色谱分析方法发展

二、非挥发性、热稳定性差样品的分离模式
1. 不能采用GC分离模式的化合物首先采用反相液相色谱模式
分子体积较大的样品如蛋白质分子，采用大孔径的固定相吸附剂
柱子 分离酸性样品如含有COOH,SO3H, H2PO4基团，通常采用乙 碱性样品如含有-NH2,NH基团，通常调节pH到中性或弱碱性抑 制样品的解离，增加保留值。
采用孔径与分子尺寸匹配的筛分填料，样品分子体积越大，采用 的填料的孔径也越大。
疏水性样品分离，固定相采用表面疏水性填料，流动相采用疏水
性溶剂；亲水性样品用亲水性溶剂和固定相进行分离，避免发生 吸附分配、离子交换等非体积排阻保留机理。 分子量标定，采用系列聚苯乙烯或不同亲水基团取代的标准分子 量化合物。
三、样品以定性分析为主、兼快速、高分辨分析模式
1 阴、阳离子的分离首先采用区带电泳模式
无机、有机阴离子样品，采用pH 7-10的碱性缓冲溶液，如磷酸
盐、硼砂等。无机、有机阳离子采用中性、酸性缓冲溶液，克服 由于出峰太快造成的分离度的下降。
疏水性离子在缓冲溶液中加入有机溶剂如甲醇、乙腈、异丙醇等，
增加样品的溶解度；同时加入有机溶液还可以改变出峰次序和分 离的选择性并降低EOF值
第四章 色谱分析方法发展
1.1 色谱分析的优先条件 1.2 色谱分离模式和柱系统选择指标 1.3 常规色谱不能分离的样品
1.4 色谱分离模式、柱系统选择的基本原则
第一节 色谱分析的优先条件
实际样品分析问题
色谱分离模式
色谱柱
流动相与添加剂
检测方法
如何 建立一个正确的色谱分析方法 及分离模式选择和条件要求
3. 大于85个碳 的烷烃或相当保留的同系物无法采用1万塔板的液 相色谱柱子分离。
异构体：分子组成相同、 但结构和性质不
同的两种或多种化合物之一 结构异构：由于化合物具有不同的原子连接顺
序而产生的同分异构现象，与立体异构相对。
结构异构体又可分为链异构、位置异构和官能 团异构三类。
4. 大于35个碳的烷烃与烯烃混合物无法采用液相色谱有效分 离。液相色谱对链状化合物的异构体的区分能力较弱，相同 碳数的同族化合物常常只出一个峰。 5. 链状化合物中的非极性位置异构体，一般不能用液相色谱获 得有效分离。 6. 芳烃类烷基取代的间对位位置异构体尚不能得到有效分离。 对于非极性化合物或非极性取代基团的位置异构体，液相色谱区 分能力较差 液相色谱分离主要通过色散作用、偶极作用和氢键作用差 别，而非极性异构体没有偶极（烷烃）或偶极极小（芳 烃），也不含氢键，不足以取得分离。 硅胶正相色谱是液相色谱中唯一区分异构体能力较强的分离模式。
异构体等难分离的组分分离不理想是，可以采用非水溶剂减少电
渗流。 对于容易吸附在管壁的样品，如疏水性蛋白质等，采用管壁涂层 方法减少样品吸附；也可采用三乙胺缓冲溶液，减低吸附；加入 胶束等表面活性剂也能防止样品吸附。
三、样品以定性分析为主、兼快速、高分辨分析模式
1 阴、阳离子的分离首先采用区带电泳模式
样品分析的目的
样品分析以定性分析为主，样品用量 少，样品组分较复杂，对定量准确性 要求不很高
样品分析以定量分析为主
毛细管电泳
液相色谱
•多种模式均可以选择时，选择原则是分析速度快、效率高。
第二节 色谱分离模式和柱系统选择指标
总体选择原则
第一、样品组分必须有合适的保留值范围
第二、流出组分间要有合适的分离度
极高沸点烷烃等物质采用高温色谱柱
手性异构体或光学异构体采用手性固定相分离
二、非挥发性、热稳定性差样品的分离模式
1. 不能采用GC分离模式的化合物首先采用反相液相色谱模式 链状化合物疏水性碳链的碳原子数与亲水性官能团的数目之比值 比较大时可采用反相液相色谱模式。（对于含有一个-COOH,OH,-NH2,-CN等强亲水性官能团的化合物，通常需要4个以上的
一、挥发性、热稳定性样品的分离模式
2. 其它挥发性的化合物采用气-液色谱模式 低碳烃类异构体采用Aqulane 或OV-101类非极性固定液分离
不同类化合物分离采用弱极性柱子
