DNA琼脂糖凝胶电泳分析 ppt课件
合集下载
实验三琼脂糖凝胶电泳ppt课件
2、将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入制胶模具中，直至厚度为4-6 mm，插 入适当的梳子，在室温下冷却凝固。
3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。将凝胶置入电 泳槽中，加0.5TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2 mm。
（二）点样
用微量取液器（P20）吸取质粒DNA样品2 l于点样板小孔中，再加入8 l TE及1 l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉 入点样孔下部。同时点5 l MarkerⅢ作为分子量标准。
5、必须保证琼脂糖充分完全熔解，否则，会造成电泳图像模糊不清。 6、电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，
一般用2-3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。 7、为了节约成本，没有跑过DNA的凝胶部分可切下来重复利用，但反复
熔化会降低分辨效率，建议时向哪一极移动？ 2、什么是迁移率？影响迁移率的因素有哪些？什么是分辨率？
分辨率与凝胶浓度的关系？ 3、DNA荧光染料的发光原理？ 4、质粒DNA存在哪些构型？其迁移率有何差异？ 5、loading buffer成分是什么？各成分有何作用？
注意：如何判断单酶切是否完全？ 如何判断双酶切是否完全？
质粒DNA三种构型：环状超螺旋、开环和线性。 质粒电泳三条带：超螺旋、开环和复制中间体（即2个没有复制完全的质粒 连在了一起）。 同一种酶切后电泳谱带的规律：从高分子量到低分子量条带亮度逐渐减弱 由于DNA Marker与酶切产物所含成分不同，因此迁移率不一定相同！
不同波长的紫外光
短波紫外光：254nm 中波紫外光：302nm 长波紫外光：365nm
1、为什么分光光度计测定的浓度很高，但电泳检测浓度却很低？
GoldViewI GoldViewII
3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。将凝胶置入电 泳槽中，加0.5TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2 mm。
（二）点样
用微量取液器（P20）吸取质粒DNA样品2 l于点样板小孔中，再加入8 l TE及1 l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉 入点样孔下部。同时点5 l MarkerⅢ作为分子量标准。
5、必须保证琼脂糖充分完全熔解，否则，会造成电泳图像模糊不清。 6、电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，
一般用2-3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。 7、为了节约成本，没有跑过DNA的凝胶部分可切下来重复利用，但反复
熔化会降低分辨效率，建议时向哪一极移动？ 2、什么是迁移率？影响迁移率的因素有哪些？什么是分辨率？
分辨率与凝胶浓度的关系？ 3、DNA荧光染料的发光原理？ 4、质粒DNA存在哪些构型？其迁移率有何差异？ 5、loading buffer成分是什么？各成分有何作用？
注意：如何判断单酶切是否完全？ 如何判断双酶切是否完全？
质粒DNA三种构型：环状超螺旋、开环和线性。 质粒电泳三条带：超螺旋、开环和复制中间体（即2个没有复制完全的质粒 连在了一起）。 同一种酶切后电泳谱带的规律：从高分子量到低分子量条带亮度逐渐减弱 由于DNA Marker与酶切产物所含成分不同，因此迁移率不一定相同！
不同波长的紫外光
短波紫外光：254nm 中波紫外光：302nm 长波紫外光：365nm
1、为什么分光光度计测定的浓度很高，但电泳检测浓度却很低？
GoldViewI GoldViewII
DNA琼脂糖凝胶电泳(课堂PPT)
铺胶
凝胶凝固后取出梳子
加缓冲液
准备样品
点样
电泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
照相
对琼脂糖凝胶电泳分离DNA 片段的有效性 的再认识
20
DNA 为多元酸，在中性或弱碱性缓冲 液中带负电荷而向阳极泳动 由于不同 DNA 分子在同一凝胶中迁移速率不一样， 电泳一段时间后可将其分开。
紫外灯下观察照相凝胶冷却至凝胶冷却至5050cc加加ebeb至终浓度至终浓度05gml05gml20对琼脂糖凝胶电泳分离对琼脂糖凝胶电泳分离dnadna片段的有效性片段的有效性的再认识的再认识21dnadna为多元酸为多元酸在中性或弱碱性缓冲在中性或弱碱性缓冲液中带负电荷而向阳极泳动液中带负电荷而向阳极泳动由于不同由于不同dnadna分子在同一凝胶中迁移速率不一样分子在同一凝胶中迁移速率不一样电泳一段时间后可将其分开电泳一段时间后可将其分开
21
22
23
结果
电泳后在日光下(LIGHTBLUE Dye 染色)或在紫外 灯下(溴化乙锭染色)切取含“ 单一” 目的DNA 分 子的胶条并称重，用小量胶回收试剂盒回DNA。
24
25
谢谢观看
26
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子
电泳槽琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳：5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相
溶胶
准备胶槽
凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
状DNA>开环DNA
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
琼脂糖浓度（%） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
质粒的酶切—琼脂糖凝胶电泳分离DNAppt课件
实验二 质粒的酶切、琼脂糖凝 胶电泳分离DNA
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
实验目的
限制性内切酶切割出目的DNA
了解琼脂糖凝胶电泳的原理
掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方 法
实验原理
利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位 点，定点切割环状质粒DNA。
Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝 铂纸包装保存。 4. 10×DN切体系
调制酶切体系如下: (共 20μL)
无菌水 6μL，
质粒
10 μL
Buffer K 2μL,
EcoR I 1μL,
BamH I 1 μL
37℃酶切1.5小时。
琼脂糖凝胶制备
1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 2. 插好挡板、梳子。 3. 根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶
的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml电 泳缓冲液（1×TAE）。 4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至约60℃时，加入溴化乙锭4 μL (终浓 度为0.1 g/l)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查 有无气泡。
纯度；DNA的甲基化程度；温度；缓冲液成分 （DDT，BSA）等。
使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1% 的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb， 750bp，500bp，250bp，100bp。
9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。
10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节 电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳 槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
实验目的
限制性内切酶切割出目的DNA
了解琼脂糖凝胶电泳的原理
掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方 法
实验原理
利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位 点，定点切割环状质粒DNA。
Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝 铂纸包装保存。 4. 10×DN切体系
调制酶切体系如下: (共 20μL)
无菌水 6μL，
质粒
10 μL
Buffer K 2μL,
EcoR I 1μL,
BamH I 1 μL
37℃酶切1.5小时。
琼脂糖凝胶制备
1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 2. 插好挡板、梳子。 3. 根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶
的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml电 泳缓冲液（1×TAE）。 4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至约60℃时，加入溴化乙锭4 μL (终浓 度为0.1 g/l)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查 有无气泡。
纯度；DNA的甲基化程度；温度；缓冲液成分 （DDT，BSA）等。
使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1% 的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb， 750bp，500bp，250bp，100bp。
9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。
10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节 电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳 槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。
最新细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳_图文ppt课件
SDS（十二烷基硫酸钠）：破细胞膜、核膜，使组织蛋白与DNA 分离
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：抑制DNA酶活性，确保目的DNA 不再降解
Proteinase K：使染色质上蛋白质与DNA分离，并进一步降解为小 肽/氨基酸
酚、氯仿：抽提除去蛋白质 异丙醇：沉淀DNA Goldview：DNA萤光染料，与DNA结合形成一种光络合物，在紫
方法
一、胸腺细胞的制备： 小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含5－
10%小牛血清的1640培养液中，置铜网上研磨， 将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm， 离心5min，制成1×107细胞悬液备用。
二、提取胸腺细胞DNA：
⑴裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、 RNaseA/蛋白酶K液=A液）
线粒体的改变
• 线粒体检测： 激光扫描共聚焦显微镜检测1）线粒体通透性转
换（MPT），2）线粒体内膜去极化， 3）钙离子 流改变，4）线粒体氧化还原状态等。 缺陷：不能区分凋亡和坏死
• 细胞色素C释放： 荧光显微镜/电镜观测
缺陷：细胞色素C释放到胞浆后不稳定。
• 发育
凋亡的生理学意义
凋亡的生理学意义
• 将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入 100μlL液和20μlA液，充分混匀，置于55℃温浴 20分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。
(2) 结合DNA阶段(使用到的试剂: 结合缓冲液=B液、 3MNaAC, pH4.8)
• 加入10μl 3MNaAC，随后加入1250μl B液，充分 振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心3min。 将上清分2次加入到离心吸附管。静置1分钟， 12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液。第二次 同上，静置1分钟，离心30s。
