果蝇的三点测交

2.实验材料
2.1实验材料
2.1.1试验材料
表型为红眼、长翅、直刚毛（+++）的野生型黑腹果蝇品系；
表型为白眼、短翅、焦刚毛（wmsn）的三隐性突变果蝇；
2.1.2实验器具
双筒体视显微镜一台；
解剖针两根，毛笔，眼科镊，培养瓶，麻醉瓶，透明塑料板，不干胶标签等。
2.1.3实验试剂
果蝇培养基（见附录），乙醚。
0
合计
294
100%
14%
30.3%
19.1%
表4三点试验中，重组值的计算
+++/msnw×+ + +/Y（♂个体记录）
表型
实得数
比例
重Βιβλιοθήκη Baidu发生在
m-sn
m-w
sn-w
+++
52
77.1%
msnw
12
msn+
3
9.6%
√
√
++w
5
m++
7
10.8%
√
√
+snw
2
m+w
1
2.4%
√
√
+sn+
1
合计
83
100%
性梳：果蝇胸足跗节共有5亚节。雄蝇第一对胸足跗节的第一亚节基部有一梳状黑色鬃毛结构，即为“性梳”。雌蝇没有性梳。
2.2.3实验步骤
第一周
①确定杂交组合：Xw，m，snXw，m，sn×XW,M,SNY(以下简化为msnw/msnw×+ + +/Y)
XW,M,SNXW,M,SN×Xw，m，snY(以下简化为+ + +/+ + +×msnw/Y)
此组实验偏差较大，虽然三个等位基因顺序判断正确，但基因间距偏差较大，尤其是sn-w间的重组值与标准值相去甚远，导致整个基因图距偏小。
4.讨论
4.1实验分析
与标准数据相对照，第一组数据较为准确；实验过程中没有出现培养基长霉或其他被污染的情况，说明实验过程中无菌操作较为到位；但在麻醉果蝇时，有放飞果蝇的情况发生，可能导致数据偏差，而且我们发现，虽然在统计F2代个体时可以把果蝇麻醉致死，但死亡的果蝇翅膀翘起，给区分大小翅带来困难，尤其是在观察雌果蝇时，由于雌果蝇体型较大，与体长比，长翅和小翅对比不如雄果蝇强烈。虽然有这些问题，但第一组实验整体上来说是成功的。
2.2实验方法
2.2.1实验材料准备
培养基的制备
计算所需培养基的各种成分，及培养瓶的数量，将培养瓶灭菌。按照果蝇培养基成分及配制过程依次加入各成分，搅拌均匀，分装，将培养基在室温下干燥1~2天，待其表面完全凝固后使用。
果蝇培养
果蝇的最适培养温度为25℃，培养基配制完成，并干燥1~2天后，即可接种。成蝇一般交配一两天后即开始产卵，受精卵24h内可孵化成幼虫，幼虫生活4天后开始化蛹，从蛹壳中羽化出来的果蝇8~12h后即可交配，所以7天左右即可产生新果蝇，在此时间内倒掉成蝇，收集处女蝇后，即可开始进行实验。
本次实验在实验设计上，没有完全遵循三点测交的方法，设计了第二组实验，通过F2中雄果蝇的性状来计算三对等位基因间的图距及顺序。并合理的安排好了实验进程，对于F2代，在接种后8天内做了两次统计，得到了大量的样本（第一组），在五周之内完成了实验，统计了实验数据，并做出自己的分析和判断。
4.2 注意事项
①处女蝇收集：处女蝇的收集十分重要，若亲本杂交时使用的不是处女蝇，则可能出现无法解释的杂交现象，影响实验结果。
3.结果
3.1实验结果记录
3.1.1 杂交组合:msnw/msnw×+++/Y和+++/+++×msnw/Y
3.1.2收集处女蝇时间：2011年10月18日 早7点
3.1.3亲本接种时间：11年10月18日；清除时间：2011年10月25日
3.1.4 F1表现型
表1 F1中表现型数量
亲本
数量
表型
msnw/msnw×+++/Y
+ + +/+ + +×msnw/Y
据测交后的表型推测F1配子类型
交换类型
♀
♂
+++
134
101
52
+++
未交换
msnw
67
12
msnw
未交换
msn+
18
3
msn+
单交换
+ + w
34
5
+ + w
单交换
m + +
24
7
m + +
单交换
+snw
13
2
+snw
单交换
m+w
4
1
m + w
双交换
+sn+
0
1
连锁图上显示的是基因在染色体上的理论位置及距离，而不是实际位置及距离。现在，人们可以利用放射性同位素标记的DNA分子探针对染色体进行原位杂交，用这种方法可以测定一个基因在染色体上的实际位置。
