文献综述 免疫印迹法
免疫印迹法（PDF）
免疫印迹法免疫印迹法（immunobiotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似，亦被称为Western-blot。
免疫印迹法分三个阶段进行。
第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
常用的HRP底物为3，3’-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。
阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。
本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。
在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。
抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒，可方便地在实验室中供检测用。
根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。
一． SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）基本原理是聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acr聚合成长链并通过双功能化合物甲叉双丙烯酰胺Bis交联而成的三维网状结构凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶的机械性、弹性、透明度、粘着度取决于凝胶的总浓度，总浓度越大，平均孔径越小，机械强度越强。
免疫印迹法在自身免疫性疾病中的应用价值
[４] 刘晓雄,郝海军,马靖华．血 清 Hcy及 NTＧproBNP 水 平 与 缺 血 性 脑卒中患者神经功能缺损及脑 梗 死 体 积 的 相 关 性[J]．医 学 综 述, ２０１６,２３(４７):４７５６Ｇ４７５８．
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本文 研 究 数 据 显 示,脑 卒 中 组 患 者 的 HCY 为 (１９．６４±８．１３)μmol/L,NTＧproBNP 为 (４１３．６３± ３２．４７)pg/mL,与健康 组 具 有 显 著 差 异,P＜０．０５,且 不同损伤 程 度 患 者 的 NTＧproBNP、Hcy 浓 度 及 不 同 梗死体积 的 患 者 的 NTＧproBNP、Hcy 浓 度 具 有 显 著 差异,P＜０．０５,表 明 HCY、NTＧproBNP 在 脑 卒 中 患 者中具有高 度 表 达,且 脑 梗 死 体 积 越 大,病 程 程 度 越 严重,其 NTＧproBNP、Hcy 浓 度 越 高,其 因 素 与 脑 卒 中所致的脑水肿致使颅内 压 力 急 剧 升 高,从 而 致 使 神 经低脂异常分泌,致使 NTＧproBNP、HCY 增加相关.
综上所述,NTＧproBNP 和 Hcy 检 测 在 脑 卒 中 患 者诊断中的应用意义显著,且 病 情 程 度 的 不 用 亦 导 致 NTＧproBNP 和 Hcy指标 具 有 显 著 差 异,临 床 中 可 将 其作为判定脑卒中病情严 重 程 度 的 重 要 指 标 之 一,值 得在临床中推广实施.
免疫印迹(5.4)
18兆去离子水调整总体积
40ml
每10ml RIPA裂解液放入0.1ml蛋白酶抑制剂cocktail. -20℃分装保存，临用前无需加入PMSF。
三、蛋白样品的变性
2×SDS-PAGE上样缓冲液：
① 100mM Tris-HCl(pH6.8) ② 200mM DTT ③ 4%SDS ④ 0.2%溴酚兰 ⑤ 20%甘油 ⑥ ddH2O
1M Tris-HCl (pH6.8) 10 ml
1M DTT
SDS 甘油 溴酚蓝 总体积
20 ml
4g 20 ml 0.2 g 100ml
1．尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢 失。
2．细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解， 低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解，蛋白酶抑制剂 的种类很多，要根据具体情况具体选择。 3．样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80℃。 切勿反复冻融已制备好的样品。 目的：要获得高丰度、高品质的蛋白质，以满足后续 实验的需求
ddH2O 样品
BCA(ML )
0 10
2