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：抑制DNA酶活性，确保目的DNA 不再降解
Proteinase K：使染色质上蛋白质与DNA分离，并进一步降解为小 肽/氨基酸
酚、氯仿：抽提除去蛋白质 异丙醇：沉淀DNA Goldview：DNA萤光染料，与DNA结合形成一种光络合物，在紫
方法
一、胸腺细胞的制备： 小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含5－
10%小牛血清的1640培养液中，置铜网上研磨， 将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm， 离心5min，制成1×107细胞悬液备用。
二、提取胸腺细胞DNA：
⑴裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、 RNaseA/蛋白酶K液=A液）
线粒体的改变
• 线粒体检测： 激光扫描共聚焦显微镜检测1）线粒体通透性转
换（MPT），2）线粒体内膜去极化， 3）钙离子 流改变，4）线粒体氧化还原状态等。 缺陷：不能区分凋亡和坏死
• 细胞色素C释放： 荧光显微镜/电镜观测
缺陷：细胞色素C释放到胞浆后不稳定。
• 发育
凋亡的生理学意义
凋亡的生理学意义
• 将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入 100μlL液和20μlA液，充分混匀，置于55℃温浴 20分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。
(2) 结合DNA阶段(使用到的试剂: 结合缓冲液=B液、 3MNaAC, pH4.8)
• 加入10μl 3MNaAC，随后加入1250μl B液，充分 振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心3min。 将上清分2次加入到离心吸附管。静置1分钟， 12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液。第二次 同上，静置1分钟，离心30s。
琼脂糖凝胶电泳 ppt课件
• 有热可逆性
• 机械强度差，易破碎，浓度 不能太低。
• 易被细菌污染，不易保存， 临用前配制。
• 琼脂糖支持层上的区带易于 扩散，电泳后必须立即固定 染色。
• 与PAGE相比，分子筛作用小， 区带少。
9
ppt课件
琼脂糖凝胶的配置
1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶 缓冲液。一般为 1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相 同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电 泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂 糖粉。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电 泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加 热。微波炉中加热时间不宜过长。
2) 分子大小相近的DNA带不 增加电泳时间，核准正确的凝胶
易分辨
浓度
DNA带缺失 3) DNA 变性
电泳前请勿高温加热DNA链，以 20mM NaCl Buffer稀释DNA
4) DNA链巨大，常规凝胶电泳 在脉冲凝胶电泳上分析 不合适
31
注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水 分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。
6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置 于电泳槽中进行电泳。
注意： 凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃ 下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5 天。
11
ppt课件
琼脂糖凝胶缓冲液
电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后 在冰上冷却5分钟
不规则DNA带迁移 2) 电泳条件不合适
电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃； 经常更换电泳缓冲液
• 机械强度差，易破碎，浓度 不能太低。
• 易被细菌污染，不易保存， 临用前配制。
• 琼脂糖支持层上的区带易于 扩散，电泳后必须立即固定 染色。
• 与PAGE相比，分子筛作用小， 区带少。
9
ppt课件
琼脂糖凝胶的配置
1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶 缓冲液。一般为 1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相 同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电 泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂 糖粉。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电 泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加 热。微波炉中加热时间不宜过长。
2) 分子大小相近的DNA带不 增加电泳时间，核准正确的凝胶
易分辨
浓度
DNA带缺失 3) DNA 变性
电泳前请勿高温加热DNA链，以 20mM NaCl Buffer稀释DNA
4) DNA链巨大，常规凝胶电泳 在脉冲凝胶电泳上分析 不合适
31
注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水 分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。
6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置 于电泳槽中进行电泳。
注意： 凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃ 下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5 天。
11
ppt课件