此次实验，我们利用三点测交法测定了果蝇X染色体上的三个基因：小翅（m）、焦刚毛（sn）和白眼（w）的相对位置，并针对这三个基因绘制了基因连锁图。通过这次试验，我们更深进一步了解了果蝇的杂交过程，提高了辨别雌雄果蝇的准确度，练习了果蝇麻醉和表型观察，也更加认识到了数学统计在遗传试验中的作用，对遗传学实验有了更深入的了解。
第二组：P:+ + +/+ + +×msnw/YF1：+ + +/msnw×+ + +/Y（♂个体记录）
此组实验与第一组略有不同，从定义上来说，此组实验并不属于三点测交，但由于雄果蝇Y染色体完全连锁，不发生任何交换，对于此组实验，只能通过F2中雄性个体来确定F1雌果蝇产生的配子中发生了怎样的交换（F2中雌果蝇表型都为野生型，所以在此仅记录了数量）。
由于测交比数可以直接反应配子的分离比数，所以子一代个体与隐性个体测交时，重组值（即指重组型配子占总配子的百分率）可以简易的求出。根据重组值，可进一步确定不同基因在染色体上的相对位置和排列顺序，这个过程即为基因定位。
此次实验，分别以三隐性个体和野生型个体为亲本进行正反交，通过三点测交法（即通过一次杂交和一次测交），同时确定了三对等位基因（小翅（m）、焦刚毛（sn）和白眼（w））的排列顺序和遗传距离，并分别计算了并发率。下面分别讨论。
第二组实验偏差较大，可能是以下几个原因引起的：①样本太小。进行三点测交实验数据越多越精确。由于杂交组合的安排，只能利用F2雄果蝇的性状来测定三对等位基因的基因顺序和图距，导致统计样本过小，造成偏差；②果蝇三隐性个体的生存力很弱，在幼虫密度较高时易在自然选择中被淘汰，在实验中此因素也有可能引起误差；③实验操作不熟练，在对果蝇进行麻醉时，有放走果蝇的情况发生，造成偏差；④对果蝇性状把握不到位，不能准确区分每一对相对性状，尤其是长翅和小翅，导致误差；⑤观察果蝇时会有一些较为幼小的成蝇，由于其体型较小，各种性状不易区分，给实验带来误差；⑥从F2雌雄果蝇的数量上来看，雌果蝇个体远多于雄果蝇，这是因为雌果蝇全为野生型，生活力强，与存在突变的雄果蝇竞争空间，导致雄果蝇个体数目较少，给实验带来误差。对于这一点，我们可以在以后的实验中将F1的亲本适当多接种，以扩大样本。
②收集三隐性突变体的处女蝇，收集的处女蝇单独存放，备用。
③按实验设计，在每个培养瓶中放入至少2对果蝇，接种完毕，贴好标签，注明杂交组合，实验日期，实验者等项目。在接种前几天应观察培养基是否发霉，如发现霉斑，应立即更换培养瓶
第二周
①7-8天后蛹变黑时，将上周接种的亲本蝇清除干净。
②配制足量培养基。
第三周
将麻醉的果蝇置于体视显微镜下，用小毛笔或解剖针轻轻的拨动观察。
把麻醉的果蝇移入一新培养瓶时，应将瓶横卧，用毛笔将果蝇挑入，苏醒后再将培养瓶竖起，以免果蝇粘在培养基上死亡。
雌雄果蝇的辨别
大小：雌体通常比雄体大
形态：雌体腹部稍尖，较宽厚呈卵圆形；雄体腹部钝圆，相对窄小呈柱状。
条纹：雌体腹部背面有宽窄相近的5条黑色条纹；雄体背部只有3条，上部两条窄，最后一条宽且延伸至腹部腹面，呈一明显黑斑。
果蝇的三点测交
摘要果蝇是遗传学实验中常用的模式生物，其生长周期短等诸多优点为遗传特性和基因定位的研究提供了很大便利。此次实验，首先学习并观察了雌雄果蝇的性状，练习区分雌雄果蝇，然后通过三点测交实验，学习了果蝇杂交的基本技术，最后运用生物统计的方法对实验数据进行分析，确定了雌果蝇X染色体上控制白眼、焦刚毛和小翅的三个基因间的相对位置。
1.引言
1903年，Sutton根据减数分裂过程中染色体的行为与孟德尔假设的因子（即基因）的行为平行这一事实，推断基因位于染色体上。同时他认为，这些基因在形成配子时将不能自由组合而是相互连锁。
Morgan等人的实验证实了这个推论，同时，他们发现，连锁不是绝对的，相互连锁的基因同样可以通过染色体交换发生重组，Morgan认为连锁强度与染色体上连锁基因的直线距离有关，距离越近，交换机会越少。
1913年，Morgan的学生Sturtevant按这个思路，以重组频率作为基因间的距离尺度，确定了当时已知的果蝇X染色体上几个基因的相对顺序与距离，绘制了遗传学史上第一张遗传学图——X染色体连锁图，并提出了基因在染色体线性排列的观点。