50 10
2
75
10 2
87.5
10 2
93.5
10 2
96.8
10 2
Bradford法敏感度高，并且与一系列干扰Lowry、BCA法的
还原剂（如DTT、巯基乙醇）相容。
与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受常用浓度去
垢剂的影响。
与Lowry法相比，BCA法操作更简单且稳定性更好，几乎没
免疫印迹技术方法研究
免疫印迹技术方法研究一、前言免疫印迹技术借助的是抗体与抗原的特异性结合的作用，来检测样品中蛋白质表达情况的一项免疫学检测技术，不需要复杂的大型机器，主要依靠凝胶电泳和电转移来对蛋白质提取，最终对蛋白质进行定性定量分析。
二、内容1、技术原理（1）样品的凝胶电泳：制备凝胶，加入样品进行凝胶电泳，使样品中蛋白质分离。
（2）电印迹：所谓电印迹就是将凝胶电泳上的经过分离的蛋白转移到一个固相膜上。
因为如果让蛋白质在凝胶电泳后直接检测，部分蛋白质会嵌在凝胶里面，探针无法到达，同时可能对蛋白质条带有破坏作用，因此为了方便探针与蛋白质互相结合，将其转移到另一个与探针结合度更好的物质上，也就是固相膜。
（3）选择性封闭：为避免探针和无关物质结合，将膜上没有结合蛋白质的部分封闭，防止其他干扰。
（4）免疫结合：将抗体与膜上的蛋白质结合，使其反应，再用二抗与一抗反应。
（5）产物检测：通过二抗间接检测目的蛋白，将膜上的抗体和能发出荧光的物质结合，对产生的发光物质进行检测。
2、方法(1)聚丙烯酰胺凝胶的制备:把玻璃板洗净并晾干,四边对齐，置于制胶架上。
其次配制分离胶，蛋白质的相对分子量不同制胶也不同。
分离胶制好后沿玻璃板上的一角缓慢、平稳地注入两层玻璃板中间,待其充分凝固后,把浓缩后的胶溶液沿玻璃板一角注入，立刻插入梳子。
(2)蛋白样品的前处理:将缓冲液和蛋白质样品按一定比例混合,待其沸腾若干分钟后,放入冰块中待用。
(3)样品上样和电泳:将制好的凝胶缓慢从架上取下,放进电泳槽,将缓冲液注入电泳槽,再拔出梳子。
吸取经过预处理的蛋白样品20μL加样。
打开电泳槽电源,选择稳压模式,100v左右的工作电压，待电泳时加入的指示染料到达胶底部时关闭电泳槽。
经凝胶电泳处理后，样品蛋白质带负电荷，在凝胶中游动，游动速度与分子量大小成反比，自阴极游到阳极。
（4）蛋白质转移（电转印）：将凝胶板取下,切去不用的部分,剪裁和凝胶一样大小的NC膜或PVDF膜,再在电转移液中浸泡固相膜，裁剪数张比凝胶尺寸稍微小一点的滤纸,放入缓冲液中浸泡。
Western Blot(免疫印迹法)
Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：⏹样品制备⏹电泳分离⏹蛋白的膜转移⏹免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂⏹1X 磷酸盐缓冲液(PBS)⏹Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM⏹1X SDS 样品缓冲液62.5 mMTris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT,0.01% w/v溴酚蓝⏹转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)⏹10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6⏹脱脂奶粉或BSA⏹甲醇⏹TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20⏹封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA⏹一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
⏹预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
1．培养细胞或药物处理。
2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
免疫印迹法
自身免疫性疾 病的筛选试验 ANA检测
（－）
SLE治疗缓解
病情特重（大量IC沉积消耗抗体）
（＋）低滴度 高滴度 常见于RA等其它自身免疫性疾病 可作为诊断SLE的依据
ENA抗帮助诊断SLE
硬皮病 PM/DM 干燥综合症 抗AMA-M2：PBC
确诊试验
抗dsDNA、Sm、rib抗体
抗Scl-70 抗Jo-1抗体 抗SSA和抗SSB 胞浆自身抗体
自身免疫性疾病检测的应用原则
免疫球蛋白、 补体等检测
+
ANA筛选
抗胞浆型抗体鉴定
ENA抗体谱
其它自身抗体
怀疑自身免疫性疾病
怀疑系统性自身免疫疾病
怀疑器官特异性自身免疫疾病
类风湿因子、抗中性粒细 胞胞浆抗体、抗磷脂抗体 及其它自身抗体检测
