凋落物PLFA取样和处理方法

凋落物和土壤前处理

取样：每个次小区分别取1袋米老排凋落物和1袋杉木凋落物，每个网袋单独装入一个塑料袋；同时用土钻取网袋下面0-10cm土壤装入自封袋。共36个网袋+36个土样。网袋和土壤放在装有冰块的冰盒带回实验室。凋落物前处理：

1，混合：凋落物带回实验室后，用剪刀剪碎混合，分成三份，一

份-20℃冷藏做PLFA，一份4℃保鲜做凋落物酶，另一份烘干称重计算分解速率。

2，脱水：把-20℃冷藏的凋落物放入冷冻干燥机脱水（-80℃），24小时左右

3，粉碎：脱水之后的凋落物用球磨机粉碎，装入自封袋，封好袋口，-20℃冷冻。

4，运输：把凋落物和土壤样品装入放有冰块的大冰盒带到广州。

5，实验时每个样品用量为0.1g（华南植物园），其他程序与土壤PLFA 一样。

土壤前处理：带回实验室的土壤人工挑拣出石子，细根等，然后混合放在-20℃冷冻带到广州。

具体实验步骤：

1、凋落物样品用球磨机粉碎（<10 μm）

2、称取冷冻干燥后的凋落物样品（250±1 mg）于玻璃离心管中（25 ml），用磷酸钾溶液（50 mmol l-1, pH 7.4）1.6 ml 、甲醇4 ml、氯仿 2 ml；

3、涡旋30s，超声2 min，在37℃下温育30min，然后离心（800×g），将上层清液倒入50 ml分液漏斗中。然后再重复浸提一次，合并两次上层清液。

4、向分液漏斗中再加入4 ml氯仿，4 ml水，然后轻轻的摇匀，放置整晚。

第二天

5、收集分液漏斗中的下层清液（氯仿相），在氮气下吹干。

6、通过色谱硅胶小柱进行脂质分离：用氯仿（3×2 ml）洗脱中性脂质，用丙酮（3×2 ml）洗脱糖脂，这些全部丢弃。最后用甲醇（3×2 ml）洗脱极性脂类，收集到玻璃试管中。在氮气下吹干。

7、在剩余残留物中，加入2ml氢氧化钾（KOH），1 ml甲苯：甲醇（1：1，v/v），然后在37℃下温育30 min。

参考文献：

Prior to analysis, frozen samples were ground with a Wiley Mill to pass through a 40-mesh screen.

(From:Temporal dynamics of microbial communities on decomposing leaf litter of 10 plant species in relation to decomposition rate: SBB) Subsamples for PLFA and enzyme assays were frozen (-20C) until analysis. (From: SARAH E. HOBBIE)

LFAs were extracted from 0.5 g freeze-dried residues(Petra Marschner; SBB)