芳烃、卤代芳烃如多氯联苯类样品采用氰基聚硅氧烷等专用柱子 农药类低挥发性物质采用弱极性高温低流失柱子 酸性化合物采用EEAP酸性柱子 碱性化合物采用PEG碱性主子
冲溶液，有利于UV检测。 需要在酸性条件下分离的样品，采用CTAB作为胶束相；浓度较 大时，该体系的EOF方向会发生逆转，电泳电极需要交换。
三、样品以定性分析为主、兼快速、高分辨分析模式
1 阴、阳离子的分离首先采用区带电泳模式
2. 中性有机物样品和疏水性离子采用胶束电动色谱分离模式
样品分离不理性是，加入乙腈、异丙醇等有机溶剂改变双键、极 性、氢键作用能调节分离选择性。但加入有机溶剂会减小胶束与
EOF之间的迁移时间窗口。
对于强疏水性样品，采用微乳液电动色谱（MEEKC）增加分离 选择性，还可以增加迁移时间窗口，通常在胶束体系中加入正丁
醇和异辛烷形成微乳相。
三、样品以定性分析为主、兼快速、高分辨分析模式
1 阴、阳离子的分离首先采用区带电泳模式
2. 中性有机物样品和疏水性离子采用胶束电动色谱分离模式
样品分离不理想，采用涂层可以消除电渗流，也可以把电渗流反
向。 样品采用ESI-MS检测，采用HAC/NH4AC或NH4HCO3,NH4CL
等挥发性盐作为缓冲溶液。
2. 中性有机物样品和疏水性离子采用胶束电动色谱分离模式 一般中性分子样品或离子，采用大于临界胶束浓度（10-100mM）
的SDS碱性缓冲溶液分离，采用5-50mM的磷酸盐或硼砂作为缓
适合哪种色谱分析？
• 被分离组分有足够的挥发性和足够的热稳定性，应首选气相色 谱分离模式（GC柱效通常比LC柱效高一个数量级，而且分析速度快、重复
性好、成本低）
样品组分是气体或极易挥发的小分子化合物，首选GSC模式 否则选择GLC分离模式（更适合挥发性适中和低挥发性的物质）
能否用GC分析的关键问题
2. 不能采用反相液相色谱模式的样品采用键和正相色谱或硅胶正相
模式 硅胶正向的弱溶剂通常是正己烷
样品含有OH,COOH，NH2, NH, 等质子给予体的基团，应原则
异丙醇作为流动相 样品含有COOR,NO2,CN 等质子接受体的基团，应采用乙酸乙
酯、丙酮、乙腈作为流动相。
样品中含有-O-, -Ph等基团，采用乙醚作为流动相。 样品中含有-H2PO4, -COOH, -OH, -NH2等氢键基团，在异丙醇 中加入适量乙醇、乙腈、甲醇等。
CH2基团才能有足够大的保留值）
疏水性芳烃的环数与亲水性官能团数目之比较大时才可以采用反 向液相色谱模式。
样品化合物在官能团、氢键上有差别的采用甲醇/水作为流动相；
富含双键且双键位置、极性有差别的化合物采用乙腈/水，也可 采用苯基键和固定相；富含醚键、酯类化合物在上述体系中加入 四氢呋喃作为流动相。
第三、分析时间要短、要在合理的范围之内
一、样品组分流出的保留值范围 在恒温条件下，色谱峰的半宽度可表示为
W1/ 2 2.345 t0 (1 k ) / N
'
毛细管气相色谱： 30m柱长，10万塔板数，t0=100s，为保证相差一个碳数的化合 物完全分离（Rs>1.5），合适的保留值范围为0.2<k<20. 液相色谱： 20cm柱长，1万塔板数，t0=200s，为保证化合物完全分离 （Rs>1.5），合适的保留值范围为0.4<k<30. 毛细管液相色谱（尤其是整体柱的使用）： 柱长和柱效增加，保留值范围与气相色谱接近。
样品是否适合色谱分析？
• 色谱主要解决两种以上混合物的分离问题，单一样 品无须采用色谱进行分析 • 样品组分在色谱分离过程中发生分解、聚合、与色 谱系统发生化学反应的物质不适合用色谱分析 • 样品组分在色谱体系中必须能够以分子或离子状态 分散在两相之间，凡是发生凝结、沉淀、相分离 （不能溶解）等物理化学现象不能进行正常的色谱 分离
酸、乙酸盐、磷酸盐缓冲液调节流动相的pH使之低于样品的pKa；
分离含有NH2,NH,N基团的化合物通常需要加入有机胺，抑制氨
基与固定相表面的硅羟基相互作用。 ห้องสมุดไป่ตู้离光学异构体采用手性固定相或在流动相中加入手性试剂，也 可以两者同时使用手性选择因子进行分离