④ 加入酶标二抗反应
③ 洗去未反应蛋白 ② 加入标本反应
E ENA检测方法 E
自身抗体
非特异 蛋白
① 纯化抗原膜条（膜条试剂盒）
临床常检测的抗ENA抗体谱主要包括： 抗U1-RNP 抗Sm 抗SSA 抗SSB 抗Scl-70 抗Jo-1 抗rib-P蛋白
抗可提取性核抗原（ ENA ）抗体 anti-extractable nuclear antigen antibodie
SS？
雷诺现象 干燥综合征？ 面肌痉挛，神经痛 睡眠障碍，头痛
1:3200颗粒型
1:1000颗粒型着丝点 型 1:320颗粒型 1:100颗粒型 1:100胞浆型
高效价斑点型常见于MCTD
核膜型（或周边型）
相关抗体：抗dsDNA抗体 与胶原病、PBC、慢性活动性肝炎等相关
核仁型
相关抗体：抗RNA聚合酶-1抗体、抗SCL-70抗体 与硬皮病相关
免疫印迹法原理
免疫印迹法原理
免疫印迹法是一种实验室技术，用来检测抗体与抗原之间的相互作用。
它是一种比较灵敏的技术，可以快速准确地测量抗体和抗原之间的交互作用。
这一方法的特点是可以检测到极低浓度的抗体，并且可以在短时间内完成测试。
免疫印迹法通常具有五个步骤：1）准备抗原：将抗原溶解在溶剂中，以便它能够与抗体结合。
2）制备抗体：将抗体溶解在溶剂中，以便它能够与抗原结合。
3）将抗体与抗原混合：将抗体和抗原混合，使它们能够形成结合物。
4）检测结合物：使用某种技术，如荧光技术，来检测抗体和抗原之间的结合物。
5）分析结果：对检测到的结合物进行分析，以确定抗体与抗原之间的交互作用。
免疫印迹法在医学诊断中有着重要的应用。
它可以用来检测抗体与抗原之间的结合，以确定患者是否患有特定病毒或疾病。
此外，它还可以用来检测肿瘤细胞，以确定是否有癌症。
免疫印迹法的优点是，它可以检测到极低浓度的抗体，可以在短时间内完成测试，并且可以检测出抗体与抗原之间的结合物。
它的缺点是，它只能检测出抗体与抗原之间的结合，而不能检测出抗体与抗原之间的其他关系。
免疫印迹法是一种灵敏、准确的技术，可以用来检测抗体与抗原之
间的结合，以确定患者是否患有特定病毒或疾病。
它可以快速准确地检测出极低浓度的抗体，并且可以在短时间内完成测试。
因此，免疫印迹法在医学诊断中具有重要的应用。
免疫印迹法的发展历程
免疫印迹法的发展历程免疫印迹法（Immunoblotting）是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定蛋白质分子在混合溶液中的存在以及测定其相对分子质量和含量。
通过将蛋白质分子分离和转移到膜上，并利用特异性抗体与目标蛋白结合，再利用染色剂或放射性探针进行检测，从而实现对目标蛋白的检测和分析。
下面将介绍免疫印迹法的发展历程。
一、发展起源免疫印迹法最初是在1979年由Burnette首次提出的，他将此技术称之为“Western Blotting”。
当时，Burnette的研究目的是检测并验证特定肿瘤抗原的存在，以及分析蛋白质的电泳方式。
他使用低分子量蛋白质分离电泳将蛋白质分子按照相对分子质量大小进行分离，并将其转移到硝酸纤维素膜上，然后利用特异性抗体与目标蛋白进行结合，最后通过染色剂进行检测。
二、技术元器件的更新随着技术的发展，免疫印迹法在实验操作上进行了一系列的改进。
使用硝酸纤维素膜转移蛋白质分子被逐渐取代，目前主要采用的是聚合物膜，如聚氟乙烯（PVDF）膜和聚丙烯酰胺（NC）膜。
与硝酸纤维素膜相比，聚合物膜具有更好的机械强度和耐用性，能更好地保留蛋白质分子的完整性。
另外，为了提高免疫印迹法的灵敏度和特异性，研究者们开始使用荧光标记的二抗和化学发光等新型探针。
这些探针能够与特异性抗体发生结合，并产生明亮的荧光或发光信号，从而在低浓度蛋白的检测中提供更高的灵敏性和检测精度。
三、自动化技术的应用随着计算机和自动化技术的飞速发展，免疫印迹法的实验操作也得到了极大的简化和提高效率。
自动化的蛋白质分离装置和转印装置的出现，使得整个实验过程更加标准化和稳定。
同时，计算机软件的运用，实现了蛋白质分析图像的定量化和数据分析结果的自动处理，大大提高了免疫印迹法的效率和可靠性。
四、多通道技术的发展在免疫印迹法的发展历程中，多通道技术的出现使得同时检测多个蛋白质成为可能。
传统的免疫印迹法需要进行多次染色和检测，而现在，研究者可以利用多通道技术，在同一膜上同时检测多个目标蛋白质，大大提高了实验效率。
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法，又称蛋白质印迹或Western Blotting，是一种利用抗
原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
以下是其基本步骤：
1. 取样：取上清液作为样品。
