中药材鞣质含量测定

中药材中鞣质含量测定方法的研究与优化

摘要: 参照药典,采用磷钼钨酸 - 干酪素比色法 ,以没食子酸为对照测定五倍子、地榆药材中鞣质的含量。探讨药典中规定的条件合理性，并增加了超声条件优化了实验，平均加样回收率为 97.39 %。本法可快速、准确地用于中药材中鞣质的含量测定,并可作为鞣质提取工艺的优化方案。

关键词: 鞣质测定;波长；室温浸提；干酪素；没食子酸；超声鞣质又称单宁(Tannins) ,是一类复杂的具有沉淀蛋白质性质的水溶性多元酚类化合物 ,广泛存在于植物药材,如五倍子、贯众、儿茶等。近年来,对鞣质生理活性的研究方兴未艾。研究表明,鞣质能清除生物体内过剩的自由基,维护细胞膜的流动和蛋白质的构象 ,防止辐射诱发的 DNA断裂 ,从而在抑制脂质过氧化、心血管病、抗癌、抗突变、抗衰老、抗白内障等方面有独特功效。鞣质的经典含量测定方法有很多种 ,如重量法、容量法、比色法等。最常用的有皮粉法、高锰酸钾法、干酪素法、络合量法。皮粉法是国际公认的鞣质含量测定方法。皮粉的主要成分是蛋白质 ,鞣质可通过分子中的酚羟基与蛋白质的酰胺基形成氢键而结合成不溶于水的沉淀,以重量法测定含量。《中国药典》一部[1]鞣质含量测定法一直沿用皮粉法 ,适用范围广。缺点是耗用样品多,测定时间长 ,且没有选择性,测定结果偏高 ,而且皮粉用量很大。近年来,皮粉试剂的供应和质量都很难保证,使皮粉法的应用受到很大限制。《英国药典》2002 版[2]鞣质测定法附录采用的是磷钼钨酸 - 皮粉比色法,即利用鞣质在碱性溶液中将磷钼钨

酸还原产生深蓝色,其吸收度与含量成正比,采用比色法测定。其中,以焦性没食子酸为对照,测定总酚和不被皮粉吸附的酚,二者之差计为鞣质的含量。

罗文毓等报道了改进的干酪素法[3] ,其关键步骤是以干酪素代替皮粉,采用磷钼钨酸比色法测定; 药材样品提取采用浸泡过夜代替加热回流提取等。本文参照《英国药典》和干酪素法,重点对提取方法、显色剂、干酪素用量等进行了比较,提出了鞣质含量测定方法,为药典相关附录方法的修订提供了实验基础。《中国药典》[4]2015年版2202鞣质含量测定法已为没食子酸为对照，测定测定总酚和不被干酪素吸附的酚,二者之差计为鞣质的含量。并且同时进行干酪素吸附空白试验，计算时扣除空白值。实验为避光操作。[4] 本研究对中药主要的化学活性成分—鞣质提取工艺的优化，有利于地榆资源进一步的开发、利用，并为中药材有效成分的富集提供理论依据。并改进鞣质含量测定方法。

1 仪器与试剂

18系列紫外可见分光光度计【2007（C）北京普析通用仪器有限责任公司】; KQ-250B型超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）。钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、无水碳酸钠;磷酸、盐酸、干酪素、鞣酸（分析纯）; 焦性没食子酸、没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，经色谱分析，纯度>98％，) ;五倍子、地榆药材(购自中药材市场)。

2 实验方法探究

2．1 测定波长的选择探究

取对照品、总酚和不被吸附的多酚比色液 ,在 400～1000nm波长测定 ,结果三种比色液均在 760nm 具最大吸收。绘制不同波长总酚比色液吸收曲线和不被吸附的多酚比色液吸收曲线。

结果表明，确定测定鞣质含量最大吸收波长为 760nm。

2．2 供试品溶液制备方法的比较探究[5]

《英国药典》2000 版鞣质测定法药材供试液提取方法采用加热提取 ,罗文毓等报道,鞣质遇热不稳定,采用室温浸提过夜的方法操作简单,提取完全。本试验对加热和冷浸提取两种方法进行了比较。分别测定次数5次。冷浸过夜提取测定含量高于加热提取法,且操作较简单。

