂。
适用范围讨论
试管法
适用于大量样品的初步筛选和溶血素活性的大致测定。
微孔板法
适用于对溶血素活性要求较高的实验研究和临床诊断。
流式细胞仪法
适用于对单个红细胞溶血程度的精确测定和深入研究。
新型技术发展趋势
1实验一 免疫血清的制备及应用(1)
实验一免疫血清的制备及应用（1）免疫血清（溶血素）的制备【实验原理】用绵羊红细胞(SRBC)免疫家兔，可获得抗绵羊红细胞抗体(抗SRBC抗体)。
SRBC与抗SRBC抗体结合，在补体参与下，可出现红细胞溶解，因此抗SRBC抗体也称为溶血素。
【主要试剂与器材】1.健康雄性家兔、绵羊。
2.2%碘酒、75％酒精、无菌生理盐水。
3.0.10g/L硫酸镁生理盐水溶液。
4.无菌三角瓶(内装玻璃珠)、离心管、吸管、注射器。
5.离心机。
【操作方法】1.抗原制备（1）用碘酒、75％酒精消毒绵羊颈静脉处皮肤，抽血，缓慢注入含有玻璃珠的无菌三角瓶内，轻轻摇动三角瓶，脱纤维抗凝。
抗凝绵羊血用Alsever液可保存2周。
（2）无菌取抗凝绵羊血于离心管中，加适量生理盐水，2000r/min离心5min，吸去上清液和白细胞层，再用较多的无菌盐水与红细胞混匀，离心再弃上清，重复3次，最后一次离心10min。
（3）根据红细胞压积，用0.10g/L硫酸镁生理盐水溶液配成20％SRBC悬液。
2.免疫动物（1）取健康雄性家兔，通过耳静脉免疫，免疫程序见表1-2。
表1-2 溶血素制备免疫方案【结果判断】收获的抗血清应是无菌、无溶血的。
【注意事项】注意无菌操作，并尽可能多的采集血清。
【方法评价】溶血素方法简便易行，但是动物个体间产生溶血素质量差异较大。
【临床应用】溶血素可直接用于补体参与的溶血反应，如总补体溶血活性和单个补体成分溶血活性测定。
用溶血素和SRBC做指示系统，可进行补体结合试验。
【思考题】在制备绵羊红细胞过程中为什么要洗涤并吸去红细胞表面的白细胞层?。
直接凝集实验接溶血素制备优选PPT文档
结果观察和判断
先看对照管，轻摇动，应为不凝集，红细胞均匀的分散在 液体中。
再看实验管，轻摇动，在稍微静置一会儿。 ++++ 液体澄清，全部的絮状碎片沉于管底 +++ 液体轻度混浊，绝大多数絮状碎片沉于管底 ++ 液体半混浊，约半数絮状碎片沉于管底 + 液体混浊，仅少数细小的絮状碎片沉于管底 - 表现与对照管相同 结果判断 能与一定量的红细胞发生两个加号凝集反应的
2-3min，观察结果。 2-3min，观察结果。
1生％理S盐R水BC --各直-直+各各-++按再+++管管管表看++接 接表表表表摇 摇 摇 格 实液液液现现现现凝凝匀匀匀稀验体体体与与与与集集后后后释管半轻轻对对对对--置置置血，混--实实度度试试照照照照室室室清轻浊混混验验管管管管管管温温温和摇，浊浊法法相相相相或或或加动约，，同同同同样，333半绝 绝777。在数℃℃℃大大稍絮多多111000微状数数mmm静碎絮絮iiinnn置片，，，状状一沉离离离碎碎会于心心心片片儿管555沉沉000。底000于于rrrppp管管mmm底底///mmmiiinnn
+++ 液体轻--度试混管浊法，绝大多数絮状碎片沉于管底
各管摇匀后置室温或37℃ 10min，离心500rpm/min 2-3min，观察结果。
实验步骤
将血清放在65℃ 5min。 取试管9只，排列于试管架上，依次编号。 按表格稀释血清和加样。（ul）
各管摇匀后置室温或37℃ 10min，离心 500rpm/min 2-3min，观察结果。
2-3min，观察结果。
2-3min，观察结果。 2-3min，观察结果。
溶血素实验报告
一、实验目的1. 了解溶血素的制备方法。
2. 掌握溶血素效价的测定方法。
3. 学习溶血素在免疫学中的应用。
二、实验原理溶血素是一种能与红细胞膜上的抗原结合，导致红细胞溶解的抗体。
在实验中，我们通过制备溶血素，并测定其效价，以了解溶血素在免疫学中的应用。