2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3. 转移：通过半干式转移，将电泳后的凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这个过程包括割胶、平衡、膜处理、转膜等步骤。
其中，转膜是关键步骤，需要将凝胶上的蛋白质精确转移到NC膜上，滤纸、凝胶、NC膜需要精确对齐，
去除气泡，并在恒流1mA/cm2下转移小时。
4. 免疫检测：在转移后的膜上，利用抗体进行检测。
这一步通常包括一抗和二抗的结合，以及通过化学发光检测或其他方法检测到结合的抗体。
5. 结果分析：通过对比染色结果和标准条带，可以分析出样品中特定蛋白质的表达情况。
此外，阴性对照是以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
以上信息仅供参考，具体步骤可能会根据实验需求和条件有所不同，建议咨询专业人士获取具体信息。
免疫印迹法的实验技术
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体 上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种 方法。
Western Blot 印迹方法，是检测蛋白质混合 液体中某种特定目的蛋白的定性方法，也可作为 确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不 同条件下的相对含量的半定量方法。
实验主要内容：
注意事项
玻璃板要清洁,对齐卡严，防止漏胶。 丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性并容 易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量或配胶时应戴 手套及口罩 . 过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制. 溶液中一旦加入TEMED，应立即混匀并快速灌注入玻璃 夹槽中 . 浓缩胶缓冲液(PH为6.8)、分离胶缓冲液(PH8.8)， PH值要准确。 胶灌入前要充分混匀，灌胶要缓慢,避免有气泡的产生. 为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的电泳上 样缓冲液. 正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证蛋白由 上向下方向电泳。
根据待测样品的蛋白质分子量选择分离胶和浓缩胶的浓度. （一般浓缩胶为5%，分离胶根据所测蛋白分子量定）
凝胶浓度（％）
Hale Waihona Puke 线性分离范围（KD)15 10
12-43 16-68
7.5
5.0
36-94
57-212
作用
浓缩胶：当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽 的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动 界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物 向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶， 使样品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚 集成一条很薄的区带（或称积层）（0.51cm）。
凝胶电泳
样品的印迹
免疫学检测
实验步骤 提取细胞或组织蛋白→测定蛋白
实验报告三 免疫印迹
实验三：免疫印迹1 原理免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
本试验采用湿法转移。
免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。
大多数应用前者。
本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。
目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。
本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。