琼脂糖凝胶缓冲液
电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后 在冰上冷却5分钟
不规则DNA带迁移 2) 电泳条件不合适
电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃； 经常更换电泳缓冲液
动物医学生化实验《实验七 琼脂糖凝胶电泳分离DNA》课件
【 器材 】 1．电泳槽 。 2．制胶槽。 3．电泳仪 。 4． 加样枪。
【操作】
1．制胶 ：取琼脂糖1 g，加入100ml TBE缓冲 溶液 ；微波炉中熔化，冷至50℃~60℃，倒 入制胶槽；胶凝固后（约10~15min），转至 电泳槽中，加入TBE缓冲溶液。
2．加样：取DNA样品10μL，加 2μL核酸凝胶染 色剂，混匀，上样。
每种DNA样品所处的确切位置需要用 溴乙啶（ethidium bromide，EB）才能 确定。
溴乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检 出10ng甚至更少的DNA。
【 试剂】
1．TBE×l0缓冲溶液 。 2．Gel-Dye SuperBuffer Mix核酸凝
胶染色剂。(溴乙啶替代品) 3．标准相对分子质量DNA。 4．琼脂糖。 5．样品DNA 。
实验七 琼脂糖凝胶电泳分离DNA
【原理】 利用不同长度的DNA片段在琼脂糖凝胶中表
现出不同的迁移率，因而可依据DNA分子的大 小将它们分开。
一般琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2～ 50kb范围内的DNA片段。
琼脂糖凝胶具有操作方便、制备容易快速、 凝胶机械性能好、分离DNA片段范围广等特点。
琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅 0.5～1ug。凝胶浓度与被分离DNA样品 的相对分子质量成反比关系，一般常用的 凝胶浓度为1%～2%。：电泳结束，将凝胶转至凝胶成像 仪中观察结果，记录。
DNA的琼脂糖凝胶电泳分析ppt课件
❖ 上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；
❖ 如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘 效应 ，中间电场比较均匀 ；
❖ 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；
❖ 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电 ห้องสมุดไป่ตู้孔内 ；
❖ 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调 高电压。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
琼脂糖凝胶 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 浓度（％）
可分辨的线
10~ 7~ 6~ 4~ 3~
性DNA大小 60~5 20~1 0.8 0.7 0.4 0.2 0.1 范围（kb）
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
❖ 2、 50×TAE电泳缓冲液：称取242gTris碱 （即三羟甲基氨基甲烷， Tris为弱碱，在室 温（25℃）下，它的pKa为8.1；根据缓冲理 论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到 9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一 般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得 该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于 Tris的pKa的影响 ）， ，加H2O800ml，待 完全溶解后，加57.1ml冰乙酸， 100ml0.5mol/LEDAT（pH8.0），用H2O定 容至1000ml。临用前用H2O稀释成1×TAE 电泳缓冲液。
❖ 如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘 效应 ，中间电场比较均匀 ；
❖ 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；
❖ 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电 ห้องสมุดไป่ตู้孔内 ；
❖ 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调 高电压。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
琼脂糖凝胶 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 浓度（％）
可分辨的线
10~ 7~ 6~ 4~ 3~
性DNA大小 60~5 20~1 0.8 0.7 0.4 0.2 0.1 范围（kb）
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
❖ 2、 50×TAE电泳缓冲液：称取242gTris碱 （即三羟甲基氨基甲烷， Tris为弱碱，在室 温（25℃）下，它的pKa为8.1；根据缓冲理 论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到 9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一 般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得 该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于 Tris的pKa的影响 ）， ，加H2O800ml，待 完全溶解后，加57.1ml冰乙酸， 100ml0.5mol/LEDAT（pH8.0），用H2O定 容至1000ml。临用前用H2O稀释成1×TAE 电泳缓冲液。
DNA的琼脂糖凝胶电泳资料ppt课件
2）琼脂糖呈透明状，无紫外吸收，电泳后的样品可直 接用紫外检测；电泳后区带易染色，样品易洗脱，便 于定量测定。
3）操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进 行电泳。
琼脂糖凝胶电泳的应用
用于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等的电泳分 离。现广泛应用于核酸的研究中。