三、实验材料1. 实验动物：家兔2. 生理盐水3. 抗原：鸡红细胞4. 抗血清：鸡红细胞抗血清5. 0.1%戊二醛6. 吸管、移液器、试管等实验器材四、实验方法1. 制备抗原：取新鲜鸡红细胞，用生理盐水洗涤3次，去除血浆和杂质，最后用生理盐水配成2%的鸡红细胞悬液。
2. 制备溶血素：取家兔，注射鸡红细胞抗原，经过一段时间免疫后，采集血清，用0.1%戊二醛进行灭活处理，得到溶血素。
3. 溶血素效价测定：a. 取12支试管，编号1-12号，每支试管加入0.1ml生理盐水；b. 从1号试管开始，依次加入1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048倍的溶血素，每加入一次后摇匀；c. 在每支试管中加入0.1ml 2%鸡红细胞悬液，摇匀；d. 37℃水浴孵育30分钟；e. 取出试管，观察红细胞溶解情况，记录未溶血的最高稀释倍数，即为溶血素效价。
五、实验结果1. 制备的溶血素呈淡黄色，半透明状。
2. 溶血素效价为1:256。
六、实验分析1. 溶血素的制备：通过注射鸡红细胞抗原，使家兔产生特异性抗体，进而制备出溶血素。
2. 溶血素效价测定：通过将溶血素进行不同倍数的稀释，观察红细胞溶解情况，确定溶血素的最小有效浓度，即溶血素效价。
3. 溶血素在免疫学中的应用：溶血素可以用于检测抗原抗体反应，以及研究免疫学相关疾病。
七、实验结论本实验成功制备了溶血素，并测定了其效价。
实验结果表明，溶血素在免疫学中具有重要作用，可以用于检测抗原抗体反应，以及研究免疫学相关疾病。
八、实验注意事项1. 实验过程中，应严格控制操作条件，避免溶血素效价受到影响。
溶血素与补体激活实验报告
实验报告4. 补体结合反应实验原理补体结合反应是一种有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。
参与本反应的五种成分可分为两个系统：一为待检系统，即为已知抗原（或抗体）和待检抗体（或抗原）；另一个为指示系统，即绵羊红细胞和其相应的溶血素。
待检抗原、抗体和补体作用后，再加入指示系统。
若待检系统中的抗原和抗体相对应，两者特异性结合后激活补体，补体被消耗。
再加入的指示系统无补体结合，不出现溶血；若待检系统中的抗原与抗体不对应或缺少一方，补体不被激活，当指示系统加入后，绵羊红细胞和溶血素复合物激活补体，产生溶血现象。
5. 空斑形成实验是一种体外检测IgM、IgG类型抗体产生细胞的实验方法，又称空斑形成细胞（PFC)测定。
可作为评估药物影响抗体产生水平以及临床筛选抗肿瘤新药的重要依据。
经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞混合后，抗体形成细胞产生的抗体与绵羊红细胞结合；在补体参与下，绵羊红细胞溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。
一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
一、SRBC的制备（一）无菌抽取绵羊血1.手术剪减去绵羊颈部毛发备皮，止血带扎住颈部，碘酒消毒，酒精棉球再擦拭。
2.抽取一定量的绵羊血，注入无菌玻璃瓶，轻轻摇晃获得抗凝绵羊血，摇晃时不能用力过猛，防止SRBC破裂。
（二）绵羊红细胞的制备1.在无菌实验室中，用移液枪吸取5ml抗凝绵羊血于试管中，共4支试管。
2.配平后对称放入离心机中2000rpm离心10分钟。
3.4支试管，胶头滴管吸去上清液，加入适量的灭菌生理盐水后轻轻摇晃混匀。
4.再次配平后，2000rpm离心10分钟，2-3次。
5.吸去上清液，获得绵羊红细胞。
（三）绵羊红细胞悬液制备1.20%绵羊红细胞悬液制备在无菌实验室中，用移液枪吸取2ml绵羊红细胞于锥形瓶中，用移液管再加入8ml灭菌生理盐水，混合均匀。