2 试剂与仪器2.1 试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1 转移缓冲液Tris 3.025g甘氨酸14.413g甲醇20mL加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)Tris 2.42gNaCl 27.750g加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL2.1.3 TTBSTBS 800mLTween-20 400μl2.1.4 封闭液及抗体稀释液脱脂奶粉0.3gTBS 100mL2.1.5 底物溶液二氨基联苯胺（DAB） 5.0mgTBS 18mLH2O220μl 临用前配2.1.6 丽春红总蛋白质染色液丽春红1g4%乙酸100mL2.1.7 5%小牛血清生理盐水小牛血清7.5mL0.85%生理盐水定容至150mL2.1.8 酶标抗IgG（1：1500）酶标抗IgG 0.1mL5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2 仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3 试验步骤3.1 SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。
艾滋病实验室检测进展(文献综述)
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辅助诊断，后者常用于监测ｍＶ感染者的病程进展和抗病毒 治疗效果。ⅢＶ核酸定性检测通常使用ＰｃＲ或逆转录ＰｃＲ （ＲＴ—ＰＣＲ）技术，使用分子生物学实验室通用的基因扩增试 剂，引物可来自文献或自行设计，应尽量涵盖所有的或常见
酶（ＨＩｕＰ）标记的刖抗体，在抗原上又结合了酶标记的抗
体，加底物显色后，在酶标仪上读结果。近年来为了提高检 测血清中Ｐ２４抗原的敏感性，将血清中免疫复合物解离 （ＩＣＤ）后再进行测定，发展了ＩｃＤ Ｐ２４抗原测定试剂，用于 ｌ玎ⅣＰ２４抗原测定。
５卸Ⅳ细胞培养
常规方法是将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同
ｍ～批准使用第１代ＥｕＳＡ检测试剂，第ｌ代试剂主要以病
毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板，以检测血清中 的抗体。由于包被的抗原不很纯，假阳性率较高，结果不令 人满意。１９９０年，第２代试剂应运而生，该试剂使用基因工 程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原 的使用，特异性有了很大提高。１９９２年美国研究出第３代试
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免疫印迹技术实验报告
免疫印迹技术实验报告免疫印迹技术实验报告引言：免疫印迹技术是一种广泛应用于生物学研究领域的实验方法，通过检测目标蛋白在细胞或组织中的表达情况，可以帮助科学家深入了解生物体内的分子机制。
本文将介绍我们在实验室中使用免疫印迹技术的实验过程和结果，以及对实验结果的分析和讨论。
实验材料与方法：我们使用了以下材料和方法进行实验：1. 细胞或组织样本：我们选择了人类肺癌细胞系A549作为研究对象，同时还使用了正常肺组织作为对照组。
2. 蛋白提取：利用细胞裂解液将细胞或组织中的蛋白质释放出来。
3. SDS-PAGE凝胶电泳：将蛋白样品分离成不同大小的带状蛋白条带。
4. 转膜：将分离的蛋白迁移到聚合物膜上，以便进行后续的免疫检测。
5. 免疫检测：使用特异性抗体对目标蛋白进行检测，并使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗进行信号放大。
6. 显色：通过添加显色底物，使目标蛋白在免疫印迹膜上形成可见的带状条带。
7. 图像获取与分析：使用化学发光成像系统获取免疫印迹膜上的图像，并使用图像分析软件进行定量分析。
实验结果：在实验中，我们成功地提取了A549细胞和正常肺组织中的蛋白质，并进行了SDS-PAGE凝胶电泳分离。
通过免疫检测，我们发现在A549细胞中，目标蛋白X的表达水平明显高于正常肺组织。
此外，我们还观察到在A549细胞中，目标蛋白Y的表达水平也有所上调。
对实验结果的分析与讨论：通过实验结果的分析与讨论，我们可以得出以下结论：1. 目标蛋白X在肺癌细胞中的过度表达可能与肺癌的发生和发展有关。
这一发现与之前的研究结果相符，进一步验证了目标蛋白X在肺癌中的重要作用。
2. 目标蛋白Y的上调表达可能与肺癌细胞的增殖和侵袭能力增强有关。
这一发现为进一步研究目标蛋白Y在肺癌发展中的功能和机制提供了线索。
进一步研究的展望：基于本次实验结果，我们提出了以下进一步研究的展望：1. 探究目标蛋白X在肺癌细胞中的功能和调控机制，以揭示其在肺癌发展中的具体作用。
免疫印迹介绍及试验过程
免疫印迹免疫印迹免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Westernblotting）,是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。
