实验三 主要树种花粉形态

实验三主要树种花粉形态、花粉贮藏及花粉生命力测定
（一）实验目的
通过本实验，掌握主要树种花粉的形态，花粉储藏及花粉生命力测定的方法及其原理。

（二）实验材料与药剂配制
供测定树种的花粉、硫酸、氯化钙、蔗糖、葡萄糖、蒸馏水、凡士林、乳酸、苯胺兰、联苯胺、α一苯酚、酒精、碳酸钠、过氧化氢、琼脂等。

染色剂的配制：A 配制1%苯胺蓝水溶液。

将1克苯胺蓝溶于100ml的蒸馏水中。

B 配制0.5%苯胺蓝乳酸酚。

先以一份酚溶解在一份蒸馏水内，然后加入甘油、乳酸各一份做成苯胺蓝乳酸酚。

固体培养基：10g的10%蔗糖（或者葡萄糖）+2克的2%琼脂+100ml 水加热至琼脂完全融化为止。

用纱布过滤冷凝就得出固体培养基。

液体培养液：以千分之一的硼酸代替蒸馏水，加5％葡萄糖，加热溶解，最好煮沸几分钟达到消毒目的即可。

（三）实验工具
载玻片，盖玻片，解剖针，毛笔，干燥器，小试管或指形管，脱脂棉，花粉筛，标签，玻璃铅笔、显微镜、冰箱、培养皿．悬滴载玻片。

（四）实验方法及步骤
1 树木花粉一般形态
（1）花粉壁：花粉有两层壁（内壁和外壁）。

外壁是角质化的，有几层组成，一般为三层，表面是光滑的或者呈波浪形（凸起或者凹下），有的还具有各种雕纹（纹饰）；内壁是果胶质的，花粉粒经过酸或碱处理后，内壁都被溶解掉，内壁是由透明的玻璃状物质组成的，
最易吸水膨胀。

（2）发芽沟：发芽沟是外壁上沟状的凹陷，上面蒙着一层薄膜。

花粉发芽时花粉管就从这些地方长出来。

发芽沟的数量对每种树木通常是一定的。

一般1~30个以上的范围内变化，被子植物、双子叶植物经常有3个发芽沟，裸子植物只有一个发芽沟。

（3）发芽孔：也是花粉管伸出的地方。

花粉发芽孔数量和形状对某些植物是一定的。

发芽孔往往分布在发芽沟里，并且排列顺序对每一种植物是一定的。

裸子植物中发芽孔很少见。

（4）气囊：裸子植物的某些树种的花粉带有气囊，实际上就是花粉外壁的外层的延长和伸展。

气囊一般有两个，有些树种或者还多于两个。

气囊一般分布在花粉两侧，近于球状或者半球状。

（5）花粉形状：不同树种区别很大，由长到园各种形状都有。

花粉形态特点与吸水膨胀的程度有关，干花粉一般是椭圆形，湿花粉一般是圆形或球形。

测量花粉的大小是按两个互相垂直的最短轴和最长轴进行，有气囊的花粉按三个向量（体长、体高、全长）进行测量。

2 常见树种花粉形态简介
（1) 油松（Pinus tabulaeformis）
松属的一种，本属花粉粒很高，由体和气囊组成。

属于这种类型花粉的树种有松属，冷杉属、云杉属等，因有气囊，飞行较远。

（2）落叶松属（Larix）
形状为圆形，直径为75μm~80μm，没有气囊、发芽沟和发芽孔，内壁比外壁厚，花粉较重，飞行近。

（3)中东杨(Populus berolinensis)
杨属的一种，形状为园形，外壁薄而光滑，或略有纹饰，无发芽沟和发芽孔，直径为
24μm~38μm 。

（4）爆竹柳（Salix bragilis）
柳属花粉为长圆形，柱轴（长轴）为8μm~32μm，赤道面观为窄椭圆形，柱面观为三裂圆形，具2~3个沟，花粉表面具显著的网状雕膜，花粉轮廓腺呈显著波浪形。

（5）胡桃揪(Juglans mandshrica)
属于胡桃属，花粉是扁球形，因为花粉外壁有一面是薄的缩到里面去了，吸水膨胀后这部分又鼓起来变成球形或呈多边形（因为在赤道面上有8~16个发芽孔），外壁厚，没有纹饰，直径24μm~50μm。

（6）白桦(Betula playphylla)
桦木属的一个种，花粉粒从侧面看为椭圆形，从柱面看为三角形或园形，发芽孔有3个、（多数3~4个），外壁很光滑，发芽孔周围加厚，直径为15μm~25μm。

3 实验观察
（1）在显微镜下观察六种花粉在干与湿条件下的片子，先在低倍镜下看，而后用高倍镜下看，从中了解六种花粉在干与湿条件下的颜色和形状。

（2) 在显微镜下鉴定混合后的花粉。

用解剖针撒少量混合后的花粉在载玻片上，盖上盖玻片观察，识别出所属的树种。

4．花粉贮藏
（1）原理：以人为创造的低温、干燥、黑暗等条件，迫使花粉减低代谢强度，以延长寿命。

（2）方法：将采来的花粉先进行干燥，可放在散射光下晾干，阴干或放入盛有氯化钙的干燥器中初步干燥，一般以花粉由相互粘结到极易分散为度。

然后将其分装在小试管中，一般以1／5体积为宜，瓶口用脱脂棉塞好（有利于气体交换和过滤作用），再在瓶外贴上
标签，在标签上注明树种、贮藏日期、贮藏方法及统一编号），然后放人不同浓度的硫酸或无水氯化钙控制湿度的干燥器中，最后把干燥器放在温度为0℃~4℃的冰箱中（对照条件是室内的自然温度、湿度及阳光）。