按相对分子质量大小分离DNA 的凝胶电泳技术，是分析 鉴定基因工程重组DNA 分子的重要实验手段。
是现在通用的许多分子生物学研究方法，如DNA核苷酸 序列分析、限制性内切酶片段分析等的技术基础，受到科 学界的高度重视。
二、试剂与器材
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子
电泳槽
溴酚蓝
取液器
试剂
1、Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液），pH8.3：称取 10.78gTris，5.50g硼酸，0.93g EDTA-Na2溶于去离子水， 定容至1000mL。
图像的实时观测
三、操作方法
1、琼脂糖凝胶液的制备：称1g 琼脂糖，置于三角烧 瓶中，加入100mL TBE缓冲液，瓶口扣上一小烧杯， 加热至微沸，琼脂全部融化。取出摇匀，即为1%琼脂 糖。
注意 要完全融化混匀
2、凝胶板的制备
置水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进水
平板上凹槽内，距一端约0.5cm。梳子底边与水平板表
四、实验结果
打印凝胶电泳图，贴于实验报告上，并对实 验结果进行讨论，分析所测未知DNA的大小。
五、课后研讨题
1、总结本实验操作的关键环节和注意事项。 2、实验所用DNA染料EB具有潜在的致癌性，查阅
资料，查找可替代EB的染料并说明优缺点。 3、查阅资料，举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应
用和发展。
3）操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进 行电泳。
琼脂糖凝胶电泳的应用
用于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等的电泳分 离。现广泛应用于核酸的研究中。
按相对分子质量大小分离DNA 的凝胶电泳技术，是分析 鉴定基因工程重组DNA 分子的重要实验手段。
是现在通用的许多分子生物学研究方法，如DNA核苷酸 序列分析、限制性内切酶片段分析等的技术基础，受到科 学界的高度重视。
二、试剂与器材
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子
电泳槽
溴酚蓝
取液器
试剂
1、Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液），pH8.3：称取 10.78gTris，5.50g硼酸，0.93g EDTA-Na2溶于去离子水， 定容至1000mL。
图像的实时观测
三、操作方法
1、琼脂糖凝胶液的制备：称1g 琼脂糖，置于三角烧 瓶中，加入100mL TBE缓冲液，瓶口扣上一小烧杯， 加热至微沸，琼脂全部融化。取出摇匀，即为1%琼脂 糖。
注意 要完全融化混匀
2、凝胶板的制备
置水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进水
平板上凹槽内，距一端约0.5cm。梳子底边与水平板表
四、实验结果
打印凝胶电泳图，贴于实验报告上，并对实 验结果进行讨论，分析所测未知DNA的大小。
五、课后研讨题
1、总结本实验操作的关键环节和注意事项。 2、实验所用DNA染料EB具有潜在的致癌性，查阅
资料，查找可替代EB的染料并说明优缺点。 3、查阅资料，举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应
用和发展。
细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳PPT课件
与细胞坏死区别
细胞坏死是被动的过程，通常由外界因素如物理、化学损伤引起 ，而细胞凋亡是主动过程，由基因调控。
细胞凋亡的过程
起始阶段
细胞受到凋亡信号刺激，开始进入凋亡过程。
执行阶段
细胞内部发生一系列生化反应，如DNA断裂、蛋白 质降解等。
降解阶段
细胞被分解成小碎片，即所谓的“死亡小体”，随后 被周围的巨噬细胞或邻近细胞吞噬。
物种鉴定
通过DNA琼脂糖凝胶电泳对物种进行鉴定，如 PCR-RFLP、DNA指纹分析等。
细胞凋亡研究
通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡相关的 DNA片段，如梯状带等。
03
细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳检测
细胞凋亡DNA的提取
细胞凋亡过程中，DNA会经历一系列的降解过程， 形成凋亡小体。
提取凋亡细胞中的DNA，是进行琼脂糖凝胶电泳检测 的重要步骤。
凋亡机制探讨
02
结合实验结果，可以探讨细胞凋亡的机制，如内源性途径和外
源性途径等。
影响因素分析
03
分析实验过程中可能影响结果的因素，如温度、pH值、DNA提
取方法等。
实验结论与讨论
01
02
03
实验结论
根据实验结果，可以得出 关于细胞凋亡的结论，如 凋亡诱导剂或抗凋亡剂的 作用效果、凋亡机制等。
实验意义
细胞凋亡的意义
80%
维持内环境稳定
细胞凋亡有助于清除不再需要的 或异常的细胞，维持内环境的稳 定。
100%
发育和组织成熟
在胚胎发育和组织成熟过程中， 细胞凋亡有助于塑造和修剪多余 或异常的细胞。
80%
防御和免疫
细胞凋亡有助于清除被感染或发 生癌变的细胞，从而维持机体的 健康。
细胞坏死是被动的过程，通常由外界因素如物理、化学损伤引起 ，而细胞凋亡是主动过程，由基因调控。
细胞凋亡的过程
起始阶段
细胞受到凋亡信号刺激，开始进入凋亡过程。
执行阶段
细胞内部发生一系列生化反应，如DNA断裂、蛋白 质降解等。
降解阶段
细胞被分解成小碎片，即所谓的“死亡小体”，随后 被周围的巨噬细胞或邻近细胞吞噬。
物种鉴定
通过DNA琼脂糖凝胶电泳对物种进行鉴定，如 PCR-RFLP、DNA指纹分析等。
细胞凋亡研究
通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡相关的 DNA片段，如梯状带等。
03
细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳检测
细胞凋亡DNA的提取
细胞凋亡过程中，DNA会经历一系列的降解过程， 形成凋亡小体。
提取凋亡细胞中的DNA，是进行琼脂糖凝胶电泳检测 的重要步骤。
凋亡机制探讨
02
结合实验结果，可以探讨细胞凋亡的机制，如内源性途径和外
源性途径等。
影响因素分析
03
分析实验过程中可能影响结果的因素，如温度、pH值、DNA提
取方法等。
实验结论与讨论
01
02
03
实验结论
根据实验结果，可以得出 关于细胞凋亡的结论，如 凋亡诱导剂或抗凋亡剂的 作用效果、凋亡机制等。
实验意义
细胞凋亡的意义
80%
维持内环境稳定