二、非挥发性、热稳定性差样品的分离模式
1. 不能采用GC分离模式的化合物首先采用反相液相色谱模式
挥发性和热稳定性
• 挥发性的判断
挥发性可以用样品组分在色谱柱或仪器所允许的最高使用温 度下所具有的蒸汽压大小来判断，通常认为在该温度下样品
具有10mmHg分压就可能从色谱柱中流出。通常在试剂应用
时，考虑到化合物的极性等综合因素对蒸汽压的影响，认为 2~10个mmHg的蒸汽压即可进行气相色谱分析。
适合哪种色谱分析？
适合哪种色谱分析？
•若选择液相色谱分离，则首选反相液相色谱模式 对于反相液相色谱不能分离的中性化合物，采用正向液相色 谱模式； 对于离子型化合物通常采用反相离子对色谱模式或离子色谱 能否用LC分析的关键问题
分离度：是否有足够的保留值是 决定能否被分离的主要因素之一
适合哪种色谱分析？
•选择液相色谱模式还是毛细管电泳模式？
二、非挥发性、热稳定性差样品的分离模式
3. 反相不能分离的离子型化合物采用反相离子对色谱模式 采用C18或C8填料作为固定相，采用甲醇/水或乙腈/水作为流动 相，分离阴离子时加入阳离子对试剂；分离阳离子时加入阴离子 对试剂。 4. 不宜用反相离子对模式分离的样品采用离子色谱模式
5. 对于合成聚合物或天然大分子化合物采用体积排阻色谱模式
• 被分离组分有足够的挥发性和足够的热稳定性，应首选气相色 谱分离模式 •如果不能采用气相色谱分析则选择液相色谱或毛细管电泳分离 模式 •若选择液相色谱分离，则首选反相液相色谱模式 反相液相色谱相对其它液相模式具有较多优势 （分离效率高、定性定量的重复性好、柱子溶剂的选择简单、 成本低等） 液相色谱所分析的样品中80%以上是采用反相液相色谱。
• 对于固体及其颗粒物，以及胶体状态的物质，必须进行溶解分 散才能进行色谱分离 悬浮固体、胶体微粒的分离可以直接采用FFF（FIELD FLOW FRACTIONATION)方法进行分离。 • 对于无机化合物如金属或无机盐的混合物分析，通常在溶解后 可以采用离子色谱或电泳分析，也可以采用原子光谱分析；特别 是金属阳离子与一些无机元素混合物采用ICP(INDUCTIVELYU COUPLED PLASMA SPECTROSCOPY)等光谱手段分析更加快速、方便。 • 对于同位素分析，色谱虽具有同位素分离能力，但采用无机质 谱更加准确、快速、便捷。 • 对于无机、有机气体小分子化合物、各种有机化合物、蛋白质、 肽、核酸等大分子物质的简单混合物及其复杂体系样品分离，色 谱具有最佳的分离能力。
二、溶质组分间合适的分离度
影响色谱分辨率Rs的因素主要有：柱效N、容量因子k、选则性因子a
N k 1 Rs ' 4 1 k
'
K越小时，取得相同的分离程度所要求的a值越大； 柱效越低的柱系统，所需的a值也越大
三、分析时间要短
节省时间，提高效率 流出峰展宽小，信噪比提高，增加检测灵敏度
温度梯度（GC） 冲洗剂梯度洗脱（LC） 提高电场强度（CE）
第三节 常规色谱不能分离的样品（不包括CE）
色谱最难分离的化合物是： 异构体、结构异构体、位置异构体、立体异构体等 选择高分辨气相色谱和不同选择性的柱系统均有可能得到分离， 目前尚无法分离的特别异构体系列化合物包括：
1. 链状化合物的主链超过18个碳时，处于链中央的取代基团的位 置异构体，即8位以后的异构体目前尚难以分离。 2. 样品组分数大于色谱柱子的峰容量时，样品不能得到完全分离。
第四节 色谱分离模式、柱系统选择的基本原则 一、挥发性、热稳定性样品的分离模式
气体采用气-固色谱模式
• 低分子量气体采用5A分子筛（PLOT柱子） • 中间分子量气体采用多孔聚合物固定相， Porapak Q，
PLOT柱
• 低碳数烃类化合物采用13X分子筛进行族分离；采用碳分子 筛、多孔聚合物分离异构体；采用AL2o3+ Ag+分离C4正构 异构烯烃。 • 有机胺采用Chromosorb 103等碱性多孔高聚合物固定相。 • 含硫化合物采用多孔高聚合物固定相，也可用多孔硅胶柱 （无水样品）