免疫印迹法的基本原理将混合抗原样品在凝胶板上进彳t单向或双向电泳分离，然后取固定化基质膜与凝胶相贴。
在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下，使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上，并且固相化。
最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等，对抗原固定化基质膜进行检测和分析。
免疫印迹法的基本步骤免疫印迹法（以抗原分析为例）基本上可分为抗原分离、抗原印迹和抗原检定三个步骤。
在每一步中因采用的具体实验方法不同，可构成多种免疫印迹分析系统。
免疫印迹法的优点免疫印迹法是一项分析抗原、抗体的技术。
它具有下列优点：1、湿的固定化基质膜柔韧，易于操作；2、固定化的生物大分子可均一的与各种免疫探针接近，不会象凝胶那样受孔径阻隔；3、免疫印迹分析只需少量试剂；4、孵育、洗涤的时间明显减短；5、可同时制作多个拷贝，用于多种分析和鉴定；6、结果以图谱形式可长期保存；7、免疫探针可通过降低PH值等方法，象抹去录音磁带一样将探针抹掉，再换用第二探针进行分析检测。
免疫印迹法的应用范围及优点不仅局限于此，它必将随着这一方法的深入研究而不断发展和完善。
免疫印迹免疫印迹又常称Westernblot,是一综合性的免疫学检测技术。
它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进行免疫学检测。
immunoblotting免疫印迹法 -回复
immunoblotting免疫印迹法-回复什么是免疫印迹法（immunoblotting）？免疫印迹法（immunoblotting）是一种分析蛋白质的方法，用于检测目标蛋白质在样本中的存在、确定其分子量以及评估其表达水平。
该技术基于免疫学原理，利用抗体对特定的蛋白质进行特异性检测。
免疫印迹法的步骤如下：步骤一：样品制备在进行免疫印迹分析之前，需要从细胞或组织样本中提取蛋白质。
样品制备可以通过细胞裂解和组织破碎等方法来完成。
裂解细胞的方法包括机械裂解、声波裂解和化学裂解等，这会释放细胞内的蛋白质。
组织样本通常需要经过液氮的冷冻-解冻循环，配合高速离心和组织破碎试剂进行组织破碎，以获得蛋白质。
步骤二：蛋白质分离提取的蛋白质需要通过电泳方法进行分离。
常用的电泳方法有SDS-PAGE 和Native PAGE。
其中，SDS-PAGE在分离蛋白质时使用SDS（十二烷基硫酸钠）使其带负电荷，从而实现蛋白质按照分子量大小进行分离。
NativePAGE则不使用SDS，保留了蛋白质的原有电荷和构象，适用于研究蛋白质间的相互作用和酶活性等性质。
步骤三：蛋白质转移分离的蛋白质需要被转移到膜上用于后续的免疫检测。
这一步骤称为电转印（electroblotting），通常使用半干式或湿式转印两种装置进行转印。
在转印过程中，将凝胶和膜以规定的条件接触并传送蛋白质，使之迁移到膜上。
通过这一步骤，蛋白质被定位到膜上并准备进行免疫检测。
步骤四：蛋白质检测转移膜上的蛋白质现在可以进行特异性的免疫检测。
在这一步骤中，转移膜需要被封闭以避免非特异性抗体的结合，并与目标蛋白质特异性结合的一抗孵育。
一抗的选择应基于研究者所需表达的目标蛋白质。
一旦一抗与特定蛋白质形成特异性结合，未结合的一抗需要被洗去。
接下来，可以使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等二抗来进一步检测目标蛋白质。
这些二抗与一抗发生特异性结合，形成二抗-一抗复合物，可被检测出来。
免疫印迹法
辣根过氧化酶相关显色法原理： 二抗上面带有辣根过氧化酶HRP，其能够显色底物显色以及能够使 发光基团发光，从而达到显色的目的。 常用的HRP显色方法有两种：1.底物显色法(DAB显色法） 2.化学发光显色法（ECL显色法）
1.底物显色法（DAB显色法）
特点：3‘3’二氨基联甲苯胺（DAB)是底物显
原理
经过PAGE分离的蛋白质样品， 转移到固相载体（例如硝酸纤 维素薄膜）上，固相载体以非 共价键形式吸附蛋白质，且能 保持电泳分离的多肽类型及其 生物学活性不变。以固相载体 上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体 起反应，经过底物显色或放射 自显影以检测电泳分离的特异 性目的基因表达的蛋白成分。
特点：HRP能激发化学发光显色底物发光，通过对X线胶片的曝 光，显影定影从而达到显色的目的。灵敏性很高且比较安全。
发光底物的配制： 2ml的A液+2ml的B液+6ml的SW。 摇床上与NC膜避光孵育5分钟。
总结
SDS-PAGE电泳分离蛋白 转膜
过夜封闭 PBST洗3次，每次15分钟 一抗孵育2小时 PBST洗3次，每次15分钟 酶标二抗孵育1小时 PBST洗3次，每次15分钟 DAB显色底物显色法显色 ECL显色法