细胞凋亡有助于清除不再需要的 或异常的细胞，维持内环境的稳 定。
100%
发育和组织成熟
在胚胎发育和组织成熟过程中， 细胞凋亡有助于塑造和修剪多余 或异常的细胞。
80%
防御和免疫
细胞凋亡有助于清除被感染或发 生癌变的细胞，从而维持机体的 健康。
DNA的琼脂糖凝胶电泳分析
❖ 3、加样：用移液器将质粒DNA3ul与6× 上样缓冲液1ul混匀后加入加样孔，记录点 样顺序。（注意：家央视需将枪头深入加 样孔内再吹出样品，以免样品从凝胶表面 扩散；加样时枪头不要刺穿或碰坏凝胶孔 壁，否则将导致样品将从凝胶底部扩散或 DNA带型不整齐。）
❖ 4、电泳：接通电泳槽与电泳仪之间的电源 （注意正负极，切记DNA样品由负极往正 极泳动，即靠近加样孔德一端应为负极）。 调节电压值5V/cm，开始电泳。当溴酚蓝染 料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。
❖ （3）琼脂糖的浓度 一定大小的DNA片段在不同浓
度的琼脂糖凝胶中的电泳迁移率不同。要有效地分 离大小不同的DNA片段，需选用适当的琼脂糖凝胶 浓度。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离的DNA片段 大小范围见表。
琼脂糖凝胶 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 浓度（％）
可分辨的线
10~ 7~ 6~ 4~ 3~
❖ 加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA 均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色， 从而使加样操作更为便利。
❖ 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲 苯青FF的2.2倍, 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动 的速率约与长300bp的双链线性DNA相同,而 二甲苯青FF在琼脂糖凝胶中移动的速率则与 4kb双链线性DNA相同。
性DNA大小 60~5 20~1 0.8 0.7 0.4 0.2 0.1 范围（kb）
❖ 3、DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应 和分子筛效应，但主要是分子筛效应。在 pH8.0~8.3时，核酸分子剪辑几乎不解离， 磷酸解离，核酸分子带负电，在电泳时向正 极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳 支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和 构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异， 从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。 核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在 紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
DNA的琼脂糖凝胶电泳分析
❖ （2）核酸构型 不同构型的DNA在琼脂 糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子 量相当的情况下，不同构型的质粒DNA 的移动速度次序为：共价闭环DNA＞直 线DNA＞开环的双链环状DNA。这三种 构型的相对迁移速率主要取决于凝胶浓 度，同时也受到电流强度、缓冲液离子 强度等的影响。
❖ （3）琼脂糖的浓度 一定大小的DNA片段在不同浓
实验器材与试剂
❖ （一）器材 ： 电泳槽 电泳仪 微波炉
❖ （二）试剂
❖ 1、 6×上样缓冲液：0.25％溴酚蓝；0.25％ 二甲苯青；30％甘油水溶液。（ 由甘油、溴 酚蓝指示剂以及DNA稳定剂按一定比例混合 而成，经去核酸酶处理，适用于DNA样品的 电泳检测，在自然光线下呈现暗红色，与核 酸样品混合后，受样品pH值的影响，通常变 为蓝紫色。其中的溴酚蓝在不同浓度琼脂糖 凝胶和不同电泳缓冲液中的迁移率不同 ，其 迁移位置可作为DNA条带电泳位置的参照 物。）
4、溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料， 它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝 胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络 合物，使DNA发射的荧光增强几十倍， 电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂 糖中的DNA。
跑出好看的电泳图：
❖ 凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮 的地方看看清澈不清澈 ；
❖ 2、胶板的制备：在制胶槽内插入样品梳，将 凝胶液倒入制胶槽中。待胶凝固后，取出梳 子，将内槽放入电泳槽内。加入1×TAE电泳 缓冲液至电泳槽中，使其没过凝胶表面1 ~ 2 mm。
❖ 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿
型不同的梳板，梳齿宽的点样容积就较小，用于 PCR产物、酶切产物鉴定等。一般来说，上 样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳 条带致密清晰，便于结果分析。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验操作
• 制备琼脂凝胶 • 胶板的制备 • 加样 • 电泳 • 紫外透射仪检测
操作步骤
1. 准备
用蒸馏水将电 泳槽和梳子 冲洗干净， 放在水平桌 面上，并架 好梳子
2. 配制1%琼脂糖凝胶及倒胶
具体步骤： • 三角瓶内：0.6g琼脂糖 +60ml(0.5×TBE) • 煮胶溶解 • 冷却至60℃(不烫手) • 加EB • 倒板 • 室温下充分凝固 • 垂直向上拔出梳子 • 将胶板放入电泳槽 • 向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面1~2nm。
• 该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法 （如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。