连锁图对遗传学研究及育种工作具有很高的参考价值。例如，借助连锁图，我们可以快速的分离或转移一些目标基因。目前果蝇、玉米等一些物种都绘制了连锁遗传图。
处女蝇的收集
由于从蛹壳中羽化出来的果蝇8~12h后即可交配，所以选择时间清除瓶中所有成蝇，之后8~12h内（8h更可靠）从瓶中收集幼蝇，收集的雌蝇即为处女蝇。
2.2.2实验技能练习
果蝇麻醉及观察方法
在麻醉瓶的塞子上滴几滴乙醚，将塞子塞上，一段时间后，使麻醉瓶中充满乙醚。轻拍培养瓶壁，让果蝇震落在培养基上。拔去麻醉瓶塞与培养瓶塞，迅速将培养瓶口倒扣在麻醉瓶口上。轻拍培养瓶让果蝇落入麻醉瓶中。把麻醉瓶中的果蝇拍落在瓶底。果蝇失去附壁能力，纷纷落入瓶底，麻醉即告完成。
在实验中我们还注意到以下现象：①三隐性个体的数量明显少于野生型，其原因是三隐性个体的生存力很弱，在幼虫密度较高时易在自然选择中被淘汰；②表型为m + w和+sn+的个体数量最小，甚至没有，这是双交换造成的，而由于双交换频率很低，可以直接判定sn是位于中间的；③本次实验第一组得出双交换频率为1.4%，而根据两个单交换频率17.7%和12.6%计算出来的理论上的双交换值为2.23%，课件实际双交换频率低于理论上双交换频率，可见每发生一次单交换时，它的临近也发生也发生一次交换的机会就要减少一些，这种现象称为干涉。一般用并发率来表示干涉的大小，计算并发率得0.63，则干涉为0.37。并发率越大，干涉越小。说明w或m的交换对对方是有影响的。
表5 各组并发率及干涉
组别
项目
第一组
第二组
双交换
1.4
2.4
并发率
0.63
1.5
干涉
0.37
——
干涉=1-并发率
3.2实验结果解释
位于同一条染色体上的基因较多的连在一起，这就是所谓的基因连锁。但连锁的基因也可以发生交换。在减数I前期，尤其是双线期，配对中的染色体不是简单的平行，而是在某些点上显出交叉，在交叉的部位，同源染色体非姊妹染色体间发生互换，使得原来位于同一染色体上的基因不再伴同遗传，这种现象就称为交换。而同源染色体非姐妹染色单体间的交换，直接导致了同源染色体间的基因重组。
+sn+
双交换
合计
294
101
83
3.1.8 F2个体重组值的计算
表3三点试验中，重组值的计算
+++/msnw×msnw/Y
表型
实得数
比例
重组发生在
m-sn
m-w
sn-w
+++
134
68.4%
msnw
67
msn+
18
17.7%
√
√
++w
34
m++
24
12.6%
√
√
+snw
13
m+w
4
1.4%
√
√
+sn+
第一组：P:msnw/msnw×+ + +/Y F1：+,+,+/msnw×msnw/y(♀个体记录)
此组实验获得果蝇较多，与标准数据相比较，实验较为准确的确定了三组等位基因的排列顺序和遗传距离。由于雄果蝇Y染色体完全连锁，不发生任何交换，所以通过F2个体的表型便可判断出相应雌配子中发生了怎样的交换。
①将孵化出的F1子蝇麻醉，观察翅形、刚毛形态、颜色等性状，并做记录。
②从F1中挑选至少2对，放入培养瓶中置于25℃下培养。
第四周
清除培养瓶中所有的F1亲本。
第五周
把F2全部麻醉致死，先按眼色和翅形将果蝇区分开，再用解剖镜检查果蝇刚毛形态，统计8种不同类型的果蝇数目，将结果记录在下表中，至少统计200~300只果蝇。所有观察统计结束后，将果蝇倒入水池或死蝇盛留器中。
+ + +/+ + +×msnw/Y
♀
♂
♀
♂
+++（野生型）
37
46
47
---（三隐性）
32
3.1.5 F1雌雄蝇接入培养瓶的时间：2011年11月1日
3.1.6 清除培养瓶中F1的时间：2011年11月8日
3.1.7 F2不同表现型个体观察记录
表2 F2表现型数量记录
亲本
F2代
数量
F2表型
msnw/msnw×+ + +/Y
13.2%
20.4%
12%
3.1.9连锁图绘制
第一组：P:msnw/msnw×+ + +/Y F1：+,+,+/msnw×msnw/y
第二组：P:+ + +/+ + +×msnw/Y + + +/msnw×+ + +/Y（♂个体记录）
标准：连锁图中查出的相对顺序与距离
3.1.10 各组并发率及干涉计算