2.2%绵羊红细胞悬液制备在无菌实验室中，用移液枪吸取1ml绵羊红细胞于锥形瓶中，量筒量取49ml无菌生理盐水加入锥形瓶，混合均匀。
项目一 免疫血清的制备与提纯
项目一免疫血清的制备与提纯一、免疫血清的制备(Preparation of antiserum)【实验原理】将适当的免疫原物质注入动物体内，经一段时间动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为抗血清(或免疫血清)。
它在血清学检测中有广泛应用。
理想的抗血清的产生主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的应签性。
同时免疫接种时的免疫途径、抗原剂量、有无佐剂、注射次数及间隔时间等因素均可影响抗血清的质量。
制备的抗血清可直接用于某些实验，也可从中提取特异性抗体或某一组分。
下面介绍几种常用的免疫血清制备方法，免疫动物均选用家兔，这是因为：(1)其产生的血清量足够实验应用并容易驯养；(2)为采血、注射用耳血管很容易找到；(3)用兔子作免疫接种的资料较多，可方便利用；(4)能产生高效价抗体，并且可用常用的沉淀反应、凝集反应或溶血、溶菌反应等试验方法进行鉴定。
【试剂和器材】1．免疫动物2～3kg健康雄性家兔。
2．免疫原绵羊红细胞(SRBC)、OX19变形杆菌、人IgG(SPA菌体吸附)、正常人混合血清、牛血清白蛋白(BSA)、聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质抗原。
3．佐剂完全和不完全福氏(Freund)佐剂。
4．其它试剂生理盐水、70%酒精等。
5．器材注射器及针头、棉球、三角烧瓶、玻璃珠、试管、吸管、柯氏瓶(扁瓶)、Luer-lock(双联)注射器、止血钳、手术剪、手术刀等，以上器材均应高压灭菌或消毒后使用；离心机、液体旋转混合器、温箱、水浴箱、冰箱等。
【步骤和方法】(一)溶血素的制备1．制备抗原取脱纤维羊血或用阿氏(Alsever)液保存的绵羊红细胞(采血方法见附录常用实验动物采血方法)，用生理盐水洗３次，每次加2～3倍生理盐水，离心2000r/min 10min，弃上清。
最后一次按压积用生理盐水配成10%SRBC悬液，放４℃保存备用。
2．免疫动物家兔耳缘静脉注射10%SRBC悬液1ml，间隔3天，连续7次，末次免疫后2周，由耳静脉取血1ml(取血方法见附录常用实验动物采血方法)，分离血清，测定溶血素效价(见补体结合试验)，当效价≥1:2000则可放血收集血清，此法效价可达1:6000~1:10000。
溶血素制备
实验课要求
预习 不迟到、早退、不旷课、有事请假 穿白大褂、注意自我防护 不喧哗，不做与实验无关的事 不要急于开始做实验 不要急于写实验报告 实验完成后，自己把桌面收拾干净 值日要求：擦桌子，拖地、擦黑板、倒垃圾、关灯和门窗
（劳动委员负责安排和监督） 认真完成实验报告
实验报告的要求
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、核酸
2.免疫动物的选择
（1）抗原与动物种属的关系：亲缘关系 （2）动物的个体状况：适龄、健康、体重 （3）抗原的性质：家兔对胰岛素不易产生抗体 （4）免疫血清用量和要求：大和小，R型和H型
3.免疫方法
（1）免疫原的剂量 （2）免疫间隔时间 （3）免疫途径
免疫耐受 抗体产生的规律 吸收和代谢速度
溶血素的制备
实验原理
将一定浓度的绵羊红细胞（SBRC）经一定 的方式注入动物体内，一段时间后，动物 血清中可出现特异性的抗绵羊红细胞抗体 （溶血素），该过程称为溶血素的制备。
主要的实验试剂和器材
离心机 离心管（无菌、回收）、玻璃滴管（无菌、回
收）、一次性注射器 生理盐水、酒精棉球 兔子、绵羊血
免疫途径 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉
SRBC浓度 10％ 15％ 20％ 25％ 30％