或小鼠。
清洗：一抗孵育好后，再次用PBST清洗3次左右，每次约15分钟。以
除去未结合的一抗。
二抗孵育：清洗好后，加入二抗标记1小时左右。二抗根据一抗的来源
选择适合的羊抗兔或羊抗鼠。
清洗：二抗标记好后，用PBST清洗3次左右，每次约15分钟。以去除
未特异性结合的二抗。
显色
放射性核素检测
显色方法
辣根过氧化酶相关显色法 碱性磷酸酶法
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免疫印迹法近年发展综述
摘要：简述了免疫印迹法的原理和方法，并对近年来的应用作了简要概括，使读者能对免疫印迹法的近年发展有一定的认识，并对其未来的发展作展望。
关键词:免疫印迹法小分子蛋白间接疫荧光法 HIV抗体糖尿病
前言：蛋白免疫印迹法自发明以来，发展迅猛，本文对其近年来的发展作了简要概述。
正文：
1原理
蛋白免疫印迹技术(Westernblot)由美国斯坦福大学的乔治·斯塔克发明，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白样品进行着色，再通过分析着色的位置和深度获得目的蛋白在样品中的表达情况信息[1-3]。
蛋白免疫印迹技术集凝胶电泳、蛋白转印和免疫学标记等三部分于一体，在现代生物医学中广泛应用[4,5]。
2方法简述
该项技术通过聚丙酰胺凝胶电泳分离目的蛋白质标本，并将其转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜，聚偏二氟乙烯膜等）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相对应的单克隆或者多克隆抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗起反应，经过底物显色检测电泳分离的特异性目的蛋白成分与含量[6-8]。
3应用
蛋白免疫印迹法自发明以来被广泛应用于现代生物学研究中的蛋白质定性和半定量分析[9]。
3.1免疫印迹法、酶联免疫法及放射免疫法对胰岛自身抗体检测的比较
采用免疫印迹法测定81例糖尿病患者胰岛自身抗体,将结果与酶联免疫法测定的GAD-A、ICA,放射免疫法测定IAA结果进行比较。
结论是放射免疫法检测IAA、酶联免疫法检测ICA阳性率均高于免疫印迹法,免疫印迹法检测GAD-A阳性率则高于放射免疫法[10]。
3.2检测小分子蛋白的实验条件优化研究
探讨免疫印迹法不同参数对小分子蛋白检测效果的影响，从而优化并获得最佳实验条件。
方法：比较不同转膜电压和时间、转移缓冲液甲醇含量、不同化学发光剂对小分子蛋白的检测效果。
结论是选用高电压、短时间组合，选择含20%甲醇转移缓冲液和飞克级化学发光剂信号均有助于小分子蛋白免疫印迹检测[11]。
3.3间接疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果的分析比较
比较间接免疫荧光法筛查抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱（谱）特异性抗体结果的一致性，分析二者的相互关系及临床意义。
结论是两种检测无统计学差异，但法对的筛查具有覆盖谱抗体面广的特点，而特异性自身抗体检测具有疾病特异性和较高的检测敏感性，并且两种方法学间存在检测敏感性和特异性的差异[12]。
3.4 HIV抗体不确定血清蛋白免疫印迹法检测条件的正交实验优化及应用
优化蛋白免疫印迹法（WB）对艾滋病病毒（HIV）抗体不确定血清的检测条件,并测试其检测效能。
以样本量100μＬ、样本孵育时间2小时、酶联合物孵育时间15分钟,为HIV抗体不确定血清的最优检测条件；同标准检测条件相比,优化检测条件对HIV阴性或阳性血清的检测效能一致，但对19例HIV抗体不确定血清的检测效能更高[13]。
3.5化学发光酶免疫法和免疫印迹法检测糖尿病自身抗体的结果分析
对比分析化学发光酶免疫法和免疫印迹法在糖尿病自身抗体检测中的应用效果。
结论CLISA法检测糖尿病自身抗体敏感性及特异性较IB法高，值得在糖尿病诊断中推广应用[14]。
3.6免疫印迹法的改良
通过改变添加抗体方式的不同达到改良的目的。
不同总量蛋白的免疫印迹法显并无显著性差异。
但是，相比常规方法改进法使用的抗体量更少，条带更容易检测得到。
结论：改进后的免疫印迹法能有效的节约抗体，操作方便，实用性强[15]。
结论:综上所述，免疫印迹法在蛋白质的检测方面有着重要作用，尤其在
医疗方面的应用有着巨大的影响和发展空间，近年来在这方面有许多研究。
其发展潜力是较大的，但目前更偏向于应用，未来可能在不同的蛋白质研究和人类疾病方面深入发展，以往的技术已较为成熟，对免疫印迹法的改良也可能还会做出更多成果。
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