结果表明,测定鞣质含量供试品处理应采用室温浸提过夜的提取方法。

2．3 吸附剂的比较探究[5]

《英国药典》法采用皮粉作为吸附剂测定不被吸附的多酚类。参考文献[3]干酪素对鞣质的吸附更具专属性,即可选择性吸附有生理活性鞣质,而鞣酐等非活性鞣质则不被吸附,选择性较皮粉法高。以鞣酸为例,试验分别采用皮粉和干酪素为吸附剂 , 测定含量。结果皮粉法测定值为 81118 % ,干酪素法测定值为 62126 %。

结果表明,测定鞣质含量吸附剂应为干酪素。

2． 4 干酪素用量的比较探究

试验考察了干酪素的用量对测定五倍子鞣质含量结果的影响。干酪素用量的影响：干酪素不同用量时测定含量3次取其平均值，测得干酪素用量和对应测得的含平均值为下:0.15g-18.26%,0.30g-23.24%，0.45g- 32.72%, 0.60%g- 32.82% , 0.75g-32.62 % ,0.90g- 32.86% 结果表明 , 对于测定样品 , 三倍取样量的干酪素用量基本可吸附完全。试验使用干酪素 0.6 克。

[5]

结果表明,测定鞣质含量干酪素用量为0.6g。

2． 5 对照品的比较探究[5]

《英国药典》2000 版鞣质测定法附录采用焦性没食子酸为对照品,试验表明焦性没食子酸很不稳定,溶液在室温放置很快变色 ,必须新鲜配置使用。考虑到没食子酸具有相似的结构和显色行为 ,且已有含量测定用对照品,可以作为鞣质含量测定对照物质。实验比较了焦性没食子酸和没食子酸分别作为对照的测定情况。以鞣酸含量测定为例, 采用不同对照物比较测定结果: 以没食子酸对照, 测得含量平均值为 62.26 % ,以焦性没食子酸对照,测得含量平均值为45.45 %。以没食子酸对照 , 含量值较高。

结果表明,测定鞣质含量时对照品应采用没食子酸。

2. 6 超声辅助的优化比较探究[6]

2.6.1 单因素考察

2.6.1.1超声辅助提取的次数取干燥的地榆根粉末适量，加入15B/V 的60% C2H5OH，分别提取1、2、3、4、5 次，每次60 分钟。提取

物经测定吸光度，计算含量结果提取次数对的总鞣质的提取量有一定差异，但3、4、5 次差异不大，故而选定超声次数1、2、3 次作为正交试验考察的因素水平，进一步考察超声辅助提取次数对提取的影响。

2.6.1.2超声辅助提取的时间取干燥的地榆根粉末适量，加入15B/V 的60% C2H5OH 溶液，并依此超声提取20 分钟、40 分钟、60 分钟、80 分钟、100 分钟。提取物经测定吸光度，计算含量结果表明20 分钟到60 分钟提取量逐渐上升，故而选定45分钟，60 分钟，75 分钟作为正交实验考察的因素水平，进一步考察超声辅助提取的时间对提取的影响。

2.6.1.3溶剂浓度取干燥的地榆根粉末适量，分别加入15B/V的30% 、40% 、50% 、60% 、70% 、80% C2H5OH，超声提取60 分钟。提取物经测定吸光度，计算含量结果表明70% 、60%C2H5OH 提取结果最好，故而选定50%、60%、70% C2H5OH 溶液作为正交实验考察的因素水平，进一步考察溶剂浓度对提取的影响。

2.6.1.4溶剂用量取干燥的地榆根粉末适量，分别加入5、10、15、20、25、30B/V 的60%C2H5OH，超声提取60 分钟。提取物经测定吸光度，计算含量结果表明15B/V 的60% C2H5OH 提取结果最好，故而选择10、15、20B/V 的溶剂用量，作为正交实验考察的因素水平，进一步考察溶剂用量对提取的影响。

2.6.3 L9 （34）正交试验设计