注射量 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml
注：第1次免疫之后做好标记，放到自己班级的笼中 第2-5次免疫用的SRBC悬液由实验准备老师替大家准备
时间安排
日期 9月18日 9月21日 9月24日 9月28日 9月30日 10月23日
溶血素的鉴定
鉴定效价 实验方法：直接凝集实验
直接凝集实验
--试管法
实验原理
在一定的电解质条件下，将已知的颗粒性抗原定量地与一 系列倍比稀释的待测血清等量混合，静置一定的时间后， 根据各管的凝集程度，判断待测血清的抗体效价。
溶血素制备
80 320
各管摇匀后置37℃×10min，离心500rpm×2-3min，观察 结果。
结果观察和判断
先看对照管，轻摇动，应为不凝集，红细胞均匀的分散在 液体中。
再看实验管，轻摇动，在稍微静置一会儿。 ++++ 液体澄清，全部的絮状碎片沉于管底 +++ 液体轻度混浊，绝大多数絮状碎片沉于管底 ++ 液体半混浊，约半数絮状碎片沉于管底 + 液体混浊，仅少数细小的絮状碎片沉于管底 - 表现与对照管相同 结果判断：能产生明显凝集现象(++）的最高血清稀释度
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、核酸
2.免疫动物的选择
（1）抗原与动物种属的关系：亲缘关系 （2）动物的个体状况：适龄、健康、体重 （3）抗原的性质：家兔对胰岛素不易产生抗体 （4）免疫血清用量和要求：大和小，R型和H型
3.免疫方法
（1）免疫原的剂量 （2）免疫间隔时间 （3）免疫途径
免疫耐受 抗体产生的规律 吸收和代谢速度
溶血素的鉴定
鉴定效价 实验方法：直接凝集实验
在一定的电解质条件下，将已知的颗粒性抗原定量地与一 系列倍比稀释的待测血清等量混合，静置一定的时间后， 根据各管的凝集程度，判断待测血清的抗体效价。
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实验步骤
将血清放在65℃×5min（灭活补体）。 取试管9只，排列于试管架上，依次编号。 按表格稀释血清和加样（ul）。
80 320
各管摇匀后置37℃×10min，离心500rpm×2-3min，观察结果。
结果观察和判断
先看对照管，轻摇动，应为不凝集，红细胞均匀的分散在 液体中。
再看实验管，轻摇动，在稍微静置一会儿。 ++++ 液体澄清，全部的絮状碎片沉于管底 +++ 液体轻度混浊，绝大多数絮状碎片沉于管底 ++ 液体半混浊，约半数絮状碎片沉于管底 + 液体混浊，仅少数细小的絮状碎片沉于管底 - 表现与对照管相同 结果判断：能产生明显凝集现象(++）的最高血清稀释度
实验报告的要求
题目、原理、主要试剂与器材、步骤、结果（现象）、结 论、注意事项、讨论（心得体会）
班级、姓名、学号 由学习委员统一收齐，按学号从小到大顺序放好，在下一
周上课时交 自己写、书写整齐 订成一本或每次分开
免疫血清的制备
前言
将适当的免疫原性物质经过一定方式注入动物体内，一段 时间后，动物血清中可出现特异性抗体，该过程称为免疫 血清的制备，这种含抗体的血清称为免疫血清或抗血清。
星期 五 一 四 一 三 五
免疫次数 1 2 3 4 5
采血
心脏采血 末次注射七天后采血。
将兔子仰卧位固定，用手摸出心跳最快的位点，用20ml 的注射器刺入心脏，回抽注射器，看有无血抽出。若无 血，则将注射器前进或后推一点，再回抽。将抽出的血 液放入有玻璃珠的50ml离心管中，37℃水浴20～30min， 离心2500rpm*10min，收集血清，放-20℃保存。
实验课要求
预习 不迟到、早退、不旷课、有事请假 穿白大褂、注意自我防护 不喧哗，不做与实验无关的事 不要急于开始做实验 不要急于写实验报告 实验完成后，自己把桌面收拾干净 值日要求：擦桌子，拖地、擦黑板、倒垃圾、关灯和门窗