为了解其生活力的变化情况，可以每隔一定时间(10天、20天或一个月以要求精度而定）取出部分进行发芽试验，以确定其生命力，最后把结果编制成表3-2。

表3-1在0℃温度下，控制各种温度所需之硫酸的浓度
表3-2 各种储藏条件下花粉生活力保持情况统计表
（3）注意事项
①花粉采集后及时晾干，避免晾干
②始终保持用具清洁以避免菌类孢子混入，以致引起发霉而影响花粉的生命力。

③每次取用花粉动作要快，尽量不使正在贮藏过程的花粉受到温度的变化。

5 测定花粉生命力
有三类：直接法，间接法，染色法
（1）直接法
将花粉直接授在同种植株的雌蕊柱头上，并做好隔离工作，观察其雌花的发育。

如果胚珠能够正常的发育成种子，则说明该花粉具有生命力，否则，就没有生命力。

花粉在柱头上的发芽步骤是：
①将花粉直接授在清洁的（没有花粉的）同种另一植株花的柱头上，并做好隔离工作。

隔1d~3d采集已授过粉的柱头，固定于60℃温水中。

②染色制片。

将花柱固定于60℃温水中煮10-15min，而后放在1%苯胺蓝水溶液或0.5%苯胺蓝乳酸酚中染色24 h，把花柱取出放在载玻片上撕开，盖上盖玻片，用大拇指轻压，在显微镜下观察。

若花粉具有生命力，即可观察到花粉管深入到柱头组织（花粉管染成蓝色）。

若花粉不具有生命力，即无花粉管伸入柱头组织。

果实较大，发育期较长的树种，必须在树上授粉，而果实较小、发育期短的树种如杨、柳、榆等可在室内切枝上进行。

这种方法是可靠的，柱头本身就是花粉发芽的最合适条件，但不易测出发芽率，又由于这种方法所需时间特别长，所以不宜作为主要方法。

（2）间接法
该法有两种，一种是固体培养基法，另一种是悬滴法
固体培养基法：一般用于杨树、柳树、白桦、椴树、洋槐等。

①将固休培养基加热溶化；
②将载玻片擦干净，滴二滴培养基；
③将冷凝后用解剖针挑一点花粉抖落在上边；
④放在显微镜上观察是否均匀，一个视野50--100粒左右；
⑤将培养皿里滴上一些水，将准备好的载玻片小心放人，将培养皿盖养好后记住号码放人发芽箱或温箱中，温度18—20℃为宜；
⑥过8-24小时统计发芽率，共找五个视野，计算发芽与未发芽之花粉数，计算出百分数。

悬滴法：一般适于松、水曲柳、胡桃揪。

①将载玻片和培养皿用酒精擦拭消毒；
②待载玻片上之酒精蒸发干后，滴二滴5 %葡萄搪培养液于载玻片的二凹点上，
③,用解剖针挑少量花粉抖落在二液滴上（注意要分散且少)
④将载玻片小心翻转使液滴朝下；
⑤将载玻片放人培养皿内的二个小木棒上，随后往皿底注入少量蒸馏水（盖皿底即可）；
⑥盖好培养皿，记住号码，放人发芽箱或温箱中，其温度保持在25-27℃为宜，72小时后统计发芽率。

（3）染色法（生物化学方法）
这是借助于测定花粉内过氧化氢酶活性强弱来确定花粉生命力的方法。

在活的花粉内有过氧化氢酶存在，它可以促进过氧化物放氧分解，这些刚被放出的活性氧很容易使还原剂氧化。

在本实验中所用的无色的联苯胺和α-萘酚都是还原剂，但它们被氧化后却都呈现红色或玫瑰红色。

如果花粉是活的，那么这个反应很快，则花粉都被染成红色或玫瑰红色；如果花粉是死的，则这一反应迟迟不能进行，花粉也就保持原色。

①配制药液：
A、将0.20g联苯胺溶于l00ml 50％的洒精中，盛人褐色瓶中，置黑暗处；
B、将0.15g α-萘酚溶于100ml 50％的酒精中，盛人褐色瓶中，置黑暗处；，
C、将0.25g碳酸钠溶人l00ml蒸馏水中，盛人白色瓶中；，
D、以上三种溶液等量混合，即成“甲液”，盛入褐色瓶中，置黑暗处。

E、将3%过氧化氢，临用前用蒸馏水稀释成0.3％，即成“乙液”。

②制片：取少量花粉放在悬滴载玻片的凹点内，滴人一滴甲液，置片刻后，再滴人一滴0.3%的过氧化氢，三分钟后进行观察。

③统计发芽率：在显微镜下观察，凡表现红色或玫瑰色的，都是有生命力的花粉，黄色的（不着色的）为没有生命力的花粉
（五）作业
1．花粉生活力测定结果记载：
花粉名称实验时间：年月日
花粉收集方法
实验前花粉保存方法
显微镜倍数
表3-3 花粉发芽率测定结果记录表
2 分析花粉发芽率高或者低的原因
3 分析实验成败的原因
表3-4 蔗糖和葡萄糖不同溶液浓度称重计算表。