• 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶 (Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少 可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定 DNA片段在凝胶中的位置。
• 此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA条带,用于以后的克隆操作。
• 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，
停止电泳
5. 结果观察
• 电泳结束后，将凝胶板取出。 在紫外仪上观察电泳带及其位 置，记录实验结果。
– 银染色
影响琼脂糖凝胶电泳的因素
• DNA分子的大小：实验证明， DNA片段迁移距离与其分子量 的对数成反比；
• 琼脂糖的浓度：一定大小的 DNA片段在不同浓度的琼脂凝 胶中，电泳迁移率不相同；
• DNA分子的构型：不同构型的 DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速 度差别较大
琼脂糖凝胶的优点
(1) 操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理 就可进行电泳。
琼脂糖凝胶
• 天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻 粉
• 从石花菜及其它红藻类植物提取出来 的一种线状高聚物。
琼脂糖（agarose）
琼 脂
琼脂胶（agaropectin）:含硫酸根和羧基的强酸
性多糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象。
琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的 标准方法。
后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
• 银染色
– 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形 成稳定的复合物，然后用还原剂如甲 醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳 带染成黑褐色。
– 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色， 也用于琼脂糖凝胶染色。
– 灵敏度比EB高200倍，但银染色后， DNA不宜回收
– 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外 线激发下，发出桔红色荧光
– 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳 后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min
– EB染料有许多优点，如染色操作简便、快速，灵敏度高，10ng或 更少的DNA即可检出。
（注意：EB被认为是一种强致癌物质，操作时应尽量小心，配置和 使用EB时都应带上手套，且注意不要把EB洒到桌面或地板上。 ）
• 样品： DNA分子量标准品，质粒 • 试剂
– 琼脂糖 – 1×电泳缓冲液（TBE） – 6×上样缓冲液 – 溴化乙锭(EB) ：10mg/ml
上样缓冲液
• 0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯青；30％甘 油水溶液
• 作用： – ①增加样品密度，使其比重增加，以 确保DNA均匀沉入加样孔内 – ②在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置 – ③使样品呈色，使加样操作更方便
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
同组人员：黄梦秋 张如骐 肖重科
实验目的
• 掌握琼脂糖凝• DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为 分子筛效应。
• 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解 离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。
电泳指示剂：
• 核酸电泳常用的指示剂有两种 – 溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）； – 二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ），它携 带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁 移率比溴酚蓝慢
核酸电泳的染色剂
• 最常用的染色剂
– 溴化乙锭（ethidium bromide，EB）
3. 加样
• 将DNA样品（5ul）与6 × 上样缓冲液（1ul） 混匀后， 用微量加样枪小心加入样 品孔内。
– 注意加样枪的枪头不可插入 过深，以免刺穿凝胶，导致 样品外溢。
• 每加完一个样品要更换枪 头，以防止EB污染。
4. 电泳
• 接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切 记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的 一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极 之间的距离计算）
• 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下， 使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而 达到分离核酸片段检测其大小的目的。
• 核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核 酸片段所在的位置。
实验器材和试剂
• 实验器材： – 桥是平板电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透 射仪
(2)琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此 电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直 接用紫外监测及定量分析。
(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测 定。制成干膜可长期保存。
缺点：
1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