（劳动委员负责安排和监督） 认真完成实验报告
溶血素的鉴定
鉴定效价 实验方法：直接凝集实验
直接凝集实验
--试管法
实验原理
在一定的电解质条件下，将已知的颗粒性抗原定量地与一 系列倍比稀释的待测血清等量混合，静置一定的时间后， 根据各管的凝集程度，判断待测血清的抗体效价。
此方法常用于抗体的半定量检测。
主要试剂与器材
待检血清 1％ SRBC 生理盐水 37℃水浴箱 加样枪 试管
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、核酸
2.免疫动物的选择
（1）抗原与动物种属的关系：亲缘关系 （2）动物的个体状况：适龄、健康、体重 （3）抗原的性质：家兔对胰岛素不易产生抗体 （4）免疫血清用量和要求：大和小，R型和H型
3.免疫方法
（1）免疫原的剂量 （2）免疫间隔时间 （3）免疫途径
免疫耐受 抗体产生的规律 吸收和代谢速度
为抗体（溶血素）效价。
结论
如：本次实验制备的溶血素效价为1:160。
注意事项
家兔性情温顺，不会咬人；但其容易受噪音影响，变得烦 躁，所以在免疫动物时，安静有利于实验。
兔子受到惊吓或烦躁不安而难以固定，抚摸兔子背部的皮 毛可以稳定其情绪。
制备免疫原和免疫动物时注意无菌操作。 心脏采血时，注射器不能刺入太深，也不能在心脏中左右
1、电镜技术（示教） 2、免疫血清的制备 3、动物的致敏免疫接种 鸡胚接种（电教） 4、流式细胞术（示教） 5、单个核细胞分离及E花形成试验,淋转试验（6学时，周六）（显微镜） 6、动物实验性过敏反应观察及其动物采血 7、免疫球蛋白的纯化 8、IgG效价的测定（免疫扩散） 9、T细胞亚群测定，激光共聚焦显微镜技术（示教） 10、石蜡切片与酶细胞化学（显微镜） 11、酶联免疫吸附试验 12、凝聚试验 吞噬实验 13、斑点免疫渗虑试验免疫层析试验 14、放射免疫分析技术 15、免疫荧光标记技术
溶血素的制备
实验原理
将一定浓度的绵羊红细胞（SBRC）经一定 的方式注入动物体内，一段时间后，动物 血清中可出现特异性的抗绵羊红细胞抗体 （溶血素），该过程称为溶血素的制备。
主要的实验试剂和器材
离心机 离心管（无菌、回收）、玻璃滴管（无菌、回
收）、一次性注射器 生理盐水、酒精棉球 兔子、绵羊血
注：本次实验6人/组
实验步骤
制备免疫原 绵羊血3ml + 生理盐水3ml → 离心 2000rpm×5min → 弃上清（用玻璃滴管 吸，吸完后重新放回卷纸中） → 重复 洗涤两次 →按压积用生理盐水配成10％ SRBC悬液（注意无菌操作!）
免疫动物
时间 第一天 第三天 第五天 第七天 第九天
滑动针头，否则心脏戳穿而难以抽血。
免疫途径 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉
SRBC浓度 10％ 15％ 20％ 25％ 1.0ml 1.0ml
注：第1次免疫之后做好标记，放到自己班级的笼中 第2-5次免疫用的SRBC悬液由实验准备老师替大家准备
时间安排
日期 9月18日 9月21日 9月24日 9月28日 9月30日 10月23日
制备高效价特异性免疫血清是免疫学基本技术之一。 免疫血清的质量受多种因素影响，如免疫原、动物的种类、
接种途径和实验流程。
免疫血清制备的流程
制备免疫原
选择免疫动物
选择免疫方法
免疫血清的纯化
动物采血
免疫血清的鉴定
免疫血清的保存
1.免疫原的制备
--颗粒性免疫原的制备
绵羊红细胞、细菌
--可溶性免疫原的制备
4.动物采血法
（1）颈动脉放血法 （2）静脉采血法 （3）心脏采血法
注：采血前，要预先测定抗体效价，若达到要求，应在末次 免疫后一周及时采血，否则效价会下降。
5.免疫血清的纯化
去除非特异性抗体和其它血清成分
7.抗血清的鉴定
效价、特异性、纯度、亲和力
8.抗血清的保存
①4℃保存：3个月或半年 ②冷冻保存：-20℃～-70℃、2～3年 ③真空干燥保存：4～5年